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高效复性和纯化趋化受体配体结合域的方法

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DOI：

10.3791/57092

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2017年12月12日

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

本文内容

摘要

本文介绍了一种从包涵体中复性空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）趋化受体Tlp3的dCACHE周质配体结合域，并纯化获得毫克级蛋白的方法。

摘要

通过制备毫克量级的纯化、正确折叠的配体结合结构域，可极大促进化学感受器天然配体的鉴定以及配体特异性分子机制的结构研究。在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中异源表达细菌化学感受器的周质配体结合结构域时，常导致这些蛋白被靶向形成包涵体。本文以空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）化学感受器Tlp3的周质dCACHE配体结合结构域为例，介绍一种从包涵体中回收蛋白、复性并纯化的方法。该方法包括：表达带有可切割His6-标签的目标蛋白，分离包涵体并用尿素溶解，通过逐步去除尿素实现蛋白复性，再经亲和层析纯化，随后切除标签并进行尺寸排阻层析。采用圆二色光谱法确认纯化蛋白的折叠状态。已证明该方案普遍适用于其他细菌化学感受器dCACHE型周质配体结合结构域的可溶性、可结晶形式的毫克级蛋白制备。

引言

研究表明，趋化性和运动性在空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的致病过程中发挥着重要作用，可促进细菌在宿主中的定植和侵袭1,2,3。趋化性使细菌能够根据化学信号的引导，向利于其生长的最适环境移动。该过程由一组称为趋化受体或类转导蛋白（Tlps）的蛋白质介导，这些蛋白可识别细胞内和环境中的化学信号。大多数趋化受体是嵌入膜中的蛋白质，包含一个胞外配体结合域（LBD）、一个跨膜域以及一个胞内信号传导域；其中胞内信号传导域可与细胞质中的信号蛋白相互作用，将信号传递至鞭毛马达4,5,6,7。

已在 C. jejuni 基因组中鉴定出 11 种不同的趋化受体4,8。迄今为止，仅部分趋化受体得到了表征，其中 Tlp19、Tlp310,11、Tlp411、Tlp712 和 Tlp1113 的配体特异性已被阐明。通过制备正确折叠且高纯度的重组趋化受体配体结合域（LBD），可极大促进对该物种中其余趋化受体以及其他细菌中大量趋化受体的天然配体的鉴定14,15,16。然而，在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达细菌趋化受体的周质 LBD 时，常导致这些蛋白被靶向至包涵体17,18,19。尽管如此，这一现象反而有利于目标蛋白的简便分离与回收。本文以空肠弯曲菌（C. jejuni）趋化受体 Tlp3 的周质 LBD 为例，介绍一种从包涵体中回收蛋白、复性并纯化的实验方法。选择该实例的原因在于，Tlp3-LBD 属于 dCACHE 家族20 的感应结构域，而该家族在原核生物的双组分组氨酸激酶和趋化受体中广泛存在20,21,22,23。

本方法采用基于pET151/D-TOPO载体的表达构建体，设计包含一个N端His6-标签，其后接烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点，以便后续去除标签19。该方案描述了在E. coli中进行蛋白过表达、包涵体的分离及尿素介导的溶解，以及通过逐步去除尿素实现蛋白复性。复性后，样品通过亲和层析进行纯化，并可选择性地切除标签并进一步进行尺寸排阻层析。纯化后蛋白的折叠状态通过圆二色光谱法进行确认。本方法是对先前用于回收和纯化另一种趋化受体Helicobacter pylori TlpC配体结合结构域（LBD）的方法所作的改进版本19。如图1所示，该流程每升细菌培养物可获得10–20 mg高纯度、无标签的Tlp3-LBD蛋白，经SDS-PAGE分析估计蛋白纯度>90%。

