本文介绍了一种从女性生殖道不同解剖区域分离和纯化树突状细胞的方法，用于评估其表型和功能特征。该方法可经适当调整，用于从其他黏膜组织中分离其他免疫细胞或树突状细胞。
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本文内容
摘要
摘要
由于获取样本困难以及每份组织中树突状细胞（DCs）数量较少，对定位于黏膜组织中的人类树突状细胞的表征具有挑战性。然而，由于DCs的表型和功能会受到组织微环境的影响，因此有必要对组织驻留的DC群体进行分析，因为来源于血液的DCs无法完全反映组织中DCs的复杂特性。本文介绍了一种利用子宫切除标本从人类女性生殖道（FRT）中分离DCs的实验方案，该方案支持对DCs进行表型和功能分析。该方案包括组织消化以获得单细胞混合悬液，随后进行阳性磁珠分选。我们的组织消化方案不会切割表面标志物，因此可在无需过夜培养或细胞活化的情况下，对稳态下的DCs进行表型和功能分析。该方案可适用于其他免疫细胞类型的分离，或用于从其他组织中分离DCs。
引言
女性生殖道（FRT）具有双重功能，既能抵御病原体，又能允许胚胎植入和维持妊娠1。为实现这一功能，女性生殖道呈区域化分隔，每个解剖区域均表现出独特的组织学、免疫学和功能特征1。
存在于黏膜表面的树突状细胞（DCs）可与肺部、肠道和生殖道中的微生物接触，对潜在病原体进行免疫监视2。DCs具有独特的能力，能够激活初始T细胞并启动适应性免疫反应3。女性生殖道（FRT）中的DCs还具有耐受外来抗原的特殊功能，例如精子和发育中胎儿所携带的抗原，从而保障妊娠成功4。因此，不同部位的DC表型和功能各不相同。已知DCs受到组织微环境的强烈影响，其数量、表型和功能会因所处组织环境的不同而发生改变3。因此，为了理解FRT中DCs在感染性疾病、妊娠以及FRT肿瘤中的作用，必须对组织驻留的DCs进行研究，因为来源于血液的DC模型不足以反映FRT组织中存在的复杂调控机制。
由于黏膜组织中存在的人体组织驻留型树突状细胞（DCs）数量稀少，且获取人体组织样本存在困难，因此对这些细胞的表征具有挑战性。已有研究采用免疫组织化学方法对女性生殖道（FRT）中的DCs进行了分析5,6，该方法可提供细胞在组织内的定位信息，但无法进行功能研究，且在同一时间能够分析的细胞标志物数量有限。此外，已有研究建立了用于流式细胞术分析的单细胞分离方案7,8,9。其中一些方案利用了DCs的迁移能力来分离迁移中的细胞。这些方法通常需要过夜孵育并筛选活化的DCs，但无法用于稳态下DCs的研究。
本研究利用子宫切除标本，优化了一种从女性生殖道（FRT）不同解剖部位——子宫内膜（EM）、子宫颈管（CX）和子宫颈阴道部（ECX）——分离树突状细胞（DCs）的方案，该方案可同时用于表型和功能分析。通过采用非蛋白水解的酶消化方法，组织消化后可直接进行细胞分离及流式细胞术表征，而不会引起细胞活化。结合多色流式细胞术，并针对细胞数量较少的情况优化功能实验，我们能够在FRT的不同部位鉴定并表征稀有的DC亚群。
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方案
涉及人类受试者的研究均遵循《赫尔辛基宣言》所阐述的原则进行。研究已获得达特茅斯学院机构审查委员会及人类受试者保护委员会（CPHS）的批准。在达特茅斯-希契科克医学中心（新罕布什尔州黎巴嫩市）接受子宫切除术的HIV阴性女性，均在手术前签署书面知情同意书。经过培训的病理学家从子宫内膜（EM）、宫颈管（CX）和宫颈外口（ECX）选取无病理病变且远离病变部位的组织样本。血液样本来自在达特茅斯-希契科克医学中心招募的健康志愿献血者，献血者信息匿名。手术室 freshly 分离的EM、CX和ECX组织被转移至病理科进行分离与分类，随后分别置于无菌聚丙烯管中转运至本实验室。
1. 组织的酶消化
注意：使用无菌材料，并在生物安全柜中操作。
- 使用含酚红的1× HBSS、100 U/mL青霉素-链霉素、0.35 g/L NaHCO3和20 mM HEPES配制改良的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
