方法文章

一种简便、有效的心肌注射小鼠心脏特异基因操作方法--体内

DOI:

10.3791/57074

2018年4月16日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了一个小鼠心脏特异基因操作的协议。在麻醉下, 小鼠心脏通过第四肋间空间被外部化。随后, 将特定基因的腺病毒注射进心肌, 然后通过体内成像和西方印迹分析对蛋白质表达进行测量。

摘要

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特别是在心脏的基因操作明显事实心脏疾病 pathomechanisms 的调查和他们的治疗潜力。体内心脏特异基因的传递通常是通过系统性或局部分娩来实现的。应用重组腺相关病毒 9 (AAV9), 采用尾静脉全身注射治疗心脏基因表达简便、有效。然而, 这种方法需要较高的载体, 有效传导, 并可能导致 nontarget 器官基因转导。在这里, 我们描述了一个简单的, 有效的, 节省时间的方法, 心肌注射液的体内心脏特异基因操作的小鼠。在麻醉 (没有通气) 下, 胸部主要和次要肌肉被坦率地解剖, 并且小鼠心脏通过手工外在化快速地暴露通过小切口在第四肋间空间。随后, 腺病毒的编码荧光素酶 (卢克) 和维生素 D 受体 (vdr), 或短发夹 RNA (shRNA) 靶向 VDR, 注射了汉密尔顿注射器进入心肌。随后的体内成像表明, 荧光素酶成功地抗原心脏。此外, 西方印迹分析证实了成功的过度表达或沉默的 VDR 在小鼠心脏。一旦掌握, 这种技术可以用于基因操作, 以及注射细胞或其他材料, 如磁性在鼠标心脏。

引言

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心脏病是全球发病率和死亡率的主要原因1,2。缺乏有效的治疗策略, 包括心肌梗死和心力衰竭等危及生命的心脏疾病, 吸引了对基础 pathomechanisms 的深入探索, 并确定了新的治疗方案3。对于这些科学探索, 心脏特异基因操作被广泛使用4,5。心脏基因操纵可以通过基因组编辑使用强大的转录激活器样效应核酸酶 (塔伦) 和聚集定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 工具, 或通过交付异位基因材料 (例如, 携带感兴趣的蛋白质编码基因的病毒载体)6。虽然基因组编辑允许精确和时空基因组修改的活鼠, 它仍然是一个耗时和劳动密集型的做法6。或者, 由病毒载体或小干扰 RNA (siRNA) 复杂传递的心脏特异基因操作通常执行6

病毒载体传递到成年鼠心脏是通过大致两个策略: 系统性或局部注射。系统性注射 cardiotropic 血清自动增值服务如 AAV9 是无创性的心脏特异基因<....

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方案

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所有动物实验都是根据国家卫生研究院关于使用实验动物的指导方针进行的, 并得到了研究所动物伦理委员会的批准。所有的实验都使用雄性 C57BL/6J 小鼠 (8-10 周龄)。小鼠被安置了在无病原体条件下24°c 4 °c, 在 12 h 光/黑暗周期, 与自由获得水和食物。

1. 腺病毒溶液的制备

  1. 纯化腺病毒溶液到达后, 将溶液贮存在-80 摄氏度的冷冻机中。
    注: 腺病毒注射液是在存活的小鼠体内进行的。为确保腺病毒载体的不育, 制备并纯化了910的腺病毒 (荧光素酶、vdr 或 shRNA 靶向 vdr)。
  2. 在手术当天, 从-80 °c 冰箱取出纯化的腺病毒溶液 (3 x 1010斑块形成单元 [pfu]/毫升), 并在冰上解冻腺病毒载体溶液。
  3. 戴上面罩、消毒手套和无菌长袍。
  4. 准备一支50µL 的哈密尔顿注射器, 在手术前一天就被消毒了。
    注: 为杀菌, 哈密尔顿注射器包裹在纱布和放置在高温/高压灭菌器。选择 "固体灭菌" 模式, 按 "启动" 按钮开始灭菌。
  5. 纯化腺病毒溶液完全解冻后, 用75% 乙醇喷洒含有腺病毒溶液的管, 将腺病毒溶液移入层流无菌罩中。
  6. 在层流无菌罩, 吸入50µL 腺病毒溶液使用哈密....

