本实验方案的目的是演示在老化和/或病变的人类布鲁赫膜上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞。该方法适用于研究RPE细胞在受损的细胞外基质上的行为。
本文内容
摘要
摘要
除了年龄相关性眼病研究推荐的维生素和抗氧化剂外，目前尚无有效的治疗方法 "干性或萎缩性年龄相关性黄斑变性（AMD），占所有病例的90%。目前亟需开发能够延缓或抑制地理性萎缩（GA）进展的治疗方法，而理解布鲁赫膜（Bruch's membrane）的病理变化是实现这一目标的重要环节。人类布鲁赫膜的结构改变早于AMD的进展，并可导致视网膜色素上皮（RPE）细胞损伤。由于缺乏足够理想的动物模型用于AMD研究， 离体 老化人眼Bruch膜的模型是研究永生化细胞系、原代细胞系以及诱导性多能干细胞（iPSCs）来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞行为的有用工具。本文介绍了一种详细的方法，可用于评估接种于人供体来源的Bruch膜外植体上的RPE细胞行为，包括细胞黏附、凋亡与增殖能力、吞噬光感受器外节的能力、极性的建立以及基因表达情况。该检测方法提供了一种 离体 用于评估RPE细胞在老化/受损的细胞外基质上接种时功能特性的老化Bruch膜模型。
引言
由多种因素（包括亚硝化应激和氧化应激）引起的人类布鲁赫膜随年龄增长发生的结构改变，会对视网膜色素上皮（RPE）细胞功能产生多种有害影响，并促进年龄相关性黄斑变性（AMD）的病理进程1,2,3,4,5,6,7,8,9在考虑对晚期萎缩性年龄相关性黄斑变性（AMD）或地图样萎缩进行细胞替代治疗时，治疗可能需要将细胞移植到视网膜色素上皮（RPE）细胞萎缩的基底上。人类布鲁赫膜（Bruch's membrane）的年龄相关性改变可能对移植的RPE细胞移植物的成功产生不利影响，这与细胞外基质的损伤有关。6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22研究人类Bruch膜的生物学特性，以及基质内结构变化如何促进年龄相关性黄斑变性（AMD）的进展，对于理解该疾病的病理机制至关重要。因此，年龄相关性眼病领域的研究人员迫切需要建立描述这些过程的实验方案 离体 采集老化和/或病变的人类布鲁赫膜。
从历史上看，模拟年龄相关性疾病（如地图样萎缩）以及衰老的人类布鲁赫膜在动物模型中一直存在困难23。这种困难源于多种因素，包括人类寿命相较于常用于疾病建模的啮齿类及其他物种更长，以及大多数脊椎动物缺乏黄斑24。本文所述方法的优势在于，可直接在来自老年和/或患病个体尸检眼组织中提取的布鲁赫膜上测试细胞。本文的总体目标是提供一种针对衰老和/或患病人类布鲁赫膜的离体（ex vivo）模型的详细方法，包括从人类供体中分离布鲁赫膜外植体以及接种视网膜色素上皮（RPE）细胞以用于后续实验。该模型可作为研究细胞外基质损伤对RPE细胞功能及病理影响的相关模型20,25,26,27,28。
方案
以下方案严格遵循《赫尔辛基宣言》以及耶鲁大学人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 获取人类供体眼球
- 从国家疾病研究互换组织（National Disease Research Interchange，NDRI，美国宾夕法尼亚州费城）获取人供体眼球。根据研究项目需要，每个实验组至少准备三对供体眼睛。
- 在死亡后10小时内摘除供体眼球，并在48小时内运输。post mortem 将眼球置于冰上，用无菌的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM）运送至实验室。既往研究已证明，以这种方式采集和运输的供体眼球可保持布鲁赫膜（Bruch's membrane）的生物学特征与活性25,26,29。
2. 人布鲁赫膜外植体的获取
- 将每只眼睛置于一个 1.5 x 在100 mm培养皿中，将1.5英寸纱布浸入不含二氧化碳的DMEM培养基，用精细剪刀在距角膜缘后方3 mm处的巩膜上做切口，并向两侧环形延伸。
- 在距角膜缘1 mm处做一全层环形切口（穿透至玻璃体） 锯齿缘去除并弃去前段结构（角膜、晶状体和虹膜）、玻璃体及视网膜。
- 使用精细的手术剪在巩膜与脉络膜之间做四个放射状切口，然后从周边向视神经方向剥离巩膜，注意避免撕裂脉络膜/布鲁赫膜复合体。
- 接下来，沿脉络膜上腔做环形切口 锯齿缘 并向后剥离视网膜色素上皮-布鲁赫膜-脉络膜复合体与巩膜。
- 用含0.02 M氢氧化铵的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）孵育外植体以去除原代RPE细胞，在60 × 15 毫米聚苯乙烯培养皿在室温下放置 20 分钟，随后用 DPBS 洗涤三次（图1).
