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方法文章

光漂白后合子荧光恢复分析用于评估允许足月发育的染色质松散程度

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DOI：

10.3791/57068

⸱

2018年6月12日

 ,  ,  , 
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

本文内容

摘要

染色质松散程度似乎与卵裂球的发育潜能相关。然而，目前尚不清楚染色质松散程度是否可作为评估胚胎发育潜能的可靠指标。本文描述了一种实验体系，在该体系中，经染色质松散程度评估的受精卵能够发育至足月。

摘要

活体成像是一种强大的工具，可用于分析个体发育过程中的分子事件。最近研究表明，染色质的松散或开放状态参与了多能性胚胎干细胞的细胞分化潜能。先前有报道指出，与胚胎干细胞相比，受精卵具有极度松散的染色质结构，提示其可能与全能性相关。然而，迄今为止，这种极度松散/开放的染色质结构是否对胚胎发育潜能具有重要意义仍不清楚。在本研究中，为了验证这一假设，我们建立了一种实验体系，该体系允许经过光漂白后荧光恢复（FRAP）分析的受精卵发育至足月且无明显损伤。重要的是，该实验体系除了共聚焦激光扫描显微镜外，仅需一个恒温载物台加热器即可完成。本研究结果表明，光漂白后荧光恢复分析（FRAP）可用于探究受精卵染色质中的分子事件是否对胚胎的全程发育具有重要作用。

引言

受精后，染色质结构发生动态改变，最终建立起合子的染色质结构1,2在此期间，父源原核中的主要染色质蛋白由鱼精蛋白转变为组蛋白。所形成的染色质在多个方面与精子及雌性卵母细胞的染色质存在显著差异（例如组蛋白变体组成、组蛋白修饰）。因此，受精卵中形成的染色质被认为对后续胚胎发育具有重要意义。然而，尽管长期以来致力于揭示受精卵染色质结构的详细特征，但至今尚未建立通过分析单细胞期染色质结构来评估受精卵质量或预测其能否发育至足月的方法。

在先前的研究中发现，受精卵具有极度松散的染色质结构3。目前认为，染色质的松散性或开放性是胚胎干细胞（ES细胞）分化潜能的重要影响因素4。ES细胞在自然状态下并不具有均一性，而是呈现异质性；在ES细胞克隆中，部分细胞会短暂获得与二细胞期胚胎卵裂球相当的较高分化潜能。在此向二细胞样状态转变的过程中，ES细胞的染色质松散程度会转变为与二细胞期胚胎相似的状态5。因此，染色质的松散性似乎对细胞分化潜能至关重要，而受精卵中广泛开放的染色质结构可能有助于评估其发育潜能。

活体成像是一个强大的工具，可在个体发育过程中用于分析分子事件，因为该方法允许后续发育甚至全程发育6。作为活体成像方法之一，荧光漂白后恢复（FRAP）分析已被用于研究着床前胚胎和胚胎干细胞中的染色质松散程度3,4,5。如果能够通过FRAP分析在不影响全程发育的前提下评估受精卵染色质的松散程度，则该方法可能成为评估单细胞期胚胎质量的有力工具。然而，该实验方法对全程发育的影响尚未得到充分研究。最近，已建立了一种利用FRAP评估受精卵染色质松散程度的实验系统。由于这是一种针对受精卵的新型观测系统，因此被命名为受精卵FRAP（zFRAP）。研究表明，zFRAP不会显著影响全程发育7。本报告将详细描述该实验方法的操作流程。

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方案

本研究严格遵循山梨大学实验动物护理与使用指南中的建议进行。实验方案经山梨大学实验动物伦理委员会批准（许可编号：A24-50）。所有手术均在三溴乙醇麻醉下进行，并尽一切努力最大限度减少动物痛苦。操作流程和时间安排的图示分别见图1和表1。

