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方法文章

环境毒物暴露大鼠下颌门齿釉器官的显微解剖

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DOI：

10.3791/57081

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2018年3月29日

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

本文内容

摘要

理解釉质形成及其可能的改变需要研究成釉细胞的活性。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖包含分泌期和成熟期成釉细胞的釉质器官，该方法可用于后续的定量与定性实验操作。

摘要

由环境因素和生活方式导致的釉质缺陷因其高发率而成为公共卫生关注的问题。这些缺陷源于负责釉质合成的成釉细胞（ameloblasts）功能异常，这些细胞位于釉质器官中。在釉质形成过程中，成釉细胞经历一系列特定且精确的事件，包括增殖、分化和凋亡。大鼠持续生长的门齿是研究生理和病理条件下成釉细胞活性及分化阶段的合适实验模型。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖暴露于环境毒物的大鼠釉质器官。显微解剖获得的牙源性上皮包含处于分泌期和成熟期的成釉细胞，可用于免疫组织化学等定性实验， 原位 杂交，以及用于RT-qPCR、RNA-seq和Western印迹等定量分析。

引言

许多发育性釉质缺陷可能由暴露于环境毒物和/或不适当的生活方式引起1,2,3,4。利用本文所述方法对影响成釉作用的干扰事件及分子机制进行表征，将有助于将由此产生的釉质缺陷作为早期暴露于多种毒物的生物标志物，并可能帮助重建每位患者在釉质合成期间（即围产期）的健康史1,2。根据成釉细胞的活动，釉质合成可分为四个主要阶段5。第一阶段包括前体细胞和前成釉细胞的增殖。第二阶段中，已分化的成釉细胞分泌釉基质蛋白（EMPs），主要包括釉原蛋白、釉蛋白和成釉蛋白，这些蛋白决定了最终釉质的厚度。因此，任何对EMPs合成的干扰都会导致釉质的数量缺陷。在完成全层釉质沉积后，进入成熟阶段。在此阶段，羟基磷灰石晶体在宽度和厚度方向上的生长使釉质达到生物组织中最高的矿化程度，按重量计可达96%。成熟阶段发生的干扰事件会导致釉质的质量缺陷。最后，成釉细胞进入后成熟阶段（在啮齿类动物中也称为着色阶段），并在牙齿萌出过程中发生凋亡，使得釉质缺陷（如果存在）无法修复且不可逆，因此这些缺陷可作为成釉细胞应激的潜在回溯性记录。在啮齿类动物中，成釉过程遵循类似的事件序列，其特点是门齿持续生长，这使其成为研究成釉作用一般机制的合适模型。因此，任何对成釉作用的干扰都会导致釉质质量 和/或 数量的改变，具体表现取决于干扰事件发生的时间窗口。已有研究表明，暴露于二噁英、铅以及内分泌干扰物（EDCs）如双酚A（BPA）、染料木黄酮和乙烯菌核利等，均可引起釉质低矿化1,2,3,6,7,8。在胎儿期及出生后第一个月暴露于低剂量BPA的大鼠门齿上，已观察到不对称的白色不透明斑点1。这些大鼠的釉质缺陷与人类磨牙-门齿低矿化症（MIH）具有相似的临床、结构和生化特征。MIH是一种近期被描述的牙釉质病理状态，尽管已有多种病因因素被提出假设9,10,11,12，但其确切病因至今仍不明确9,10。

另一种由环境因素引起的重要的釉质低矿化病理是氟斑牙（DF），其成因是过量摄入氟化物（>0.1 mg/kg/天）13,14。氟化物的主要来源是经过人工添加或天然富含氟化物的饮用水。氟化物也常被用于预防龋齿，但其预防剂量仅比中毒剂量低50%（≤0.05 mg/kg/天）。釉质发育不全（MIH）和氟斑牙（DF）是两种由环境因素暴露引起的常见病理，可能表现出共同的特征，需要加以明确，因为氟化物的低矿化效应可能与其他毒物（如环境内分泌干扰物2或阿莫西林15）产生协同增强作用。

对处于不同分化阶段成釉细胞的牙釉质器官进行显微解剖，将有助于理解能够干扰成釉细胞活性并在牙齿萌出后导致釉质缺陷的分子作用机制。换句话说，表征环境毒物引起的釉质基因表达变化及釉质基质成分改变，可重建机体暴露于毒物的历史记录，从而促进公共卫生领域的环境安全监测。

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方案

本研究中使用的所有动物均按照法国农业部关于实验动物护理和使用的指南（A-75-06-12）进行饲养和管理。

1. 动物接触毒物

  1. 在执行本方案之前，需获得必要的机构批准，并确保遵守所有动物护理指南。
  2. 设计研究方案时，应设立不同的实验组，以检测所研究分子对成釉细胞分泌期和成熟期的影响。本实验中，根据是否暴露于氟化钠（NaF）以及是否联合双酚A（BPA）处理，将雄性Wistar大鼠分为四组（图1A）2。所有动物均在第65天进行观察和解剖（图1B）。

2. 成年大鼠半下颌骨的解剖

  1. 通过 CO2 窒息法处死大鼠，必要时可随后进行断头以将头部与身体其余部分分离。在专用容器中使大鼠暴露于 CO2 环境中持续 5 分钟16。
  2. 使用 #11 手术刀去除下唇的所有皮肤，以便于充分暴露下门齿。
  3. 使用同一手术刀，在两个下门齿之间施加轻微压力进行切口，下颌骨将随之分裂为两个半侧。
  4. 用手术刀切断颞下颌关节以分离下颌，并用精细镊子夹持半侧下颌骨。
  5. 用手术刀切断周围软组织，并使用刮匙去除所有肌肉、肌腱和韧带，直至骨骼完全清洁。