- 将Bruch膜复合体外植体漂浮在无二氧化碳的培养基中，置于未层压的疏水性聚四氟乙烯膜（厚度65 µm，孔径0.2 µm）上方， 基底膜 每个外植体朝向膜的层面。
- 将带有Bruch膜外植体的聚四氟乙烯膜置于玻璃微量分析真空过滤装置系统的烧结玻璃支撑物上。
- 用涂有聚四氟乙烯的精细镊子从脉络膜侧将卷曲的边缘展平，注意避免触碰Bruch膜基底膜层的侧面。
- 将15 mL琼脂糖（4% DPBS溶液）加热溶解，然后冷却至37 °C。从脉络膜侧将15 mL液态凝胶倾注到Bruch膜-脉络膜复合体上，同时施加轻柔的负压，以确保外植体保持平坦。将组织置于4 °C环境中2–3分钟，使琼脂糖凝固，随后剥离聚四氟乙烯膜。
- 将Bruch膜外植体（直径1.5英寸，位于已凝固的琼脂糖凝胶内）置于60 x 底部铺有温热液态琼脂糖的15 mm聚苯乙烯细胞培养皿（Bruch膜朝上），用于固定Bruch膜外植体，使外植体的基底膜层朝上。
- 琼脂糖在室温下 2 - 3 分钟内凝固，以稳定培养皿中的布鲁赫膜外植体。用 DPBS 覆盖培养皿中的布鲁赫膜外植体，并将培养皿置于 4 °C 保存以备后续使用。 图2A 展示60 x 的分离布鲁赫膜外植体 15 mm 培养皿
- 若目标培养体系为96孔板，将Bruch膜外植体（直径1.5英寸，含凝固的琼脂糖凝胶）置于平铺的聚四氟乙烯膜上，基底膜蛋白面朝上。
- 使用环钻从Bruch膜复合体外植体上切下5至6个直径为6 mm的圆形组织块，并将每个组织块置于96孔板的未经处理的聚苯乙烯孔底部的4%琼脂糖上，在37 °C条件下孵育。琼脂糖在室温下2-3分钟内即可凝固，从而将Bruch膜外植体（组织块）固定于各孔底部。
注意： 图2B 在96孔板中展示经环钻取得的Bruch膜圆片。通常，9 - 每只眼睛可收获11个纽扣状组织或外植块。
3. 在人布鲁赫膜外植体上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞
- 收到供体眼球后，用DPBS清洗眼外组织。在虹膜与巩膜交界处下方5 mm处（pars plana）做环形切口，进入视网膜下腔。弃去前节、玻璃体和视网膜。
- 用冷DPBS清洗含有Bruch膜和RPE细胞层的眼杯。每份眼球样本使用5 mL 0.25%胰蛋白酶消化不超过10分钟以解离RPE细胞。在50 mL离心管中加入25 mL预热至37 °C的含15%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基以终止胰蛋白酶反应。
- 在24 °C下以200 × g离心10分钟，将细胞沉淀重悬于5 mL DMEM完全培养基（含15% FBS）中。
- 计数细胞后，将15,000个活RPE细胞接种至96孔板中不同年龄的Bruch膜外植体（小片）的基底膜面，每孔加入200 µL含抗生素的无血清最低必需培养基（MEM）（含100 IU/mL青霉素G、100 mg/mL链霉素、5 mg/mL两性霉素B和2.5 mg/mL两性霉素B）。假设细胞直径为20 µm，以此密度接种可使RPE细胞覆盖约15%的培养面积。
- 将细胞接种至小片上，随后可根据各参数对细胞行为的影响逐步提高细胞密度，直至达到100%融合度。
- 将细胞置于37 °C、95%空气/5% CO2的湿化环境中培养24小时，使其贴附于外植体。随后轻轻更换为预热的完全DMEM培养基。
结果
若正确执行本方案，可通过观察视网膜色素上皮细胞极性的建立与外层血-视网膜屏障的形成、生长因子和细胞因子的极性分泌，以及光感受器外节段的吞噬作用，来确定老化和/或病变的人类布鲁赫膜对视网膜色素上皮细胞功能的影响。
我们已获得数据，表明在老龄人布鲁赫膜（Bruch's membrane）上可观察到疾病表型。例如，在老龄人布鲁赫膜外植体上培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞，其再附着能力下降（图3）。在老龄人布鲁赫膜上培养的RPE细胞吞噬视杆细胞外节段（ROS）的能力降低，而吞噬功能是RPE细胞的关键功能之一（图4）。此外，可采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法，如先前研究所述26，在这些圆盘状外植体上识别并比较凋亡细胞。利用微阵列技术，可确定老化和/或病变的人布鲁赫膜对RPE细胞基因表达谱的影响。我们已证明，与来自年轻个体的外植体相比，RPE细胞在来自年长个体的人布鲁赫膜上培养时，其基因表达发生改变（图5）27。进行统计分析时，每组应至少使用来自3至5名人类供体的外植体。
图1. 从供体眼球中分离人布鲁赫膜的示意图。 通过去除巩膜、眼前段、视网膜、玻璃体以及原有的视网膜色素上皮（RPE）细胞，获取人布鲁赫膜。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 培养皿中分离的人类Bruch膜（BM）。 （A） 人类Bruch膜外植体示意图（每个直径1.5英寸，含凝固的琼脂糖凝胶），置于60 × 15 mm的聚苯乙烯细胞培养皿中（BM面朝上），培养皿底部填充温热的液态琼脂糖。 （B） 一个人类Bruch膜外植体被环钻成数个6 mm的圆形小片（外植体），每个外植体随后置于96孔板未经处理的聚苯乙烯孔中，孔内含4%琼脂糖并维持在37 °C。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 视网膜色素上皮（RPE）细胞在年轻和老年中国台湾人Bruch膜（BM）上的重新附着率。 将原代RPE细胞接种于来自年轻（<50岁，n = 3）或老年（>70岁，n = 5）供体眼球的人类Bruch膜外植体上，培养三周。通过MTT细胞活力检测法测定细胞附着率。老年中国台湾人Bruch膜使RPE细胞附着率降低24%（年轻BM：100 ± 8.54 标准误 vs. 老年BM：76.65 ± 1.44 标准误）。**p < 0.05，S.E. = 标准误。