1. 信使RNA的制备（体外 eGFP-H2B mRNA 的转录

  1. 线性化5 µg的pTOPO-eGFP-H2B模板DNA3,7 30 U的 不 我 在37 °C下50 µL中孵育过夜。
  2. 取1.5 µL消化后的DNA，通过电泳确认是否完全消化。
    1. 将1.5 µL和3–5 µL未消化的DNA分别与上样染料混合后加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。
      注意：若完全消化，可观察到一条单一片段（约 5 kb）。未消化的 DNA 用作对照 对照，在不同位置出现。
  3. 加入 151.5 µL ddH₂O2向剩余的消化后DNA中加入O和200 µL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。
    1. 用力涡旋振荡混合。
    2. 以最大速度离心15分钟。
  4. 回收上清液，然后加入 200 µL 氯仿。
    1. 用力涡旋振荡混合。
    2. 以最大速度离心15分钟。
  5. 回收上清液，然后加入 20 µL 3M 醋酸钠和 1.5 µL ethachinmate。
    1. 用力涡旋振荡混合。
    2. 加入550 µL的100%乙醇，然后通过涡旋剧烈混合。
    3. 以最大速度离心15分钟。
    4. 弃去上清液，然后用70%乙醇洗涤沉淀。
    5. 通过蒸发干燥沉淀物5至10分钟。
  6. 将沉淀的质粒DNA溶解于8 µL无核酸酶水中。
  7. 使用Nanodrop按照制造商说明书测定质粒浓度（预期浓度约为300 - 500 ng/µL）。
  8. 执行 体外 以1 µg纯化DNA为模板，在20 µL总反应体系中，按照制造商说明书进行编码eGFP-H2B的mRNA体外转录。
    1. 之后 体外 转录后，加入36 μL水，然后从56 μL合成的mRNA中回收1.5 µL，用于电泳分析（无需加poly A）。
  9. 按照制造商说明书，在100 µL反应体系中对合成的mRNA进行poly A加尾。
  10. 向eGFP-H2B的poly A加尾mRNA中加入60 µL氯化锂沉淀溶液，然后剧烈混匀。
    1. 在 -30 °C 下冷却 30 分钟。
    2. 以最大速度离心15分钟。
    3. 弃去上清液，然后用70%乙醇洗涤沉淀。
    4. 通过蒸发干燥沉淀物5 - 10分钟。
  11. 将沉淀物用 20 µL 无核酸酶水溶解，55 °C 加热 30 分钟。
  12. 使用Nanodrop测定沉淀mRNA的浓度。用无核酸酶水稀释至500 ng/µL，于-80 °C保存备用。
  13. 确认优选的mRNA产量；取1 µL带有或不带有poly A尾的mRNA（分别来自步骤1.8.1和1.12），与1.5 µL浓度为0.1 mg/mL的溴化乙锭及3 µL上样缓冲液混合，进行电泳分析。上样体积为5.5 µL。
    注意：如果加尾反应成功，应观察到与未加 poly A 尾的 mRNA 相比发生迁移的条带（图2A).

2. 输精管结扎雄性小鼠的制备

  1. 使用电子天平称量 8 - 12 月龄的 ICR 雄性小鼠体重。
  2. 向雄性小鼠腹腔注射 0.7 - 0.9 mL 的 1.2% 三溴乙醇麻醉剂。
    注意：麻醉剂用量取决于小鼠体型大小。例如，体重为 40 g 的小鼠需注射 0.8 mL 三溴乙醇麻醉剂。
  3. 用 70% 乙醇润湿腹腔区域。
  4. 在腹腔区域做一微小切口（3 - 5 mm），然后借助剪刀切开肌层。
    注意：手术开始前，剪刀和镊子应使用 70% 乙醇清洁。
  5. 用镊子夹住脂肪垫并轻轻拉出，随后可见睾丸和输精管。
    注意：vas deferens 为 U 形管道，带有红色血管。
  6. 使用手术缝线在 vas deferens 上两处结扎，然后剪除两结扎点之间的中段部分。
  7. 将脂肪垫和睾丸轻轻推回腹腔内。
    1. 对另一侧睾丸重复上述手术操作。
  8. 使用手术缝线缝合肌层，共缝两针。