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结果

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实验协议和报告方法的一些关键步骤显示在图 1中。5天后, 在心肌注射腺病毒荧光素酶 (), 在体内成像在对卢克注射小鼠表明, 显着的强力表达的荧光素酶特别在心脏 (图2A, B), 这是由西方印迹分析 (图 2C) 证实, 表明没有 nontarget 器官转导。相比之下, 在控制小鼠中没有发现荧光素酶表达。根据荧光素酶的成功过度表达, 西方印迹分析表明, 在注射腺病毒的小鼠左心室中, vdr 的表达明显增加 (如 vdr) (图 3A)。此外, shVDR 注射液显著减少左心室的 VDR 表达 (图 3B)。与此相反, 在右心室, shVDR 注射小鼠或注射小鼠 (图 3C

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讨论

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本报告展示了一种改进的方法, 心肌注射病毒载体的心脏基因操作, 这是修改了从心肌梗死的方法诱导的高13当前,在体内对特定基因功能的刻画最常涉及产生挖空或转基因小鼠3,14,15,16,17, 这是昂贵的、耗时的和劳力密集型的。或者, 通过系统或局部注射来传递基因载体或 siRNA 也被广泛应用于心血管研究的基因操作4,5,7。特别是, 在某些情况下, 心肌注射液不能替代心脏基因的操作: 当需要定点注射 (例如, 心肌梗死模型中.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到国家杰出青年学者基金会 (81625002)、中国国家自然科学基金 (81470389、81270282、81601238) 的支持, 上海市学术研究领导 (18XD1402400) 项目教育统筹委员会高峰临床医学资助 (20152209), 上海中药肾康医院发展中心 (16CR3034A), 上海交通大学 (YG2013MS42), 上海交通大学医学院 (15ZH1003 和 14XJ10019),上海航海项目 (18YF1413000) 和蚌埠医学院研究生创新项目 (Byycx1722)。我们感谢乌尔博士以前在我们实验室的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
设备
层流无菌罩石动物实验 设备技术有限公司 (中国苏州)FS-CJ-2F
CentrifugeThermo Scientific (美国沃尔瑟姆)75005282
组织研磨机Scientz Biotechnology Co., Ltd. (中国宁波)Scientz-48
高温高压灭菌器平山 (日本埼玉县)HVE-50
异氟醚蒸发器 Matrix (美国 Orchard Park)VIP3000
IVIS Lumina III 成像系统PerkinElmer (Waltham, USA)CLS136334
Precision 平衡Sartorius (Gö德国 ttingen)28091873
Instruments 
Eppendorf 移液器 (100 µL)Eppendorf (美国韦斯特伯里) 
Eppendorf 移液器(10 &微量;L)Eppendorf (美国韦斯特伯里) 
上海医疗器械(集团)有限公司 JD4020弯头
汉密尔顿注射器Hamilton (Nevada, USA)80501Volume 50 μL
微型蚊式止血钳F.S.T (美国福斯特城)13011-12弯曲,尖端宽度 1.3mm
持针器 上海医疗器械(集团)有限公司(中国上海)J32110
手术剪刀FST (美国福斯特城)14002-12
1 mL 注射器威高集团医用高分子有限公司 (中国山东)
材料和试剂
抗 GAPDH 抗体CST (丹佛斯, USA)#2118
抗荧光素酶抗体Abcam (Cambridge, UK)ab187340
抗兔 IgGCST (Danvers, 美国) #7074
抗 VDR 抗体Abcam (英国剑桥) ab109234
丁丙诺啡Thermo Scientific(美国沃尔瑟姆)PA175056
氯酸水腼LingFeng Chemical(中国上海)
样品瓶(美国沃尔瑟姆)3754181.8 mL 
脱毛霜Veet (中国上海)
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 Gibco (格兰德岛, 美国)14040133
EntoiodineLiKang (中国上海)310132
EP 管Sarstedt(美国牛顿)PCR001
FilterMillipore(美国贝德福德)孔径 0.2 µM 
IsofluraneYipin Pharmaceutical Company (中国河北省)
LuciferinPromega (美国麦迪逊市)P1041
蛋白质印迹裂解缓冲液Beyotime (中国上海)P0013J无抑制剂
用乳膏Apex Laboratories (澳大利亚墨尔本))PBS
Gibco (格兰德岛);美国)10010023
蛋白酶抑制剂混合物Thermo Scientific (Waltham, USA)78438
5-0 丝线缝合上海医疗器械(集团)有限公司 (中国上海)
钢球Scientz Biotechnology Co., Ltd. (中国宁波)宽度 1.5 mm
注射器针头Kindly Medical Devices Co., Ltd. (中国浙江)30 号 
暖垫Warmtact 电热技术有限公司 (Guangdong, China )NF-GNCW
风49200000594920000113Thermo Scientific 低温眼

参考文献

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  1. Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fa....

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