- 配制酶解混合液（改良HBSS、450 U/mL IV型胶原酶、0.01% [wt/vol] 脱氧核糖核酸酶I和2 mg/mL D-葡萄糖）。将溶液经无菌的0.22 µm滤器过滤。建议在使用当天配制消化酶液，但也可在-20 °C冷冻保存。避免反复冻融。
- 用改良HBSS冲洗组织，并置于100 × 15 mm2的培养皿中。根据可获得的组织量和所用酶解液的体积调整培养皿的大小（见下文步骤1.4.2）。
注意：组织大小因病理科提供的手术样本而异，通常为1–10 g。 - 使用一次性手术刀和镊子进行物理处理：
- 向组织中加入约3 mL消化酶混合液，以防止切割过程中组织干燥。
- 用镊子固定组织，用手术刀将其切碎，以增加组织暴露于消化酶混合液的表面积。将组织切成小块（每边< 2 mm）。加入足量的消化酶混合液以完全覆盖所有组织碎片（每克组织5 mL）。盖上培养皿盖子。
- 在37 °C、5% CO2条件下，以约80 rpm的转速在摇床上孵育45分钟。确保摇床转速能使消化酶混合液充分混匀，同时避免溢出或产生气泡。
- 使用倒置光学显微镜配合4×和10×物镜观察组织消化情况。
注意：消化后应可见小的组织碎片及包含明显上皮腺体的混合细胞悬液（见图1A）。
2. 单细胞的物理分离
- 在无菌环境中，将带有支架的 250 µm 网膜放入 150 × 15 mm2 的培养皿中。确保网膜距离培养皿表面约 0.5 cm。
- 用 2 mL 改良型 HBSS 润湿网膜，然后将消化后的组织转移至网膜上。
- 使用 10 mL 注射器活塞的平坦表面，轻柔但有力地将消化后的组织研磨通过网膜。
注意：过度用力研磨会损坏网膜并增加细胞死亡率。此步骤可将上皮细胞和基质细胞（包括免疫细胞）从结缔组织和黏液中分离出来。 - 待组织碎片充分分散后，将网膜及其支架抬高至培养皿上方 2–3 cm 处，用 3 mL 改良型 HBSS 冲洗，以回收更多细胞。
- 收集细胞悬液。将带有支架的 20 µm 网膜放入培养皿中，并用 2 mL 改良型 HBSS 润湿。将细胞悬液倒入网膜上，保持网膜距离培养皿 2–3 cm 高度，然后用 6 mL 改良型 HBSS 冲洗。
注意：此步骤可将保留在网膜上方的上皮细胞片与通过网膜的单个细胞分离开来。滤过液为混合细胞悬液，包含免疫细胞和基质成纤维细胞。 - 收集混合细胞悬液，在 500 × g 条件下离心 10 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 4 mL 改良型 HBSS 中，用于密度梯度离心。
- 将混合细胞悬液铺在 3 mL 多蔗糖溶液上方，在室温下以 500 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。收集多蔗糖溶液顶部的白色条带，并用 PBS 洗涤。
注意：此组分为富集的混合细胞悬液，富含免疫细胞，同时含有少量基质成纤维细胞。
3. 去除死细胞
注意：如果在密度梯度离心后获得的富集混合细胞悬液中存在大量死细胞（> 20%），建议使用磁珠去除死细胞。由于死细胞可能干扰磁珠阳性筛选过程，因此需要将其去除。
- 使用血细胞计数板在光学显微镜的10倍物镜下对细胞进行计数。将富集的混合细胞悬液中的所有细胞离心（500 × g，10 分钟，4 °C）。彻底吸除并弃去上清液。根据制造商说明书，每 1 × 107 个总细胞（活细胞和死细胞）加入 100 µL 死细胞去除磁珠。室温孵育 15 分钟。
- 将一个 30 µm 滤膜置于磁力柱上，加入细胞悬液，使磁珠标记的细胞通过磁力柱滤出。
- 按照推荐方法（3 mL）用死细胞去除缓冲液冲洗柱子。收集流出液，其中含有活细胞。死细胞去除后的细胞回收率范围见图1B。
注意：这些细胞可用于进行流式细胞术染色以开展表型研究（第5节），或继续进行树突状细胞分离（第4节）。
4. 通过正向磁珠分选法纯化树突状细胞
- 在去除死细胞后（步骤 3.2），离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每 1 × 107 个细胞 80 µL 的磁选缓冲液中（PBS，含 0.5% 热灭活人 AB 型血清（HS）和 2 mM EDTA）。