3. 切牙的分离17,18

  1. 将刀片与切牙的主要长轴平行，从靠近切牙尖端（近中端）的骨嵴处开始，沿近中向远中方向小心地削去骨组织，直至靠近颈环的切牙末端。
  2. 用解剖刀在颈环远中侧做第一道切口，以去除下颌支的下颌角，从而便于完整取出切牙，同时避免损伤颈环或成釉细胞的分泌期组织（见图2中的红线）。
  3. 在第二磨牙下方做第二道切口，将解剖刀插入骨组织与切牙内侧面之间。当所有基底骨被剥离后，向外旋转切牙，并使用精细镊子小心取出，避免损伤釉器官组织。

4. 在双目镜下进行釉质器官的显微解剖

  1. 使用移液器将 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS 1X）滴加到切牙上。用精细镊子夹取切牙，使唇面朝上。在组织的无色部分与橙色部分之间用手术刀做一标记。该标记对应于其下方之后可见的白点（图2）。
  2. 使用挖匙或类似工具，从手术刀标记处向根尖端刮取细胞表面，以获取分泌期（无色）成釉细胞；从手术刀标记处向切牙尖端刮取，以获取成熟期（橙色）成釉细胞。
  3. 去除对应于过渡期的 2 mm 组织，方法如前所述19。在分离釉器官时不要切开切牙，以避免间充质污染。
  4. 按先前所述方法20，切除位于切牙根尖部分的颈环（图2）。
  5. 将其收集至 10% 福尔马林或裂解液中，用于后续分析（见材料表）。

5. 分离釉质器官组织的收集以用于进一步研究

  1. 在切牙上滴加 200 µL 1× PBS 缓冲液。
  2. 使用#11手术刀刀片，在缓冲液中借助先前做好的刀片标记，逐阶段小心地将牙上皮细胞逐步分离。
  3. 用于细胞RNA和蛋白质提取时，将组织置于可同时提取蛋白质和RNA的裂解液中（参见 材料表).
    注意：通过在管中转动组织研磨器来制备高质量RNA，然后研磨细胞直至获得均一的混合物。该混合物可用于后续RNA和蛋白质提取，具体操作按照制造商此前已描述的说明书进行2,8,17通常，每次制备可获得约 5–10 µg 总 RNA 和 150 µg 总蛋白。
  4. 用于组织学分析、免疫组织化学（IHC）和 原位 原位杂交（ISH），将细胞层置于10%福尔马林中固定2小时，随后在4 °C下保存于1×PBS中。组织可包埋于石蜡或OCT包埋剂中，用于制备石蜡切片或冷冻切片。
  5. 对于EMP提取，使用精细镊子夹取切牙。短时间暴露于空气中（轻微脱水）后，切牙唇面中段将出现可见的白色斑点，该斑点代表釉质矿化的起始位置。此白色斑点对应成釉细胞的过渡期/早期成熟阶段，可作为提取EMP的参考标志。21.

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结果

许多釉质缺陷，例如氟斑牙12,13，可能是由于过量吸收氟化物引起的环境因素所致，或由于暴露于某些内分泌干扰物（EDCs）而导致类似于MIH的釉质低矿化1,7,22。这些发育性釉质缺陷可在大鼠中通过实验复制（图1）1,2,7,23,24。大鼠的半下颌包含一颗门齿，该门齿与三颗磨牙之间由一个称为...

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讨论

成釉细胞活性改变和（或）成釉细胞增殖、分化及成熟过程受阻可导致不可逆的釉质缺陷；反过来，对釉质缺陷的表征有助于理解成釉发生过程中异常的成釉细胞活性。因此，无论病因是环境因素还是遗传因素，对分离釉质器官的研究对于阐明导致釉质缺陷的病理事件至关重要。

该技术最初由 Hiller et al.17 和 Robinson et al.18 描述，用于展示对成釉器分化各阶段的特定影响。此后该技术被改进用于 EMP 提取19,24,25。目前我们采用此方法分离成釉器的主要部分，并在不同环境条件下收集生物样本，以通过定性和定量技术分析 RNA 及蛋白质（包括细胞内外蛋白质）。

显微解剖的精确性在应用前需要经过大量的训练，以确保...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由巴黎狄德罗大学、法国国家健康与医学研究院（INSERM）和法国牙科研究学院（IFRO）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双酚ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
10% 甲醛Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FranceTR118
RLT缓冲液Qiagen, Les Ulis, France74126RNeasy Protect Mini Kit
雄激素受体抗体Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816兔多克隆抗体
PBS 10xEUOMEDEXET330.A
氟化钠 (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
常规石蜡Leica microsystems, Nanterre cedex, France39601006文中称为石蜡/石蜡包埋剂
组织OCT包埋剂VWR, Fontenay-sous-Bois, France411243
超细邦氏剪刀 - 直头/8.5 cmPHYMEP , Paris, France14084-08
手术刀柄 - 12.5 cmPHYMEP, Paris, France10035-12
弯头手术刀片PHYMEP , Paris, France10035-20
解剖刀 - 细头/直头PHYMEP , Paris, France10055-12
环形刀PHYMEP, Paris, France10059-15
手术刀片编号°11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, France233-0024
双目显微镜物镜Leica biosystems, Nanterre cedex, FranceMZFLIII

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