环境毒物暴露大鼠下颌门齿釉器官的显微解剖

摘要

理解釉质形成及其可能的改变需要研究成釉细胞的活性。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖包含分泌期和成熟期成釉细胞的釉质器官，该方法可用于后续的定量与定性实验操作。

摘要

由环境因素和生活方式导致的釉质缺陷因其高发率而成为公共卫生关注的问题。这些缺陷源于负责釉质合成的成釉细胞（ameloblasts）功能异常，这些细胞位于釉质器官中。在釉质形成过程中，成釉细胞经历一系列特定且精确的事件，包括增殖、分化和凋亡。大鼠持续生长的门齿是研究生理和病理条件下成釉细胞活性及分化阶段的合适实验模型。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖暴露于环境毒物的大鼠釉质器官。显微解剖获得的牙源性上皮包含处于分泌期和成熟期的成釉细胞，可用于免疫组织化学等定性实验， 原位 杂交，以及用于RT-qPCR、RNA-seq和Western印迹等定量分析。

引言

许多发育性釉质缺陷可能由暴露于环境毒物和/或不适当的生活方式引起^1,2,3,4。利用本文所述方法对影响成釉作用的干扰事件及分子机制进行表征，将有助于将由此产生的釉质缺陷作为早期暴露于多种毒物的生物标志物，并可能帮助重建每位患者在釉质合成期间（即围产期）的健康史^1,2。根据成釉细胞的活动，釉质合成可分为四个主要阶段⁵。第一阶段包括前体细胞和前成釉细胞的增殖。第二阶段中，已分化的成釉细胞分泌釉基质蛋白（EMPs），主要包括釉原蛋白、釉蛋白和成釉蛋白，这些蛋白决定了最终釉质的厚度。因此，任何对EMPs合成的干扰都会导致釉质的数量缺陷。在完成全层釉质沉积后，进入成熟阶段。在此阶段，羟基磷灰石晶体在宽度和厚度方向上的生长使釉质达到生物组织中最高的矿化程度，按重量计可达96%。成熟阶段发生的干扰事件会导致釉质的质量缺陷。最后，成釉细胞进入后成熟阶段（在啮齿类动物中也称为着色阶段），并在牙齿萌出过程中发生凋亡，使得釉质缺陷（如果存在）无法修复且不可逆，因此这些缺陷可作为成釉细胞应激的潜在回溯性记录。在啮齿类动物中，成釉过程遵循类....

方案

本研究中使用的所有动物均按照法国农业部关于实验动物护理和使用的指南（A-75-06-12）进行饲养和管理。

1. 动物接触毒物

1. 在执行本方案之前，需获得必要的机构批准，并确保遵守所有动物护理指南。
2. 设计研究方案时，应设立不同的实验组，以检测所研究分子对成釉细胞分泌期和成熟期的影响。本实验中，根据是否暴露于氟化钠（NaF）以及是否联合双酚A（BPA）处理，将雄性Wistar大鼠分为四组（图1A）²。所有动物均在第65天进行观察和解剖（图1B）。

2. 成年大鼠半下颌骨的解剖

1. 通过 CO₂ 窒息法处死大鼠，必要时可随后进行断头以将头部与身体其余部分分离。在专用容器中使大鼠暴露于 CO₂ 环境中持续 5 分钟¹⁶。
2. 使用 #11 手术刀去除下唇的所有皮肤，以便于充分暴露下门齿。
3. 使用同一手术刀，在两个下门齿之间施加轻微压力进行切口，下颌骨将随之分裂为两个半侧。
4. 用手术刀切断颞下颌关节以分离下颌，并用精细镊子夹持半侧下颌骨。
....

结果

许多釉质缺陷，例如氟斑牙^12,13，可能是由于过量吸收氟化物引起的环境因素所致，或由于暴露于某些内分泌干扰物（EDCs）而导致类似于MIH的釉质低矿化^1,7,22。这些发育性釉质缺陷可在大鼠中通过实验复制（图1）^1,2,7,23,24。大鼠的半下颌包含一颗门齿，该门齿与三颗磨牙之间由一个称为.......

讨论

成釉细胞活性改变和（或）成釉细胞增殖、分化及成熟过程受阻可导致不可逆的釉质缺陷；反过来，对釉质缺陷的表征有助于理解成釉发生过程中异常的成釉细胞活性。因此，无论病因是环境因素还是遗传因素，对分离釉质器官的研究对于阐明导致釉质缺陷的病理事件至关重要。

该技术最初由 Hiller et al.¹⁷ 和 Robinson et al.¹⁸ 描述，用于展示对成釉器分化各阶段的特定影响。此后该技术被改进用于 EMP 提取^19,24,25。目前我们采用此方法分离成釉器的主要部分，并在不同环境条件下收集生物样本，以通过定性和定量技术分析 RNA 及蛋白质（包括细胞内外蛋白质）。

显微解剖的精确性在应用前需要经过大量的训练，以确保.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双酚A	Sigma Aldrich, Saint Louis MO	239658
10% 甲醛	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO	HT5012
Tri-Reagent	Euromedex, France	TR118
RLT缓冲液	Qiagen, Les Ulis, France	74126	RNeasy Protect Mini Kit
雄激素受体抗体	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)	sc-816	兔多克隆抗体
PBS 10x	EUOMEDEX	ET330.A
氟化钠 (NaF)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO	S-1504
常规石蜡	Leica microsystems, Nanterre cedex, France	39601006	文中称为石蜡/石蜡包埋剂
组织OCT包埋剂	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	411243
超细邦氏剪刀 - 直头/8.5 cm	PHYMEP , Paris, France	14084-08
手术刀柄 - 12.5 cm	PHYMEP, Paris, France	10035-12
弯头手术刀片	PHYMEP , Paris, France	10035-20
解剖刀 - 细头/直头	PHYMEP , Paris, France	10055-12
环形刀	PHYMEP, Paris, France	10059-15
手术刀片编号°11 Swann-Morton	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	233-0024
双目显微镜物镜	Leica biosystems, Nanterre cedex, France	MZFLIII