全视野光学相干显微术用于角膜移植片中基质特征的类组织学分析

摘要

我们介绍了全视野光学相干显微技术作为一种高质量评估角膜供体基质的方法。该方案可用于识别反映组织健康或病变的特征，旨在改进供体组织的筛查与选择，从而提高角膜移植术的效果。

摘要

供体角膜基质的质量可能是深板层角膜移植术和穿透性角膜移植术成功的主要限制因素之一，甚至是最主要的限制因素。角膜基质约占角膜总厚度的90%。这两种手术分别通过来自近期去世个体的供体组织（即移植物）替换部分或全部病变的角膜层。然而，目前眼库评估角膜移植物基质质量的方法有限，且缺乏对疾病指标进行高分辨率定量评估的能力。全场光学相干显微成像技术（FF-OCM）能够对新鲜或固定的角膜组织进行高分辨率三维成像， 离体 生物组织样本，是一种适用于供体角膜评估的非侵入性技术。本文介绍一种利用全场光学相干显微术（FF-OCM）对角膜基质进行定性和定量分析的方法。该方案已成功应用于正常供体角膜及病变角膜组织，并可在宏观与微观层面识别健康与病理特征，从而有助于发现可能影响角膜移植手术效果的基质异常。通过提升移植物质量控制水平，该方案有望实现对供体组织更精准的筛选与剔除，进而降低移植失败率。

引言

角膜疾病是全球主要的致盲原因之一¹。某些疾病只能通过手术治疗，通常需要使用来自近期死亡个体的供体组织（即角膜移植片）替换部分（i.e.，板层角膜移植术）或全部（i.e.，穿透性角膜移植术）病变角膜。对于未累及角膜内皮层的角膜疾病（e.g.，圆锥角膜、感染性角膜炎后基质瘢痕、外伤及基质营养不良），目前公认首选的手术方式为深板层前角膜移植术（DALK）^2,3,4,5。该技术仅替换受体角膜的中央上皮层和基质层，从而保留受体自身的角膜内皮层，具有较低的移植片排斥发生率、无内皮排斥反应、较少的内皮细胞丢失以及更优的成本效益比^{6,7,8,9,10,11}。此外，DALK允许使用内皮质量非最佳的供体角膜作为移植片，因为该受损层不会被移植¹²。相反，供体角膜基质的质量可能成为影响移植成功和视力恢复的主要限制因素，因为在移植后仅保留供体基质层，而供体上皮层将被受体上皮层所取代。遗憾的是，目前眼库评估供体角膜基质的手段十分有限，通常包括在眼球摘除后通过裂隙灯检查供体眼球，以及对供体基质进行光学显微镜检查¹³。一些眼库已开始在常规流程基础上补充使用傅里叶域光学相干断层扫描（FD-OCT）进行评估¹⁴。

眼科光学相干断层扫描（OCT）是一种光学成像技术，可视为超声成像的光学类比¹⁵，利用宽带或可调谐光的干涉来生成视网膜¹⁶和眼前段¹⁷的光学断层图像。在时域OCT（早期临床系统的基础）中，参考镜的位置不断改变，当参考光束传播的时间与从不同组织界面反射回来的光束传播时间几乎相等时，便会产生干涉图样，A扫描随之随时间生成。而在频域OCT（FD-OCT，也称为谱域或频率域OCT，目前大多数现代临床系统的基础）中，参考镜固定于某一位置，一次采集包含所有干涉图样的单个A扫描，再通过傅里叶分析将其分解。

尽管临床（时域或频域）OCT 系统能够以高于裂隙灯生物显微镜的轴向分辨率提供角膜的横断面图像并检测基质混浊，但其横向分辨率有限。共聚焦显微镜¹⁸ 可实现接近组织学细节水平的横向分辨率，用于角膜检查，但其轴向分辨率受限。