图4. 视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬功能受人眼Bruch膜（BM）年龄的影响。 培养在年老人眼Bruch膜组织片上的原代RPE细胞对视杆外节（ROS）的吞噬能力下降（年轻BM组：873 ± 9.3 标准误，n = 5；年老BM组：608 ± 25.4 标准误，n = 5）。***p <0.01，S.E. = 标准误。
图 5. 在年轻或年老人类玻璃膜外植体上培养的各样本中视网膜色素上皮（RPE）细胞表达的基因数量。 接种于较年老人类玻璃膜上的原代 RPE 细胞所表达的基因数量波动更大，相较于接种于较年轻玻璃膜上的细胞（分别为 6201 ± 388 vs. 6439 ± 80）；每组年龄样本均测试了五个外植体。经 Cai, H et al.27 全体作者正式授权展示。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
衰老的人类布鲁赫膜（细胞外基质）参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的疾病进展，因此有必要了解这种改变的基质如何导致视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍。由于缺乏足够的动物模型来研究AMD中的年龄相关变化，能够模拟疾病效应的离体（ex vivo）模型系统可作为理解其病理生理机制的重要工具。本论文所述方法可用于稳定地分离人类布鲁赫膜外植体，并培养视网膜色素上皮细胞，包括原代、永生化或干细胞来源的RPE细胞系。
如前所述，人眼布鲁赫膜（Bruch's membrane）外植体来源于NDRI。与NDRI之间已建立一项协议，明确规定了供体眼球可接受的标准。例如，供体必须无已知的视网膜眼病，眼球/球体需在死亡后10小时内获取，且球体需在死亡后48小时内通过冰袋隔夜快递送达实验室。应根据研究的统计分析需求，明确所需的适当年龄范围及眼球数量，例如，来自20至49岁供体的五对眼球，以及来自50至89岁供体的五对眼球。
眼球的供应情况各不相同，通常每月平均可获得十对眼球。眼球包裹随附基本的去标识化供体信息：年龄、种族、死亡时间、死亡原因以及简要的既往病史（疾病列表或合并症）。
最重要的是，获取人眼布鲁赫膜（Bruch's membrane）外植体需要去除眼球的前节和玻璃体，从而分离出视网膜色素上皮-布鲁赫膜-脉络膜复合体。一旦分离出布鲁赫膜，便可将视网膜色素上皮细胞以不同浓度接种到去细胞的外植体上，并进行培养以用于后续实验。本文所述的制备与操作过程至关重要，需注意布鲁赫膜分离后的方向，确保其层状表面朝上，同时避免机械接触表面，以防损伤细胞外基质的表面结构。
还应注意，在使用布鲁赫膜外植体系统时，存在一些可能影响下游实验结果的变量，例如供体个体的基因组背景、布鲁赫膜的年龄、布鲁赫膜的死后时间以及布鲁赫膜的取材位置，即布鲁赫膜外植体的中央或周边区域。i.e., 中央或周边部分的布鲁赫膜外植体。与任何其他人体组织研究一样，必须招募足够数量的供体眼球样本以获得必要的统计学效力，并在适当时匹配供体眼球的年龄。制定严格的标准以筛选眼库提供的供体眼球是一项关键参数。仅接受死后10小时以内摘除的眼球，并且布鲁赫膜的制备需在死亡后24至48小时内完成。视神经部位可作为定位标记，实验组与对照组应使用相同位置的组织。通过采取这些措施，可最大限度地减少实验变异性。
总之，了解视网膜色素上皮（RPE）-布鲁赫膜-脉络膜复合体及其在年龄和疾病影响下的变化，对于理解其在年龄相关性黄斑变性（AMD）病理生理过程中的作用至关重要。采用离体（ex vivo）技术的模型系统是利用人体组织研究这些效应的有力工具。本文描述了一种以人眼供体外植体为基础的、针对老化布鲁赫膜的合理离体（ex vivo）模型方法。该技术可将老化和/或病变的人体布鲁赫膜作为研究工具，用于探究基质内结构改变如何影响其上方RPE细胞的行为，包括细胞黏附、增殖以及基因表达25,27。类似离体（ex vivo）模型系统的成功建立将加深我们对AMD的理解，并推动新型治疗策略的开发。
披露
所有作者均无任何商业利益披露。
致谢
本研究由纽约防盲研究基金会（Research to Prevent Blindness, New York, www.rpbusa.org）和大纽约视网膜变性疾病基金会防盲组织（Greater New York Center for Retinal Degenerative Disease Foundation Fighting Blindness, www.blindness.org）提供支持。作者谨此感谢 Luanna Bartholomew 博士对本文手稿的审阅与宝贵意见。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人供体眼球 | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| 无二氧化碳培养基 | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
| 60 mm 聚苯乙烯培养皿 | Corning Inc. | 351007 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 疏水性 65 µm 厚、孔径 0.2 µm 的聚四氟乙烯膜 | Merck Millipore | JGWP04700 | |
| Fisherbrand 玻璃微量分析真空过滤器支架系统 | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
| 35 × 10 mm 培养皿 | VWR International | 25373-041 | |
| 环钻 | Accutome | AM0570 60 | |
| 96 孔板 | Corning Inc. | 3595 | |
| 最低必需培养基（MEM） | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| 青霉素 G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1914 | |
| 两性霉素 B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| 氢氧化铵溶液 | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |
参考文献
- Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).
- Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).
- Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. Cell therapy for basement membrane-linked diseases. Matrix Biol. , (2016).
- Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
- Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula. Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).
- Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).
- Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis. Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).
- Caldwell, R. B. Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats. Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).
- Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V. Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro. Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).
- Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).
- Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).
- Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases. J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).
- Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).
- Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).
- Cai, H., Del Priore, L. V. Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium. Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).
- Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium. Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10(2015).
- Sun, K., et al. Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).
重印与许可
