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方法文章

开发用于治疗慢性疼痛的重组蛋白

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DOI：

10.3791/57071

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2018年4月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

本文内容

摘要

本文中，我们提供了IL4-10重组融合蛋白的制备方法及质量控制的详细步骤。同时，我们还展示了如何在炎症性疼痛的小鼠模型中检测该蛋白缓解疼痛的效果。

摘要

慢性疼痛难以治疗，迫切需要新的方法来缓解持续性疼痛。由于抗炎性细胞因子能够调节异常的神经-免疫相互作用，因此在治疗致残性疼痛疾病方面具有广阔的应用前景。然而，从生理学角度来看，它们通常在多种细胞因子构成的网络中发挥作用，因此作为单一药物使用时，其治疗效果可能并非最佳。为了克服这一局限性，我们开发了一种由抗炎性细胞因子IL4和IL10组成的融合蛋白。本文描述了IL4-10重组融合蛋白的制备及质量控制方法，并在持续性炎症性疼痛的小鼠模型中检测了该融合蛋白缓解疼痛的效果。

引言

慢性疼痛仍是21世纪最致残且治疗不足的医学问题之一，影响着>20%的成年人群1,2。然而，用于缓解慢性疼痛的治疗方法常常无效，或因严重副作用而不得不中止使用3。重要的是，目前可用的药物仅能提供症状缓解，却无法显著改变或治愈慢性疼痛。尽管慢性疼痛表现为一种神经系统疾病，但有证据表明免疫系统参与了慢性疼痛的发生发展4,5。此外，基于免疫的镇痛策略正在兴起。例如，抗炎性细胞因子在多种慢性疼痛模型中均能抑制疼痛6,7,8。然而，抗炎性细胞因子半衰期较短，限制了其潜在的镇痛效果。此外，抗炎性细胞因子在协同作用时效果最佳。为克服这些局限，我们近期将两种抗炎性细胞因子白细胞介素-4（IL4）和白细胞介素-10（IL10）融合为一个分子。与单独使用的细胞因子相比，IL4-10融合蛋白在抑制慢性炎症性疼痛和神经病理性疼痛方面表现出更优的疗效9。本文将介绍此类融合蛋白的制备、纯化方法及其质量控制手段。

IL4-10 融合蛋白通过将携带编码 IL4-10 融合蛋白 cDNA 序列的 pUPE 表达载体瞬时转染 HEK293-F 细胞，在人源细胞中进行生产。选择 HEK293-F 细胞是为了实现蛋白的翻译后修饰，而此类修饰在细菌表达系统中无法发生。为优化糖链末端的唾液酸化修饰，表达载体中同时引入编码 β-半乳糖苷-2,3-唾液酸转移酶的 cDNA 作为第二转录单元。由于亲和蛋白纯化法对培养上清液中目标蛋白的富集能力优于其他纯化方法，因此采用该方法对融合蛋白进行纯化。 例如 尺寸排阻或离子交换色谱10,11为纯化IL4-10融合蛋白，我们使用了自制的抗IL4单克隆抗体。纯化后IL4-10融合蛋白的纯度和生物活性评估作为质量控制的一部分进行。各生产批次的纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高压尺寸排阻色谱（HP-SEC）进行评估。IL4-10融合蛋白的生物活性通过检测其在全血培养中抑制脂多糖（LPS）诱导的肿瘤坏死因子-α（TNFα）产生的能力，并与单独细胞因子组合的效果进行比较来评估。