全场光学相干断层显微技术（FF-OCT 或 FF-OCM）^19,20 结合了共聚焦显微镜和光学相干断层成像（OCT）的特点，实现了横向分辨率与约 1 µm 的轴向分辨率相当。更具体而言，FF-OCM 采用非相干宽带光源（例如，卤素灯）和高数值孔径光学系统，无需横向扫描即可获取en face二维断层图像。通过在深度方向进行扫描，FF-OCM 能够对新鲜或固定的ex vivo生物组织样本实现无创三维成像。该技术已被用于角膜成像^21,22,23。由于可同时提供高分辨率的en face图像和横截面图像，FF-OCM 能够反映角膜的组织学结构及细胞水平的细节信息。事实上，已有研究表明，FF-OCM 提供的结构信息优于传统组织学方法，并且能够识别出比频域OCT与共聚焦显微镜联合使用时更多的疾病指征^24,25。

本文介绍了一种利用全场光学相干显微技术（FF-OCM）对角膜供体基质进行定性与定量评估的实验方案。该方法基于对反映基质状态的大体与微观特征进行类似组织学的分析，包括三个定量的基质参数（即，Bowman层的厚度及其变异性，以及基质的反射率）。因此，该方案适用于正常和异常角膜组织，可区分病变与正常的角膜组织。

方案

所有方法均按照《赫尔辛基宣言》的原则进行，并遵循国际上关于人体组织的伦理要求。本研究为一项前瞻性观察性病例对照研究。已从患者处获得知情同意。未对法国治疗或随访标准进行任何修改。机构审查委员会（IRB）批准由法国大区五区患者保护委员会（14944）提供。

1. 组织选择与制备

1. 选择供体角膜。
   1. 将保存在器官培养基中的供体角膜转移至添加右旋糖酐的器官培养基中，培养3天，以在进行FF-OCM成像前实现脱水消肿（参见材料表）²⁶²⁷²⁸。
2. 准备样品。
   1. 将浸没在保存液中的角膜置于样品架中，上皮面朝上。
   2. 将一片洁净的石英盖玻片（随样品架提供）放置在角膜上方，并轻轻旋转样品架底部，直至样品在盖玻片下被轻微压平并固定，从而提供相对均匀的成像表面。操作时需注意避免产生气泡。
   3. 在盖玻片上涂抹一层较厚的眼科或光学凝胶，作为浸没介质。

2. FF-OCM 初始化、设置与图像采集

1. 启动设备。
   1. 通过操作设备背面的电源开关打开设备；设备正面的绿色 LED 灯亮起表示电源已接通。
   2. 通过操作设备正面的电源开关，打开专用计算机和卤素光源。
   3. 双击桌面快捷方式，启动采集软件（参见材料表）。
   4. 确保成像载物台上除可移动托盘外无其他物品。然后在提示时点击 "OK" 以初始化电机。
   5. 拉出托盘，将样品架插入专用容器中，然后轻柔地将托盘推回原位。
2. 设置设备。
   1. 在指定的必填字段中输入"样品标识符"；可选择性地输入"样品描述"和/或"研究描述"。
   2. 准备就绪后，点击"采集宏观图像"，以生成样品的快照，供后续横向定位和导航使用；确认图像满意后，在提示框中点击"是"进行确认，随后设备会将样品托盘移至物镜下方并执行自动调节。
   3. 继续操作前，确保显微镜物镜已充分浸入光学凝胶中。
3. 采集图像序列（stacks）。
   1. 选择"探索"选项卡以准备图像采集。
      1. 在采集图像序列之前，通过操纵摇杆或在屏幕上手动选择（即，点击并拖动所采集宏观图像上的红色方框至目标位置）将视野移至角膜中心。
      2. 通过旋转摇杆、调节滑块或在图形用户界面（GUI）中手动输入键盘值来调整成像深度，并调整平均值（通常建议设置为40，以获得最佳角膜成像效果）。
         注：此步骤用于确定角膜样品的厚度以及为穿透整个角膜厚度成像所需的平均次数，同时记录深度方向上的第一张和最后一张图像位置。盖玻片底面会在断层图像（GUI 右侧）上产生平行的干涉条纹，有助于定位角膜表面。
      3. 将角膜表面值或深度方向上的第一张图像位置输入到"深度"字段中。
   2. 选择"采集选项卡"以开始图像采集。
      1. 选择"切片间距"（默认且推荐设置为 1 µm，与设备的轴向分辨率相匹配），并根据角膜厚度在"切片数量"中输入相应数值。
      2. 检查参数和预计采集时间，确认无误后按下"OK"启动采集。
      3. 采集过程中，避免触碰放置 FF-OCM 设备的实验台。