3. 体外受精（IVF）

  1. 向8至10周龄雌性B6D2F1（BDF1）小鼠腹腔注射7.5 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG），间隔46至50小时后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
  2. 准备300 µL人输卵管液（HTF）液滴8 用于体外受精前1天的获能和受精的培养液，置于30 mm培养皿中，用矿物油覆盖液滴，于实验台上静置后，再在培养箱中过夜预孵育。
  3. 通过颈椎脱位法处死成年雄性ICR小鼠。用27号针头解剖分离尾部附睾并收集精子。将精子置于300 µL HTF培养基中，在38 °C条件下培养1–2小时以进行获能。
  4. hCG注射后16小时，通过颈椎脱位法处死超排卵的雌性小鼠。将输卵管壶腹部转移至HTF培养基旁的矿物油中，然后用30号针头将壶腹部中的卵丘细胞与卵母细胞复合体抽出，注入预先孵育的受精HTF培养基中。
    注意： 一些雌性小鼠即使经过超数排卵处理，也常常不表现出排卵。输卵管壶腹部肿大是排卵的标志。
  5. 获能后，将2-3 µL获能后的精子转移至用于收集排卵后卵母细胞的受精-HTF培养基中。
  6. 受精后1小时，收集受精卵，并在CZB中用100 µg/mL透明质酸酶处理10分钟9 培养基
    注意： 当授精操作得当，在授精后1 h，可观察到具有两个nd 观察到极体。如果使用较少或低质量的精子，则仅有少量受精卵形成并出现2nd 可观察到极体。此外，若使用过多精子进行受精，会导致多精入卵现象。适当的受精应产生具有雄性和雌性原核的合子。通过上述标准，可判断受精操作是否成功。
    1. 在CZB培养基中洗涤后，对含有第二极体的受精卵进行eGFP-H2B mRNA显微注射。

4. 注射室和显微注射毛细管的制备

  1. 使用无核酸酶水稀释编码 eGFP-H2B 的 RNA，使其浓度为 250 ng/µL。
  2. 在60 mm培养皿中准备2-3滴PVP-HTF和eGFP-H2B mRNA液滴，以及5-6滴Hepes缓冲的CZB（H-CZB）液滴，用矿物油覆盖这些液滴。
    注意：这些准备工作可在实验台上进行，无需使用层流气流柜。
  3. 使用显微拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃管（例如， P = 500，heat = 825，pull = 30，vel = 120，time = 200
  4. 用显微拉制仪在距离尖端约300 µm处，将移液管尖端折断后，将拉制的玻璃显微注射移液管尖端附近弯曲约30°。

5. 显微注射

  1. 关闭显微操作仪载物台上的载物片加热器，以防止在进行mRNA注射时因压电装置导致受精卵死亡。
  2. 用含10%聚乙烯吡咯烷酮的HEPES缓冲HTF（PVP-HTF）冲洗并包被注射针内壁。
  3. 收集受精的合子，使用2nd 极体图2B）并将20至25个受精卵转移至配备显微操作仪的显微镜载物台腔室中。
  4. 从尖端将稀释的 eGFP-H2B mRNA 填充至硼硅酸盐玻璃毛细管中。
  5. 用持卵管固定受精卵，然后使用压电驱动装置击破透明带和细胞质膜。
  6. 向受精卵的细胞质中注射约10 pL的mRNA。注射操作需在10分钟内完成，以避免受精卵在培养箱外长时间培养造成损伤。
    注意： 注射体积应尽可能大，达到2nd 极体。如果注射的mRNA量过大，可能导致游离的eGFP-H2B组分增加，从而影响可移动组分。
  7. 显微注射10分钟后，用至少3滴清洗液洗涤，然后将注射后的受精卵在CZB培养基中于38 °C培养，直至进行zFRAP分析。