最后，为了检测IL4-10融合蛋白抑制慢性疼痛的能力，我们描述了如何在广泛使用的小鼠持续性炎症性疼痛模型中测试该融合蛋白的镇痛效果12,13,14。本文介绍了炎症性疼痛模型的方法，但需要注意的是，根据具体研究问题的不同，也可采用其他疼痛模型（例如，神经病理性疼痛模型）。在这些模型中评估疼痛时，应使用多种行为学检测方法，包括诱发性疼痛和非诱发性疼痛的测量指标。本文描述了机械性和热诱发行为反应变化的评估方法。无害性刺激引起的机械敏感性通过Von Frey试验进行评估，而热敏感性则通过Hargreaves试验进行评估。重要的是，非诱发性痛觉过敏/异常性疼痛通过动态负重（Dynamic Weight Bearing）试验进行测量。这些指标被广泛接受为疼痛评估方法，可提供有关动物痛阈及潜在疼痛体验的重要信息15,16,17。其他用于评估非诱发性疼痛（例如，与刺激无关的疼痛）的方法，如条件性位置偏好试验，也可能具有重要价值18。为了评估药物抑制疼痛的潜力，我们采用鞘内给药方式注射该融合蛋白，因为该给药途径所需蛋白剂量较小，即可作用于与疼痛相关的区域，并避免全身性（不良）反应19,20。

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方案

所有动物实验均按照国际指南进行，并获得当地实验伦理委员会的预先批准。全血来自荷兰乌得勒支大学医学中心（UMCU）的迷你供体服务（Mini Donor Dienst, MDD）。MDD 针对方案编号 07-125/C 已获得乌得勒支大学医学中心医学伦理委员会（Medisch Ethische Toetscommissie）的积极批准。