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方案

1. His 表达6-Tlp3-LBD 在 E. coli

  1. 将含有50 µg mL-1氨苄青霉素的150 mL无菌LB（Luria-Bertani）培养基接种BL21-Codon-Plus(DE3)-RIPL细胞，该细胞已转化pET151/D-TOPO载体以表达His6-Tlp3-LBD（氨基酸残基42-291），在37 °C、振幅25 mm、200 rpm条件下于摇床中过夜培养。
  2. 准备六个2 L的锥形瓶，每瓶中加入800 mL含50 µg mL-1氨苄青霉素的无菌LB培养基。将步骤1.1获得的过夜培养物各取20 mL接种至每个锥形瓶中。在37 °C、200 rpm持续振荡条件下培养，直至600 nm处的光密度达到0.6。
  3. 从其中一个锥形瓶中取1 mL培养物（未诱导对照样品），使用台式离心机（13,000 x g，4 °C，10 min）离心收集菌体沉淀，弃去上清液。将细菌沉淀于-20 °C保存，用于后续SDS-PAGE分析。
  4. 向各锥形瓶的培养物中加入终浓度为1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。继续在37 °C、200 rpm摇床中培养4小时。
  5. 在4 °C条件下以5,000 x g离心15分钟收集菌体，并弃去上清液。
    注意：此时可将菌体沉淀置于-80 °C冰箱中保存，暂停实验流程。

2. 包涵体的分离与变性

  1. 将步骤 1.5 中获得的所有细胞沉淀转移至一个 250 mL 烧杯中，并加入 100 mL 缓冲液 A（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl）。让细胞完全解冻（如果为冷冻样品），并重悬沉淀。除非另有说明，否则将样品置于冰上保存。
  2. 将重悬的细胞通过高压匀浆器处理三次，以裂解细胞并确保基因组 DNA 完全剪切。
  3. 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心裂解液 15 分钟。取 1 mL 上清液（可溶性组分）样品，于 -20 °C 保存，用于后续 SDS-PAGE 分析。弃去其余上清液，将沉淀置于冰上。
    注意：此沉淀呈白色（易于与未破碎细胞区分，后者呈棕色），含有包涵体。
  4. 用 20 mL 冰冷的缓冲液 B（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.2 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），1% Triton X-100）充分重悬包涵体沉淀。此步骤有助于膜及膜蛋白的溶解。涡旋振荡 1–2 分钟以促进重悬。
  5. 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心样品 15 分钟，弃去上清液。
  6. 通过涡旋振荡管子 1–2 分钟，用 20 mL 冰冷的缓冲液 B 充分重悬沉淀。确保沉淀被破碎成小颗粒。上下吹打样品以辅助沉淀重悬。
    注意：充分重悬沉淀对于获得不含杂质的包涵体至关重要。
  7. 重复步骤 2.5。如果上清液浑浊或有色，按顺序重复步骤 2.6 和 2.5，直至上清液澄清且无色。
  8. 通过涡旋振荡管子 1–2 分钟，用 20 mL 冰冷的缓冲液 C（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.2 mM PMSF）重悬沉淀。
  9. 重复步骤 2.5。
  10. 加入 25 mL 冰冷的变性缓冲液 D（10 mM Tris-HCl pH 8.0，8 M 尿素，10 mM 二硫苏糖醇（DTT），0.2 mM PMSF）以溶解包涵体沉淀。通过涡旋振荡 1–2 分钟充分重悬，或持续至沉淀破碎成小颗粒。
  11. 在 4 °C 条件下，以 30 rpm 的转速轴向旋转混合悬液 30–120 分钟。
  12. 在 4 °C 条件下，以 30,000 x g 离心 30 分钟，澄清变性蛋白溶液，将上清液置于冰上，弃去沉淀。
  13. 使用 Bradford 法测定蛋白浓度。24 取一份等分试样用于 SDS-凝胶分析，并置于 -20 °C 保存。
    注意：此时可通过将等分试样在液氮中速冻并转移至 -80 °C 保存，暂停实验流程。