- 对于树突状细胞群体的阳性筛选，根据制造商说明书加入 CD1a 或 CD14 磁珠（每 1 × 107 个细胞加入 20 µL 磁珠），在 4°C 下孵育 15 分钟。
- 用磁选缓冲液洗涤细胞，离心后彻底弃去缓冲液，将细胞重悬于至少 500 µL 磁选缓冲液中。
- 将分选柱固定于磁铁上，并在柱顶部安装一个 30 µm 滤膜，以截留任何残留的细胞团块。按照推荐方法用磁选缓冲液冲洗滤膜和分选柱。
- 将细胞悬液上样至分选柱中，并用磁选缓冲液冲洗 3 次。
- 将分选柱转移至一个 15 mL 离心管中，加入 5 mL 磁选缓冲液，推动推杆以洗脱被分选的细胞。
- 为提高纯度，使用新的分选柱对回收的细胞重复步骤 4.4–4.6。磁珠分选后细胞回收率的范围见图 1C。
5. 细胞纯度评估：流式细胞术与显微镜检查
- 流式细胞术抗体染色：
- 重悬至多 1 x 106 在含有20%热灭活HS的100 µL PBS中重悬细胞，以阻断Fc受体，冰上孵育10分钟。
- 加入所需的荧光标记抗体以及用于鉴定死细胞的试剂（示例见第6.5节）。设置荧光减一（FMO）对照以确定设门范围，并使用补偿微珠制备单染对照用于补偿调节。所用抗体的示例如下 表14 °C 避光孵育 20 分钟。
- 用 2 mL 磁性分选缓冲液洗涤细胞。
注意：EDTA 的存在对于避免细胞在流式细胞术分析过程中发生聚集至关重要。离心后弃去上清液。 - 每管加入100 µL 2%多聚甲醛溶液固定细胞。
- 使用流式细胞仪分析样品10,11.
- 离心柱例如，细胞离心涂片）并使用吉姆萨染色分析形态：
- 在200 µL磁选缓冲液中重悬细胞。
- 将样品加入离心柱中，离心5分钟。让载玻片完全干燥。
- 将载玻片浸入100%甲醇中固定2分钟。用去离子水冲洗载玻片，然后使其自然晾干。
- 进行标准的瑞氏-吉姆萨染色。用伊红覆盖细胞，孵育10分钟，用去离子水冲洗，然后晾干。再用瑞氏-吉姆萨染液覆盖细胞，孵育1分钟，用去离子水冲洗，自然晾干。
- 使用倒置显微镜观察样品图2A，40倍物镜）。
6. 用于评估DC细胞功能的同种异体刺激试验
- 解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）
- 将含10% HS的细胞培养基预热至37 °C。
- 将冻存管置于37 °C水浴中解冻，直至冻存管中仅剩少量冻结的细胞培养基。在无菌环境下，将冻存管中的内容物转移至含有10% HS的10 mL预温细胞培养基中，置于15 mL离心管内。
- 在约 500 × g 条件下离心 7 分钟。弃去上清液，分散沉淀，将 PBMC 重悬于 10 mL 含 10% HS 的细胞培养基中，再次离心细胞。
- 重复洗涤步骤第三次。计数细胞。
- 初始T细胞筛选
- 使用阴性选择磁性抗体细胞分选试剂盒，按照制造商的说明书分离初始T细胞。
- 分离后，使用 CD45RA 和 CCR7 抗体检测纯度。
注：典型纯度为 > 99% 初始T细胞。
- 初始T细胞增殖染料染色：
- 避光条件下，配制600 µL的2倍浓度细胞增殖染料溶液。
- 用 PBS 清洗初始 T 细胞 2 次。将细胞重悬于 500 µL PBS 中。
- 在生物安全柜中轻轻涡旋混悬细胞的同时，向初始T细胞中加入500 µL增殖染料。
- 在37℃条件下孵育细胞10分钟°C
- 通过向细胞中加入5 mL含10% HS的细胞培养基终止细胞标记。置于冰上孵育5分钟，并避光。
- 以约 500 × g 离心 7 分钟，吸除培养基，将细胞重悬于 4 °C 含 10% HS 的细胞培养基中。重复此步骤两次，共洗涤 3 次。在最后一次离心前，取部分细胞进行计数。
注：通常，初始初始T细胞的最终数量将占初始PBMC细胞数的5%至15%。 - 用含10% HS的细胞培养基将细胞重悬至所需细胞浓度。
- DC-同种异体初始T细胞共培养
- 将分离的树突状细胞（DCs）和初始T细胞以DCs与T细胞1:15的比例接种于96孔圆底培养板中。确保每孔DCs的数量在3,000至5,000个细胞之间。
- 以约 500 × g 离心 3 分钟，确保细胞位于孔的中央。细胞间的接触对于正常信号传导至关重要。
- 在37 °C下孵育6天。使用显微镜监测细胞集落的增殖情况，细胞增殖后将在孔中形成可见的细胞簇。图3A).