1. 蛋白质的生产与表征

  1. 细胞培养
    注意：培养基的使用请参见材料表。
    1. 在37 °C下解冻HEK293-F细胞，直至仅剩一小块冰。立即将解冻后的细胞转移至10 mL冰上预冷的培养基（4 °C），并在室温（RT）下以500 × g离心4分钟（min）。
    2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL室温新鲜培养基中，随后在500 × g下离心4 min。
    3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL室温培养基中。直接将细胞悬液加入含有25 mL预热培养基（37 °C）的125 mL锥形瓶中。将细胞在37 °C、8% CO2、95%湿度条件下，置于转速为125 rpm的摇床上进行培养。
    4. 每周传代两次。使用自动细胞计数仪（参见材料表）测定细胞数量和细胞活力。以3 × 105 个细胞/mL的浓度将活细胞接种至锥形烧瓶中。始终将培养基总体积维持在锥形培养烧瓶总容积的1/5，以保证最佳通气条件。
  2. 转染
    注意：转染前需将细胞传代3至4次，并在细胞活力>90%时进行转染。细胞活力通过基于细胞膜完整性的自动（电场多通道）细胞计数系统测定。转染试剂请参见材料表。
    1. 在室温下以500 × g离心细胞4 min；将细胞沉淀重悬于10 mL预热培养基（37 °C）中，并将细胞悬液稀释至总体积1 L，终浓度约为1.0 × 106 个细胞/mL。将细胞悬液分装至5个500 mL锥形瓶中，每瓶100 mL。
    2. 将1 mg质粒DNA溶于33 mL低血清最低必需培养基（MEM，参见材料表）中，轻轻混匀。另取一管，将1,330 µL转染试剂溶于MEM中并轻轻混匀。两种溶液均在室温下孵育5 min。将MEM稀释的DNA加入含转染试剂的MEM溶液中，混匀后在室温下继续孵育30 min。
    3. 将DNA-转染试剂混合物加入细胞（第1节中培养的细胞）；向每个含有100 mL细胞悬液的500 mL锥形瓶中加入6.6 mL混合物。维持前述培养条件。转染后第三天收集含有分泌型IL4-10融合蛋白的培养上清液。
    4. 按照制造商说明书（参见材料表）进行IL10 ELISA，测定培养上清液中IL4-10融合蛋白的浓度。
      注意：在最佳培养条件下，融合蛋白浓度预计为2.5至5 µg/mL。
  3. 亲和层析纯化蛋白
    注意：亲和层析在室温下进行。但所有组分（培养上清液、上样液、穿流液及洗脱液）在操作过程中均需置于冰上。
    1. 根据制造商说明书（参见材料表），将10 mg自研抗IL4单克隆抗体偶联至1 g CNBr活化琼脂糖4B上。将2.5 mL偶联后的琼脂糖珠缓慢倒入玻璃层析柱中（柱长30 cm，内径1.5 cm，参见材料表）。
    2. 通过层析柱加入含1%牛血清白蛋白的50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以封闭珠子上剩余的结合位点。随后用25 mL PBS（pH = 7.4）洗涤层析柱，再用12.5 mL 0.1 M甘氨酸缓冲液（pH = 2.5）洗涤，最后再用25 mL PBS（pH = 7.4）平衡。
    3. 以1 mL/min流速将100 mL经10倍浓缩的HEK293细胞培养上清液过柱。用50 mL PBS洗涤层析柱。
    4. 以1 mL/min流速用12.5 mL 0.1 M甘氨酸缓冲液（pH = 2.5）洗脱结合的IL4-10融合蛋白，收集2.5 mL/管的洗脱组分。向每管中加入350 µL 1 M Tris缓冲液（pH = 9），调节pH至7。将中和后的组分在2 L PBS（pH = 7.4）中透析过夜。
      1. 使用干态直径16 mm、截留分子量3.5 K的透析袋。使用孔径0.45 µm的一次性滤器对透析后的样品进行无菌过滤。将无菌的IL4-10融合蛋白溶液分装后于-80 °C保存。
    5. 通过考马斯亮蓝染色的12% SDS-PAGE凝胶及高效尺寸排阻色谱（HP-SEC，3 µm SEC-2000柱）评估洗脱所得IL4-10融合蛋白的纯度。HP-SEC分析时，上样40 µL浓度约为1 mg/mL的蛋白样品。流动相为含150 mM氯化钠的100 mM磷酸钠缓冲液（pH = 6.8），流速设为1 mL/min。
    6. 根据制造商说明书，采用IL10 ELISA和双辛可宁酸蛋白定量法（BCA蛋白定量试剂盒，参见材料表）测定每批纯化IL4-10融合蛋白的浓度。
    7. 使用重组人IL10在ELISA实验中建立标准曲线。为校正重组IL10（18 kDa）与IL4-10融合蛋白（34 kDa）之间的分子量差异，将测得浓度乘以1.8的校正因子。
  4. IL4-10融合蛋白的生物活性
    注意：每批制备的IL4-10融合蛋白均需进行全血实验，以比较不同批次的活性，作为质量控制的一部分。全血实验使用当天采集于肝素抗凝管中的新鲜人血。血液来自本单位献血服务项目的健康志愿者。所有样本应视为潜在生物危害物进行处理。
    1. 将纯化的IL4-10融合蛋白在RPMI培养基（参见材料表）中进行3倍系列预稀释，浓度范围为5 – 1,215 ng/mL。
    2. 将LPS预稀释至100 ng/mL，并将人血用RPMI培养基稀释4倍。
    3. 将IL4-10融合蛋白、LPS和人血的预稀释液加入48孔板中。每孔加入50 µL IL4-10融合蛋白（终浓度1 – 243 ng/mL）、75 µL RPMI培养基、25 µL LPS（终浓度10 ng/mL）和100 µL人血（终末稀释状态）。
      注意：每孔总体积为250 µL。
    4. 将培养板置于37 °C、8% CO2、95%湿度条件下孵育18小时（h）。
    5. 根据制造商说明书，采用TNFα ELISA检测培养上清液中TNFα的浓度。
    6. 根据以下公式计算IL4-10融合蛋白对炎症反应的抑制率：% 抑制率 = (1 - (A - B)/(C - B)) × 100
      注意：其中A = 经IL4-10融合蛋白处理的LPS刺激培养物中的TNFα水平，B = 未刺激培养物中的TNFα水平，C = LPS刺激培养物中的TNFα水平。

2. 持续性炎症性疼痛的小鼠模型

注意：必须同时使用雄性和雌性小鼠（C57Bl/6），以便识别性别依赖性效应。通常使用的小鼠年龄在8至16周之间。为确定所需的动物数量，应进行功效计算。可在互联网上轻松找到用于此类计算的基于网页的工具。例如，http://www.powerandsamplesize.com；http://www.sample-size.net）