6. zFRAP 分析

  1. 在进行zFRAP分析前1小时，打开共聚焦显微镜载物台上连接的激光器和加热板，将温度设置为38 °C。
  2. 将6–10 µL以矿物油覆盖的HEPES缓冲CZB培养基置于60 mm玻璃底培养皿中，并在加热装置上预热，直至收集受精卵。 
  3. 授精后8-12小时，收集5-10个表达eGFP-H2B的受精卵，转移至6-10 µL预热的HEPES缓冲CZB培养液滴中。
    注意：为避免在培养箱外长时间培养，每次分析使用5至10个表达eGFP-H2B的受精卵。5至10个受精卵可在1小时内完成分析。
  4. 根据制造商的说明设置漂白和成像条件。使用共聚焦激光扫描显微镜的情况材料表如下所示：
    1. 使用60X 油镜（60X 60X/1.35 油）
      注意：放大倍数更高（数值孔径更大）的物镜具有更高的灵敏度。
    2. 将扫描速度设置为 4.0 µs/像素，尺寸设置为 "512" 开启 "采集设置" (补充图1).
    3. 增加数字变焦倍数 "5" (补充图1).
      注意：需要更高的放大倍数才能判断是否发生焦漂。
    4. 打开染料列表（补充图1）然后选择 "EGFP". 将观察时间设为1.6 s（间隔设为 "自由运行" 设置）（补充图1)
      注意：增加观察时间点可能会获得更详细的数据，但也可能引起光毒性。在zFRAP分析中，1.6 s的观察时间足以检测染色质松散程度的亲代不对称性。
    5. 将图片总数设置为12张（补充图1).
    6. 开始 "刺激参数设置" 面板，然后单击 "主要" 使用 UseScanner，将扫描速度设置为 10.0 µs/像素。点击 "串联激活" 然后将 PreActivation 设置为 "3 帧" 以及激活时间作为 "5 秒" (补充图1).
    7. 点击 "聚焦 x 2" 并调整焦距，然后 "停止".
    8. 将漂白和成像激光功率（477 nm）分别调节至110 µW和15 µW "激光测距仪功率" (补充图1).
      注意：过强的漂白可能导致漂白区域过大，从而给定量分析带来困难。测量激光功率时，应使用功率计。为避免激光功率随时间衰减所造成的影响，确认激光功率非常重要。
    9. 点击 "夹子矩形" (补充图1) 在“刺激设置”面板中。将感兴趣区域（ROI；红色；ROI #1B）设置为 40 × 40 像素（7.6 µm）2）。使用参考区域（REF；绿色；ROI #2）和背景区域（BG；蓝色；ROI #3）进行准备 "复制感兴趣区域" 和 "粘贴 ROI" （使用鼠标的右键）
      注意：像素大小可通过以下方式设置 "ROI 管理器" 此时将鼠标光标置于感兴趣区域（ROI）上并单击鼠标右键即可调用。较大的感兴趣区域被认为更为理想，因其可标准化zFRAP评分的离散程度。然而，ROI过大则不适用于本分析，因其难以避免核仁前体结构（NPB）。该区域内的eGFP-H2B被认为未结合染色质，表现出显著更高的流动性。3ROI 和 REF 区域应尽可能分开。如果这两个区域距离过近，漂白效应可能也会影响 REF 区域。
    10. 点击 "活体" 在工具栏上，然后开始 "实时绘图" (补充图1).
      注意：实时曲线图显示每个 ROI 内的荧光信号强度，用于通过 HV 调整激光功率。请注意，若未选择 ROI，则实时曲线图面板上将无法检测到强度。
    11. 确定 ROI 位置
      注意：可通过拖动将 ROI 移动至原核内的目标位置。（1）务必避开核仁，（2）确保整个 ROI 位于核质内。ROI 不应包含核膜以外区域（即细胞质）。eGFP-H2B 的定位严格局限于核质内，因此可通过 eGFP-H2B 的荧光信号轻松判断 ROI 是否误包含细胞质。雄性原核通常比雌性原核更大，且常位于靠近 2 的位置nd 极体。在使用这些标准时，判断雄性或雌性原核。
    12. 点击 "聚焦 x 2" (补充图1）然后调节EGFP通道的高压电源表（HV power gage），使荧光强度达到约2000（荧光强度可在 "实时绘图" 窗口
  5. 点击 "时间" 然后 "XY" (补充图1) 以启动 zFRAP 分析。
    注意：如果 "时间" 按钮已适当选定， "t" 出现在 "XY" 按钮。
    1. 点击 "系列已完成" (补充图1），在FRAP成像附近出现 "XY 按钮" 然后获取经FRAP分析的数据。
    2. 保存文件 "2D 视图-图像 XXXXX" 作为首选的命名文件（oib 文件格式）由 "另存为" （也可使用 Ctrl + Shift + S）。
    3. 选择 ROI、REF 和 BG，然后单击（也可使用 Ctrl+A） "系列分析" 在 "2D 视图图像" 窗
    4. 获取行扫描 FRAP 数据，然后单击 "保存" 实时绘图窗口中的按钮。
      注意：行FRAP定量数据以csv文件格式保存。
  6. 作为无zFRAP对照，将部分注射了mRNA的受精卵置于玻璃底培养皿边缘附近的液滴中，以避免荧光观察带来的影响。