3. 蛋白质复性

  1. 在500 mL烧杯中配制250 mL缓冲液E（3 M尿素，100 mM Tris-HCl pH 8.0，0.4 M L-盐酸精氨酸，20 mM还原型L-谷胱甘肽，2 mM氧化型L-谷胱甘肽），并将缓冲液冷却至4 °C。
  2. 将步骤2.13中获得的含His6-Tlp3-LBD的60 mg变性蛋白混合物加入250 mL缓冲液E中，同时以500 rpm速度搅拌缓冲液。将复性混合物在4 °C下孵育，持续以500 rpm搅拌24–48小时。此步骤中最终蛋白浓度为0.2 mg mL-1。
  3. 在8–10 L桶中配制7 L缓冲液A，并将其冷却至4 °C，为24–48小时后进行的下一步（步骤3.4）做准备（参见图1中的流程图）。
  4. 将一段长约50 cm、充气直径为28 mm、截留分子量为12–14 kDa的透析管浸入200 mL 10 mM乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）溶液中，用燃气火焰加热至沸腾。随后用200 mL去离子水（ddH2O）冲洗透析膜。
  5. 用透析管夹封闭透析膜一端，将步骤3.2获得的250 mL复性混合物转移至透析管内，再用另一夹子封闭开口端。检查透析膜完整性，确保无泄漏。
  6. 将透析管放入透析桶中，桶内装有步骤3.3中预先冷却的7 L缓冲液A。放入磁力搅拌子，并确保搅拌时不会触碰透析管。
  7. 在4 °C下以500 rpm持续搅拌进行透析，并在12小时内至少更换缓冲液四次。最后一次换液后，让样品继续透析过夜。
    注意：透析过程中，变性蛋白溶液中的过量尿素（约3 M）逐渐被去除，从而使蛋白得以复性。透析结束时可观察到大量蛋白沉淀。
  8. 从桶中取出透析管，将其内容物转移至500 mL烧杯中。除非另有说明，否则将蛋白溶液置于冰上保存。
  9. 将蛋白溶液通过孔径0.43 µm的滤膜过滤至500 mL玻璃瓶中，以去除任何沉淀的蛋白。

4. 使用固定化金属离子亲和层析纯化 His6-标签蛋白

  1. 活化并平衡一个5 mL预装的螯合柱。
    1. 将层析柱连接至蠕动泵，确保连接管路中无气泡残留。
    2. 用25–50 mL的ddH2O冲洗层析柱。
    3. 加入3 mL的0.1 M NiCl2对层析柱进行载镍，随后用25 mL的ddH2O冲洗。
    4. 用25 mL缓冲液F（上样缓冲液，20 mM Tris-HCl pH 8.0，500 mM NaCl，20 mM 咪唑）平衡层析柱。
  2. 通过加入2.5 mL的1 M Tris-HCl（pH 8.0）、25 mL的5 M NaCl和2.5 mL的2 M咪唑储备液，将步骤3.9中获得的复性蛋白样品调节至与缓冲液F相同的组成。
  3. 以5 mL/min或更低的流速将样品上样至层析柱，并弃去穿流液（未结合的蛋白质）。
  4. 用50–100 mL缓冲液F洗涤层析柱，以去除非特异性结合的蛋白质，并弃去穿流液。
  5. 用25 mL缓冲液G（洗脱缓冲液，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，500 mM 咪唑）洗脱His6-Tlp3-LBD，并收集含有目标蛋白的穿流液组分（通过Bradford试剂检测确定）。
  6. 使用Bradford法测定合并样品中的蛋白浓度。取少量等分试样用于SDS-PAGE分析，并置于-20 °C保存。

5. 使用TEV蛋白酶去除His6-标签（可选）

  1. 准备4 L缓冲液H（TEV切割缓冲液，10 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1 % (v/v) 甘油，2 mM DTT），并冷却至4 °C。
  2. 剪取约 5 - 7 cm 的透析袋（直径 2 - 3 cm），浸入 200 mL 去离子水（ddH₂O）中2O.
  3. 加入 His6标记的TEV蛋白酶添加到His6步骤4.5中制备的-tag蛋白，按1 TEV : 8 蛋白的最终摩尔比混合。
  4. 用透析管夹夹住透析管的一端，将蛋白质/TEV 蛋白酶混合物注入管中。封闭另一端，并确保无泄漏。
  5. 将透析管放入预冷的4 L缓冲液H中（来自步骤5.1），在4 °C下持续搅拌孵育2小时。更换缓冲液后继续透析过夜，以确保TEV介导的切割反应完全进行。
  6. 同时，配制4 L缓冲液I（10 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1 % (v/v) 甘油），并置于4 °C预冷，以备次日使用。
  7. 透析过夜后，将缓冲液更换为步骤5.6中配制的缓冲液I，在4 °C下继续透析1 - 2小时。
  8. 从透析桶中取出透析管，打开管的一端，将蛋白质溶液转移至一个50 mL Falcon管中。使用孔径为0.43 µm的注射器滤器过滤溶液，并置于冰上保存，除非另有说明。
  9. 测量样品体积，并将Tris、NaCl和咪唑浓度调整至缓冲液F的组成例如 向25 mL缓冲液J中的蛋白溶液中加入0.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）、1.75 mL 5 M NaCl和0.25 mL 2 M咪唑。
  10. 按照步骤4.1所述方法准备一个5 mL HiTrap Chelating HP柱。
  11. 将样品上样至层析柱（流速：5 mL/min），收集穿流液，其中含有未带标签的Tlp3-LBD（第42–291位残基）。未切割的蛋白以及被切割后的His6-标签和His6-TEV 被柱子保留。
  12. 用5 mL缓冲液F（上样缓冲液）洗涤层析柱，使所有未带标签的蛋白流穿，并收集流出液。
  13. 合并步骤 5.11 和 5.12 中获得的洗脱液，测定蛋白浓度。取少量等分试样，于 -20 °C 保存，用于 SDS-PAGE 分析。