  1. 慢性炎症性疼痛的诱导
    注意：通过向成年小鼠足底皮下注射角叉菜胶或完全弗氏佐剂（CFA）以诱导持续性炎症性疼痛。 不同测试之间互不干扰。
    1. 配制2%（w/v）角叉菜胶溶液：将λ-角叉菜胶（见材料表）溶于0.9% NaCl溶液中，并通过23号针头反复吹打，确保充分溶解。在注射前即刻新鲜配制该溶液。
    2. 若使用CFA，则在注射前需充分混匀CFA溶液，因其为油包水乳剂，含有1 mg经加热灭活并干燥的结核分枝杆菌（H37Ra）、0.85 mL石蜡油和0.15 mL单油酸甘露醇酯（见材料表）。
      注意：建议使用带有金属推杆的玻璃汉密尔顿注射器注射该化合物，因为橡胶推杆可能与佐剂中的油成分发生反应。
    3. 足底皮下注射
      1. 注射前，将待注射物（步骤2.1.1或2.1.2制备）置于室温环境中至少15分钟，使其温度平衡至室温。使用30号针头，向未麻醉小鼠的后肢足底皮下注射20 µL待注射物（或溶剂作为对照）。
      2. 将针头从足趾基部刺入，朝向足跟方向推进，当针头插入约0.5 cm时进行注射。注射完成后，一边缓慢拔出针头，一边轻微旋转注射器，以防止溶液从注射部位渗漏。

3. 疼痛测量

注意：进行行为学实验的研究人员必须对小鼠的处理分组保持盲法。在进行任何测量之前，必须让动物充分适应测试环境。建议在开始实验前的一周内，将动物在用于测试的各种设备中分别放置 1 - 2 次，每次 15 - 30 分钟。当在同一实验中同时处理雄性和雌性动物时，应分别对雄性和雌性进行评估。不同组别之间需彻底清洁笼具和实验表面，以避免对不同性别的动物行为产生潜在的干扰效应。在足底注射任何化合物之前，应重复测量基础痛阈或机械阈值两到三次，以准确确定基础阈值并确认其是否稳定。

  1. 冯·弗雷试验：对无害性机械刺激的敏感性检测
    1. 将动物单独放入置于金属网架上的亚克力笼中，测量前让小鼠适应环境至少15分钟。
    2. 通过使用一系列校准过的冯·弗雷纤毛（范围从0.02至4克）测定动物足爪回缩阈值，以评估机械敏感性。任何足爪避开施加纤毛的动作均视为阳性回缩反应。将纤毛垂直施加于足底表面，施加足够力度使其轻微弯曲并接触皮肤，持续约3秒。确保在施加过程中纤毛不发生扭转。
    3. 采用上下法计算50%足爪回缩阈值15,21。
      注：起始使用的纤毛为0.4克（可根据小鼠基线时的表现选择其他起始纤毛）。若对某根纤毛无反应，则下一次刺激使用更粗的纤毛；若出现阳性反应，则使用更细的纤毛。刺激次数由首次出现差异反应时决定；此后继续进行5次刺激。根据先前描述的方法计算50%阈值15,21。
  2. 热敏感性：哈格雷夫斯试验
    1. 将动物单独放入置于预热（30 °C）玻璃板上的笼中，测量前让小鼠适应至少15分钟，直至动物安静静坐。
    2. 使用哈格雷夫斯装置（见材料表）通过聚焦可见光束加热动物足爪，测定热刺激回缩潜伏期。
      注：光束强度设定为12%，因为在此实验确定的强度下，C57Bl/6小鼠在基线时的平均回缩反应时间为8秒。光束强度应根据具体仪器型号和小鼠品系进行优化。设定最大截止时间为20秒或更长，以避免动物受伤。
    3. 每只动物测量约4次回缩潜伏期，取所有测量值的平均值。每只足爪独立测量，同一足爪连续测量之间至少间隔1分钟。
  3. 姿势功能缺陷：动态承重试验
    1. 试验前测量每只动物的体重，因为承重分析需要将每只动物的体重作为输入参数。
    2. 将动物单独放入配备仪器化地面的动态承重系统中，该系统上方设有支撑架固定摄像头以记录小鼠运动。让动物适应0.5至1分钟，随后连续记录5分钟。
      注：本试验每次仅能评估一只自由活动的动物。
    3. 调整参数设置以进行承重测量并分析数据。
      注：本实验中使用以下参数：（i）低重量阈值0.6克：即激活传感器任一单元所需的最小重量；（ii）高重量阈值1克：即完全激活一个单元所需的重量；（iii）面积阈值2个单元：表示需同时激活的相邻单元数量；（iv）最小图像帧数为5帧：每帧采集耗时0.1秒。该数值表示小鼠保持静止的最少帧数，即小鼠姿势需稳定超过>0.5秒，所得测量值方可用于分析。
    4. 通过回放视频进行数据分析，并确认软件在指定时间帧中正确识别每只肢体。
      注：需至少验证1分钟的记录时间。动态承重软件将计算并提供以下参数：（i）每只足爪所承受的重量（克）及其占总体重的百分比；（ii）前肢联合或后肢联合所承受的重量（克）及其占总体重的百分比；（iii）左右足爪承重比或前后肢承重比；（iv）每只足爪或前后肢联合激活压力感应板的接触面积；（v）各参数的均值及标准差；（vi）整个实验过程中不同姿势（直立、三足支撑、四足支撑）的持续时间；（vii）每只足爪在整个实验中承重的总时间（秒）。