7. 数据计算

  1. 在使用所获得的定量数据时，绘制图表 "回收曲线" 和 "可移动组分" 由 Excel 完成，参见参考文献3,7 并作了一些修改（见下文及补充 Excel 文件）。
  2. 通过从每个时间点的12张图片中ROI和REF的值减去BG的值，计算相对强度。
  3. 将 ROI 的值除以 REF 的值，从而在每个时间点获得 12 个标准化的相对强度评分。
  4. 计算光漂白前拍摄的3张图像中ROI相对得分的平均值。
  5. 计算回收率。将每个时间点图像中 ROI 的 12 个获得的相对信号值（7.1.2 步骤获得）除以光漂白前相对信号值的平均值（7.1.3 步骤获得）。利用这些数值绘制回收曲线。图2E).
  6. 计算漂白速率。
    注：漂白率（%）= 100 - 4的恢复率th 图像。
  7. 使用以下公式计算移动分数（MF）10,11,12
    MF (%) = 12th 恢复率（终点时）- 4th 恢复率 / 漂白率 × 100

8. 胚胎移植

  1. 在胚胎移植前一晚，将8至12月龄性成熟的ICR雌鼠与结扎输精管的ICR雄鼠同笼过夜，以进行交配。
  2. 收集经过zFRAP分析并确定发育至二细胞阶段的胚胎。
  3. 在胚胎移植前，对雌鼠腹腔注射0.7–0.9 mL的1.2%三溴乙醇麻醉剂，或注射0.35–0.45 mL的混合麻醉剂（含medetomidine/midazolam/butorphanol，剂量分别为0.75/4/5 mg/kg）。
    注意：麻醉剂用量根据小鼠体重确定。三溴乙醇：按0.2 mL/10 g体重给药；medetomidine/midazolam/butorphanol混合剂：按0.1 mL/10 g体重给药。
    1. 将处于二细胞阶段的胚胎移植入假孕ICR雌鼠的输卵管中，该雌鼠于交配后0.5天（dpc）已见阴道栓。
    2. 胚胎移植后，将雌鼠置于设定为37 °C的加热板上，直至其苏醒。
  4. 在18.5 dpc时，通过颈椎脱臼法处死代孕母鼠，并通过剖宫产取出来源于经zFRAP分析的受精卵的仔鼠。部分取出的仔鼠交由代乳母鼠哺育，并每周评估其体重。

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结果

使用 eGFP-H2B 进行 zFRAP 分析

正确制备的编码eGFP-H2B的mRNA，表现为因poly A加尾而产生的条带迁移图 2A)，在受精后1-3小时，被注射到带有第二极体的受精卵细胞质中（图2B）。授精后8至12小时，收集具有2个原核并表达eGFP-H2B的受精卵，进行zFRAP分析（图 2C）。FRAP 分析包括漂白和恢复两个步骤。在漂白前阶段，可观察到 eGFP-H2B 的信号（图 2D-1），但一旦发生漂白，信号便下降至可忽略的水平（图2D-2）。若漂白成功，漂白后不久即可观察到...