6. Tlp3-LBD 的尺寸排阻色谱（凝胶过滤）

  1. 配制1 L缓冲液A（10 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl），并使用0.43 µm滤膜过滤。
  2. 用缓冲液A以4 mL/min的流速平衡26/60尺寸排阻色谱柱。
  3. 使用15 mL、截留分子量为10 kDa的离心浓缩管，在4 °C、4,000 × g条件下，将第5.13步获得的蛋白样品浓缩至3–4 mL。
  4. 在4 °C、13,000 × g条件下离心30分钟，澄清蛋白溶液，以去除任何沉淀的蛋白。
  5. 将样品上样至预先平衡的26/60凝胶过滤柱，以缓冲液A为流动相，流速为4 mL/min进行层析。监测紫外吸收信号。Tlp3-LBD的洗脱保留体积为210–220 mL。收集主峰组分。
  6. 测定蛋白浓度，并取少量样品用于SDS-PAGE分析。

7. 蛋白质纯化不同阶段所收集样品的SDS-PAGE分析

  1. 配制1 L SDS-PAGE电泳缓冲液（缓冲液J），其中含25 mM Tris、250 mM 甘氨酸（pH 8.3）和0.1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）。
  2. 配制10 mL 5x SDS-PAGE上样缓冲液（缓冲液K），其中含0.25 M Tris-HCl（pH 6.8）、10%（w/v）SDS、50%（v/v）甘油、1 mM DTT和0.05%溴酚蓝。
  3. 将纯化过程中不同步骤（步骤1.3、2.3、2.13、4.6、5.13、6.6）收集的分装样品解冻。
  4. 对于每个样品，取相当于15 µg总蛋白的体积，加入2 µL 5x SDS-PAGE上样缓冲液，并用ddH2O调整总体积至10 µL。
  5. 将样品在95 °C加热5–10分钟，以10,000 x g离心30秒，然后转移至洁净离心管中。
  6. 制备SDS-PAGE凝胶，使用15%聚丙烯酰胺分离胶（5 mL配方：2.5 mL 30%（w/v）双丙烯酰胺、1.2 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、1.2 mL ddH2O、50 µL 10%（w/v）SDS、50 µL 20%（w/v）过硫酸铵（APS）、3 µL 四甲基乙二胺（TEMED））和5%聚丙烯酰胺浓缩胶（2 mL配方：340 µL 30%（w/v）双丙烯酰胺、250 µL 1 M Tris（pH 6.8）、1.37 mL ddH2O、20 µL 10%（w/v）SDS、20 µL 20%（w/v）APS、2 µL TEMED）。
  7. 组装电泳装置，并根据制造商建议加入1x SDS-PAGE电泳缓冲液。
  8. 上样蛋白分子量标准品及步骤7.5中制备的样品，在恒定电流25 mA条件下进行电泳。
  9. 将凝胶转移至容器中，用ddH2O冲洗一次，加入150 mL考马斯亮蓝染色液（含25%（v/v）异丙醇、10%（v/v）乙酸和0.03%（w/v）亮蓝R-250），置于水平摇床上室温振荡染色30分钟。
  10. 用ddH2O冲洗凝胶，然后放入脱色液（含5%（v/v）甲醇和7%（v/v）乙酸）中，在水平摇床上振荡脱色1小时。
  11. 对凝胶成像并进行分析。