4. 用于镇痛的白细胞介素4-10融合蛋白鞘内注射

注意：确认房间通风已打开，以确保适当的空气流通。为测试IL4-10融合蛋白（每只小鼠1 µg；总注射体积5 µL）的效果，应将其与载体注射以及单独细胞因子组合注射（IL4 + IL10，每只小鼠0.5 µg + 0.5 µg，总注射体积5 µL）进行对比测试。

  1. 在诱导室中使用3 - 4%异氟烷，以2 L/min的氧气流速对小鼠进行麻醉。通过夹捏小鼠足爪检查其是否充分麻醉，确保小鼠无反应。
  2. 将小鼠置于操作台上，头部放入仪器的鼻罩中，在进行鞘内注射时以1.5 - 2%异氟烷、2 L/min氧气流速维持麻醉状态。
  3. 将待注射化合物回填至一支洁净的25 µL玻璃Hamilton注射器中，该注射器连接27号针头。
  4. 牢固握住小鼠肋骨后方的脊柱部位并轻微提起。将针头垂直插入腰椎L5与L6椎骨之间，小心穿过皮肤，准确位于腰椎中线位置，并将针头置入椎间隙。
    ​注意：寻找椎间隙可能需要沿头腹侧方向轻微移动针头，轻压直至感受到骨组织阻力突然消失，即为进入椎间隙的征象。
    1. 通过观察是否出现尾巴抽动来确认针头位置正确。缓慢注入5 µL化合物，等待数秒后，再缓慢撤出针头。若仅观察到单侧足爪抽动，则提示针头位置可能不正确。
  5. 注射后，密切观察小鼠从麻醉恢复后的前30分钟，确保无运动功能障碍或瘫痪现象。
    注意：疼痛相关行为可在恢复后15分钟开始检测（如第3节所述）。

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结果

亲和层析纯化过程中获得的不同组分的SDS-PAGE凝胶代表性图像如图1A所示。在上样（L）和穿流（FT）组分中，可观察到HEK293上清液中存在的所有蛋白质。在洗涤（W）组分中未观察到蛋白质。在洗脱（E）组分中，观察到分子量分别为35和37 kDa的两条条带，对应于IL4-10融合蛋白的两种不同糖基化形式（箭头所示）。图1B展示了两种不同批次IL4-10融合蛋白在全血实验中的代表性效价检测结果。结果显示，IL4-10融合蛋白可剂量依赖性地抑制LPS诱导的TNFα释放，表明两个批次的IL4-10融合蛋白具有相似的生物活性。