- 通过流式细胞术染色评估细胞增殖：
- 6天后，可通过流式细胞术检测细胞。对共培养细胞进行流式细胞术染色。
- 在PBS中配制黄色活细胞染料（最大发射波长572 nm）的2倍浓度溶液。
注意：使用不含血清的 PBS 非常重要，因为血清蛋白会干扰染料。 - 以约 500 × g 离心细胞培养板 5 分钟。
- 移除 100 µL 上清液。
注意：此时收集上清液，并单独保存以用于可溶性因子的分析。 - 用 PBS 洗涤细胞两次：每孔加入 150 µL PBS，于约 500 × g 离心 5 分钟，用移液器吸除 150 µL 上清液。确保每孔中剩余 50 µL 上清液。
- 每孔加入50 µL 2x活力染料，室温避光孵育10分钟。
- 孵育期间，配制所需抗体标记物的混合液。例如：CD3 APC/Cy7、CD4 PE、CD8 FITC 等等。
- 将抗体混合物加入每个孔中。室温避光孵育10分钟。
- 用 PBS + 2% HS 洗涤细胞 2 次：每孔加入 150 µL PBS + 2% HS，约 500 × g 离心 5 分钟，用移液器吸除 150 µL 上清液。
- 加入100 µL/孔的2%多聚甲醛固定细胞。如需要：将细胞和培养基转移至聚丙烯流式细胞管中。样品可于4 °C避光保存，直至进行流式细胞术分析。
- 在流式细胞仪中读取样本管。
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结果
组织消化后，可观察到上皮层和腺体的释放，如图1A所示；此为阳性对照，表明酶消化已成功。每克组织回收的总活细胞数和树突状细胞（DC）数量分别如图1B和图1C所示。在密度梯度离心前，免疫细胞占基质细胞总数的5-30%12,13。图2展示了分离所得DC的形态学特征（图2A）及其纯度（图2B、C）。当按照本方案进行两轮筛选时，预期纯度范围为85-92%（图2C）。回收细胞数量存在差异，取决于初始组织大小及供体个体差异。...
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讨论
黏膜树突状细胞（DCs）是一类稀有的细胞群体，其表型和功能在进入组织后会受到组织微环境的显著影响3尽管来源于血液的DCs是一种非常有用的模型，但它们并不能完全代表组织中DC群体的多样性。因此，为了理解黏膜DCs的独特特征，有必要从组织中分离原代细胞。从女性生殖道（FRT）不同解剖部位分离DCs，为研究DC功能提供了可能 体外 并在不同DC亚群和解剖位置之间进行比较。
在此，我们提供一种可从人类女性生殖道（FRT）组织中纯化树突状细胞（DCs）的方案，用于 体外 功能特性的评估。由于树突状细胞（DCs）在黏膜部位数量较少，我们在使用磁珠分离细胞前，通过密度梯度离心和去除非活细胞的方法富集组织细胞悬液。有效去除非活细胞至关重要，因为非活细胞会干扰磁珠分离过程。该技术可获得高纯度的阳性分离细胞（≈ 90%），耗时相对较短（4-6 小时），且无需过夜孵育， 体外 细胞培养，或在分离前的迁移，这些步骤均可能激活树突状细胞并改变其表型特征。本方案不会引发细胞活化，这一点通过成熟标志...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 AI102838 和 AI117739（CRW）。我们感谢 Richard Rossoll 提供的技术支持。流式细胞术分析在达特茅斯学院的共享资源平台 DartLab 进行，该平台由 (P30CA023108-37) 和 (P30GM103415-15) 资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Hyclone | SH30015.03 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES（1M） | Hyclone | 15630-080 | |
| 胶原酶IV | Sigma | C5138 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL 滤器 | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm 聚苯乙烯培养皿 | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm 聚苯乙烯培养皿 | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm 聚苯乙烯培养皿 | Corning | 430599 | 经处理的细胞培养皿 |
| Isotemp 培养箱 | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V 旋转仪 | American DADE | R4140 | |
| 250 um 尼龙筛网 | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um 尼龙筛网 | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R 离心机 | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 培养基（含庆大霉素、L-谷氨酰胺、酚红，1 L） | Lonza | 04-418Q | |
| 人AB血清 | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 预分离滤器（30um） | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS 多联支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a 微珠（人源） | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 微珠（人源） | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 细胞增殖染料 | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 孔圆底板 | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie 黄色细胞活性染料 | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7（抗人） | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE（抗人） | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC（抗人） | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios 流式细胞仪 | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 色，VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 色，VBR |
参考文献
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