8. 复性纯蛋白二级结构的圆二色性（CD）光谱分析

  1. 将步骤6.6中获得的0.5 - 1 mg复性蛋白转移至透析袋中，放入含有5 L缓冲液L（50 mM磷酸钠，pH 7.4）的透析桶内，缓冲液预先冷却至4 °C。在4 °C下持续搅拌透析，于2 - 4 h内至少更换缓冲液3 - 4次，随后让样品过夜透析。
  2. 使用截留分子量为10 kDa的离心浓缩器，将透析后的蛋白溶液浓缩至0.06 mg mL-1 。
  3. 在4 °C条件下，以13,000 x g离心30 min，对溶液进行澄清处理。
  4. 使用圆二色光谱仪，在25 °C下以20 nm min-1的扫描速率，于200 - 260 nm波长范围内记录样品的远紫外圆二色（CD）光谱。以透析缓冲液作为空白对照。重复测量三次，生成平均光谱。
  5. 通过DichroWeb服务器提供的CDSSTR程序（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk）对CD光谱进行去卷积分析，计算蛋白质的二级结构含量25。

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结果

在大肠杆菌（E. coli）中表达His6-Tlp3-LBD重组蛋白时，蛋白会沉积于包涵体中。根据步骤2.13的计算，每升细菌培养物可获得约100 mg的His6-Tlp3-LBD蛋白，均存在于包涵体中。本方法所述的蛋白分离流程（如图1所示）包括包涵体溶解、蛋白复性及纯化，具体步骤为亲和层析、标签切除和尺寸排阻层析，最终每升细菌培养物可获得10 - 20 mg高纯度的无标签Tlp3-LBD蛋白。

该蛋白从凝胶过滤柱中洗脱出一个单一且对称的峰，对应的保留体积为220 mL（图2A）。利用EMBL蛋白质表达与纯化核心设施网站（http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatograp...

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讨论

本文介绍了一种从细菌趋化受体Tlp3周质LBD包涵体中表达并复性蛋白的简单方法。纯蛋白的制备包括在E. coli中过表达pET质粒编码的基因，包涵体的纯化与溶解，变性蛋白的复性，以及通过连续的亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化。其中，尿素介导的变性以及稀释/透析介导的复性是本方案中的关键步骤，通常需要优化这些步骤以确保包涵体中沉积的蛋白能够正确复性26。

Tlp3-LBD 的复性采用两步法实现，首先将变性的样品稀释至含有尿素的缓冲液中，然后将样品对不含尿素的缓冲液进行透析。采用该方案获得的复性蛋白具有功能活性并可形成晶体18,23。然而，该方法存在一些局限性。众所周知，当蛋白质在尿素存在下变性和复性时，常会发生氨基的氨基甲酰化修饰27,28,

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢刘宇C.在Tlp3-LBD蛋白表达方面的早期工作。玛雅·A·马楚卡感谢哥伦比亚行政科学技术创新部（COLCIENCIAS）提供的博士奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris 碱AMRESCO497
氯化钠 (NaCl)MERK MILLIPORE1064041000
氨苄青霉素G-BIOSCIENCESA051-B
苯甲基磺酰氟 (PMSF)MERCK52332
吐温 X-100AMRESCO694
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDAST0487
尿素AMRESCOVWRC0568
二硫苏糖醇ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-精氨酸盐酸盐SIGMA-ALDRICHA5131
还原型 L-谷胱甘肽SIGMA-ALDRICHG4251
氧化型 L-谷胱甘肽SIGMA-ALDRICHG4376
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
咪唑SIGMA-ALDRICHI2399
甘油ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDBIOGB0232
氯化镍 (NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
甘氨酸AMRESCOVWRC0167
十二烷基硫酸钠 (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
未标记蛋白质分子量标准（宽范围，10-250 kDa）NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Amicon Ultracel 离心浓缩管 (Millipore)MERCKUFC901096
50 mL Falcon 管FALCONBDAA352070
透析袋LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTYDialysis
Snakeskin 透析袋THERMO SCIENTIFIC™68100
预装 HiTrap Chelating HP 柱GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES17-0408-01
EmulsiFlex-C5 高压均质机AVESTINEmulsiFlex™ - C5
蠕动泵 P-1GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 凝胶过滤柱 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES28989336
JASCO J-815 圆二色光谱仪JASCOJ-815

参考文献

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