接下来展示一个代表性实验的测试结果示例，用于验证IL4-10融合蛋白是否可抑制持续性炎症性疼痛（图2

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讨论

本文描述了重组IL4-10融合蛋白的制备与表征方法，以及在持续性炎症性疼痛小鼠模型中检测其抑制炎症性痛觉过敏功效的方法。IL4-10融合蛋白的制备与纯化在小规模条件下进行。选择HEK293细胞作为蛋白表达系统，因其能够实现原核表达系统无法完成的翻译后修饰。翻译后修饰与蛋白功能密切相关，缺乏此类修饰可能影响IL4-10融合蛋白的治疗效果。该蛋白通过亲和层析从细胞培养上清中纯化获得。我们选择使用实验室自制的抗IL4单克隆抗体进行亲和纯化，而非构建带有亲和标签的IL4-10融合蛋白以利用标签系统进行纯化。此举旨在避免标签可能引起的蛋白折叠或功能改变。然而，若缺乏高特异性的单克隆抗体，则需开发带标签的蛋白。 例如 一个His标签。在这种情况下，重要的是确定蛋白质的C端或N端哪一个更适合添加该标签，以避免影响蛋白质功能。

从1 L HEK293上清液中可获得约3 mg纯化的IL4-10融合蛋白，但产量可能因批次而异。亲和纯化柱在弃用前可重复用于多个纯化周期。纯化过程中最敏感的步骤是通过低pH洗脱柱上的IL4-10融合蛋白，因为低pH可能引起蛋白质不可逆变性及沉淀。因此，维持...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作的部分经费来自乌得勒支大学生命科学基金

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FreeStyle 293-F 细胞InvitrogenR790-07人胚胎肾细胞 
GIBCO FreeStyle 293 表达培养基Life technologies12338018培养基
293fectin 转染试剂Invitrogen12347019转染试剂
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAXLife technologies51985026阳离子脂质转染过程中使用的低血清培养基 
GIBCO RPMI 1640 培养基 (1x)Life technologies52400-025
CNBr-活化 Sepharose 4BGE Healthcare17-0430-01用于偶联抗体或其他大分子蛋白的预活化介质
37% 盐酸熏蒸液 Merck1003171000
氯化钠SigmaS7653-1kg
碳酸氢钠 Sigma31437
Trizma 盐酸盐SigmaT3253-500GTRIS 盐酸盐 
100% 乙酸                               Merck1.00063.1000 
Glycin-HCl                                          SigmaG2879             
PBS                                                    Pharmacie, UMCU磷酸盐缓冲液
10X TGSBIO-RAD161-0772用于 SDS 电泳的 Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液
Mini-PROTEAN TGX 凝胶BIO-RAD456-104612% SDS 预制胶
Trans-Blot Turbo 转膜试剂盒BIO-RAD170-4157Western 印迹转膜试剂盒
Yarra 3u SEC-2000 色谱柱Phenomenex
InstantBlue 蛋白染色液ExpedeonISB1L即用型考马斯亮蓝蛋白染色液，适用于聚丙烯酰胺凝胶
人 IL-10 DuoSet ELISA 试剂盒R&DDY217B
人 TNFα ELISA 检测试剂盒Diaclone851570020
BCA Pierce 蛋白定量试剂盒ThermoFisher Scientific23227
卡拉胶Sigma-Aldrich22049植物黏多糖
完全弗氏佐剂（CFA）Sigma-AldrichF5881疫苗佐剂
Hamilton 注射器Sigma-Aldrich20779玻璃注射器
动物饲养笼IITC Life Science433动物饲养笼
von Frey 网格支架IITC Life Science410网格支架
von Frey 纤毛 Stoelting58011触觉感觉探针
足底测试（Hargreaves 法）IITC Life Science390G加热玻璃板足底测试
动态负重测试BiosebBIO-DWB-AUTO-M姿势功能缺陷测试
玻璃 Econo-Column 色谱柱，1.5 × 30 cmBIO-RAD7371532玻璃层析柱  
SnakeSkin 透析管 Thermo Scientific88242
Minisart NML 注射器滤器 Sartorius16555-K一次性滤器单元，0.45 μm
CASY 细胞计数与分析仪Roche

参考文献

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