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讨论

本研究显示，zFRAP 分析不会对胚胎的足月发育造成严重损伤，表明该方法是揭示分子事件与胚胎发育潜能之间关联的一种非常有用的工具。在胚胎干细胞重编程为类二细胞状态的过程中，这些细胞的分化潜能可达到与二细胞期胚胎相当的水平，同时其染色质松散程度也转变为与二细胞期胚胎相似的状态5。因此，受精卵中染色质的松散程度可能对胚胎发育潜能具有重要意义。体细胞核移植至卵母细胞胞质后，其细胞核的染色质松散程度不仅低于父源原核，也低于母源原核，提示体细胞核移植受精卵未能获得开放的染色质结构，这可能与其发育潜能低下有关。综上所述，zFRAP 分析似乎有助于阐明基因组重编程的机制。

zFRAP 系统可能有助于筛选出具有高发育潜能的受精卵。在初步研究中，除了体细胞核移植（SCNT）外，还发现由圆头精子细胞注射（ROSI）产生的受精卵存在染色质异常松散的现象。此外，研究发现其中部分受精卵的染色质松散程度与体外受精（IVF）来源的受精卵相当，提示这些受精卵具有较高的发育潜能。重要的是，通过 zFRAP 评估染色质松散程度的受精卵能够发育至足月。因此，未来或许可以通...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢岸上智、若山纱也加、长友博明、上村智、岸田佳奈提供的宝贵意见和技术支持。本工作部分由文部科学省推动国立大学改革项目资助给M.O.；日本促进科学基金（16H02593）、浅田科学基金会以及武田科学基金会资助给T.W.。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦激光扫描显微镜OlympusFV1200FV1000 也可用于 FRAP 分析（参考文献 #7）
加热载物台Tokai HitTP-110RH26
倒置显微镜OlympusIX71
显微操作器NarishigeMMO-202ND
压电微操作器Prime techPMAS-CT150
35 mm 培养皿Falcom35100835 × 100 mm 规格；用于体外受精（IVF）
60 mm 培养皿Falcom35100760 × 15 mm 规格；用于胚胎培养
50 mm 培养皿Falcom35100650 × 9 mm 规格；用于显微操作台上的操作
50 mm 玻璃底培养皿MatsunamiD91040050 mm 培养皿，27 mm φ 孔径；用于 FRAP 分析
矿物油Organic spceiality chemicals625071用于玻璃底培养皿上的 FRAP 分析
矿物油SigmaM8410-1L用于体外受精和胚胎培养
玻璃毛细管Drummond1-000-1000用于小鼠受精卵的操作
硼硅酸盐玻璃Prime techB100-75-10-PT用于 mRNA 显微注射
微量移液器拉制仪Sutter instrumentP-97/IVF用于制备注射针或持卵针（外径：80 µm，内径：10 µm） 
显微针具成型仪 NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 转录试剂盒Thermo
Fisher scientific		AM1340
多聚(A)尾添加试剂盒Thermo
Fisher scientific		AM1350
10% PVP 溶液（PVP-HTF）IrvineSceientific99311含 10% PVP 的 HEPES 缓冲 HTF
HEPES 钠盐SigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BeGFP-H2B mRNA 的模板质粒（参考文献 #6）
NorthernMax Gly 样品上样染料 Thermo
Fisher scientific		AM8551用于体外转录 mRNA 的电泳
苯酚-氯仿-异戊醇nacalai tesque25970-14
氯仿nacalai tesque 08401-65
Not ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 光功率计Hioki3664 用于测量激光功率
体视显微镜OlympusSZX16

参考文献

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