本文介绍了一种从包涵体中复性空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）趋化受体Tlp3的dCACHE周质配体结合域，并纯化获得毫克级蛋白的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
通过制备毫克量级的纯化、正确折叠的配体结合结构域，可极大促进化学感受器天然配体的鉴定以及配体特异性分子机制的结构研究。在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中异源表达细菌化学感受器的周质配体结合结构域时，常导致这些蛋白被靶向形成包涵体。本文以空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）化学感受器Tlp3的周质dCACHE配体结合结构域为例，介绍一种从包涵体中回收蛋白、复性并纯化的方法。该方法包括：表达带有可切割His6-标签的目标蛋白，分离包涵体并用尿素溶解，通过逐步去除尿素实现蛋白复性，再经亲和层析纯化，随后切除标签并进行尺寸排阻层析。采用圆二色光谱法确认纯化蛋白的折叠状态。已证明该方案普遍适用于其他细菌化学感受器dCACHE型周质配体结合结构域的可溶性、可结晶形式的毫克级蛋白制备。
引言
研究表明，趋化性和运动性在空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的致病过程中发挥着重要作用，可促进细菌在宿主中的定植和侵袭1,2,3。趋化性使细菌能够根据化学信号的引导，向利于其生长的最适环境移动。该过程由一组称为趋化受体或类转导蛋白（Tlps）的蛋白质介导，这些蛋白可识别细胞内和环境中的化学信号。大多数趋化受体是嵌入膜中的蛋白质，包含一个胞外配体结合域（LBD）、一个跨膜域以及一个胞内信号传导域；其中胞内信号传导域可与细胞质中的信号蛋白相互作用，将信号传递至鞭毛马达4,5,6,7。
已在 C. jejuni 基因组中鉴定出 11 种不同的趋化受体4,8。迄今为止，仅部分趋化受体得到了表征，其中 Tlp19、Tlp3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. His 表达6-Tlp3-LBD 在 E. coli
- 将含有50 µg mL-1氨苄青霉素的150 mL无菌LB（Luria-Bertani）培养基接种BL21-Codon-Plus(DE3)-RIPL细胞，该细胞已转化pET151/D-TOPO载体以表达His6-Tlp3-LBD（氨基酸残基42-291），在37 °C、振幅25 mm、200 rpm条件下于摇床中过夜培养。
- 准备六个2 L的锥形瓶，每瓶中加入800 mL含50 µg mL-1氨苄青霉素的无菌LB培养基。将步骤1.1获得的过夜培养物各取20 mL接种至每个锥形瓶中。在37 °C、200 rpm持续振荡条件下培养，直至600 nm处的光密度达到0.6。
- 从其中一个锥形瓶中取1 mL培养物（未诱导对照样品），使用台式离心机（13,000 x g，4 °C，10 min）离心收集菌体沉淀，弃去上清液。将细菌沉淀于-20 °C保存，用于后续SDS-PAGE分析。
- 向各锥形瓶的培养物中加入终浓度为1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。继续在37 °C、200 rpm摇床中培养4小时。
- 在4 °C条件下以5,000 x g离心15分钟收集菌体，并弃去上清液。
注意：此时可将菌体沉淀置于-80 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在大肠杆菌（E. coli）中表达His6-Tlp3-LBD重组蛋白时，蛋白会沉积于包涵体中。根据步骤2.13的计算，每升细菌培养物可获得约100 mg的His6-Tlp3-LBD蛋白，均存在于包涵体中。本方法所描述的蛋白分离流程（如图1所示）包括包涵体溶解、蛋白复性以及通过亲和层析进行纯化，随后切除标签并进行尺寸排阻层析，最终每升细菌培养物可获得10–20 mg高纯度的无标签Tlp3-LBD蛋白。
该蛋白从凝胶过滤柱中洗脱出一个单一且对称的峰，对应的保留体积为220 mL（图2A）。利用EMBL蛋白质表达与纯化核心设施网站（http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatogr.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种从细菌趋化受体Tlp3周质LBD包涵体中表达并复性蛋白的简单方法。纯蛋白的制备包括在E. coli中过表达pET质粒编码的基因，包涵体的纯化与溶解，变性蛋白的复性，以及通过连续的亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化。其中，尿素介导的变性以及稀释/透析介导的复性是本方案中的关键步骤，通常需要优化这些步骤以确保包涵体中沉积的蛋白能够正确复性26。
Tlp3-LBD 的复性采用两步法实现，首先将变性的样品稀释至含有尿素的缓冲液中，然后将样品对不含尿素的缓冲液进行透析。采用该方案获得的复性蛋白具有功能活性并可形成晶体18,23。然而，该方法存在一些局限性。众所周知，当蛋白质在尿素存在下变性和复性时，常会发生氨基的氨基甲酰化修饰27,28,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢刘宇C.在Tlp3-LBD蛋白表达方面的早期工作。玛雅·A·马楚卡感谢哥伦比亚行政科学技术创新部（COLCIENCIAS）提供的博士奖学金。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tris 碱 | AMRESCO | 497 | |
| 氯化钠 (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| 氨苄青霉素 | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| 吐温 X-100 | AMRESCO | 694 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| 尿素 | AMRESCO | VWRC0568 | |
| 二硫苏糖醇 | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-精氨酸盐酸盐 | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| 还原型 L-谷胱甘肽 | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| 氧化型 L-谷胱甘肽 | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| 磷酸二氢钠 (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| 咪唑 | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| 甘油 | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| 氯化镍 (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| 甘氨酸 | AMRESCO | VWRC0167 | |
| 十二烷基硫酸钠 (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| 未标记蛋白质分子量标准（宽范围，10-250 kDa） | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel 离心浓缩管 (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon 管 | FALCON | BDAA352070 | |
| 透析袋 | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin 透析袋 | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| 预装 HiTrap Chelating HP 柱 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 高压均质机 | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| 蠕动泵 P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 凝胶过滤柱 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 圆二色光谱仪 | JASCO | J-815 |
参考文献
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