3. 获取图像的管理

1. 查看和导出图像。
   1. 通过双击桌面快捷方式启动 FF-OCM 查看软件（参见 材料表）；采集的图像（以样本 ID 标识）将显示在"本地研究"列表中。
   2. 选择包含宏观图像和采集图像序列的对应样本 ID 的研究项目，通过右键单击图像序列并选择"DICOM"格式来"导出"后者，以保留原始像素数据和元数据用于进一步分析。
   3. 通过双击图像序列，使用多平面重建（MPR）模式显示三维图像序列的en face视图和横截面视图；通过滚动鼠标滚轮或调整滑块等方式浏览图像（例如），并为每个图像序列选择具有代表性的en face视图和横截面视图。
   4. 通过点击窗口右下角的图标导出所选视图，使用"DICOM"格式。
2. 导入图像。
   1. 通过双击桌面快捷方式打开图像处理软件（参见 材料表），并在"插件"下导航至"Bio-Formats""导入器"以导入 DICOM 图像；确保在"Bio-Formats 导入选项"窗口中选中"合并名称相似的文件"。

4. 图像分析：间质形态与特征的定性与定量评估

1. 评估基质层和鲍曼层的厚度。
   1. 在角膜横截面上手动测量距离，例如在横截面上等间距选取五个点进行测量²⁵。
      1. 在两个已知距离的点之间画一条线（例如，从整张图像的左侧到右侧，即根据默认视野为1,024像素或780 µm），进入"分析"并选择"设定比例尺"，在相应字段中输入"已知距离"和"长度单位"，然后点击"确定"。
      2. 在两个未知距离的点之间画一条线；直接从状态栏读取所测得的长度或距离。
   2. 记录平均值和变异系数（COV）。鲍曼层厚度小于6.5 µm且变异系数大于18.6%的情况与异常角膜基质相关²⁵。
2. 确定角膜细胞密度。
   1. 按照共聚焦显微镜的常规方法：将基质层的en face图像每7张叠加一次，以生成厚度相近的切片。为此，请进入"图像"选项卡，并在"堆栈"下选择"Z轴切片"。
   2. 考虑角膜基质由前向后推进过程中细胞密度不同（逐渐降低）的特点^24,25。为此，可将基质层按深度分为四个区域：（1）鲍曼层下方的最前部基质，占整个基质厚度的2%；其余基质（即占整个基质厚度的98%），再均分为三个等厚区域：（2）前部基质、（3）中部基质和（4）后部基质。
   3. 进行进一步分析时，应包括所有可用的最前部基质的en face切片，前部基质取15张图像，中部基质取5张图像，后部基质也取5张图像（各区域所需图像数量是通过逐步分析确定的²⁹）。
   4. 在每张en face图像上，选择一个300 µm × 300 µm的兴趣区域。为增强细胞核的可视化效果，使用"编辑"选项卡下的"反相"功能对图像进行反相处理，并调整对比度和亮度。调整对比度和亮度时，进入"图像"，在"分析"下选择"亮度/对比度"。
   5. 手动计数细胞核，例如使用"细胞计数器"功能²⁵。为此，请进入"插件"，在"分析"下选择"细胞计数器"。点击“初始化”，然后选择一种计数器类型。 随后通过点击反相图像中深色椭圆形结构开始计数细胞核，仅将落在图像四边中任意两边边界上的细胞计入统计²⁵。
   6. 以面积密度形式记录细胞密度，即单位为细胞/mm²（将计数得到的细胞数除以0.09，即可从细胞/90,000 µm²转换为细胞/mm²），遵循共聚焦显微镜的惯例，已有研究表明角膜细胞密度在患者（例如，圆锥角膜患者）中低于健康受试者，并与疾病严重程度相关²⁵。
      注：需要进一步的临床研究来确定角膜移植术后获得完全透明角膜移植物所需的角膜细胞密度最低阈值。
3. 评估基质层的反射率。
   1. 利用例如"Z轴轮廓"功能或自定义软件，生成基质图像堆栈的平均强度随深度变化的曲线^25,30,31。
      注： 实际上这些是振幅随深度变化的曲线，因为全视野光学相干显微术（FF-OCM）测量的是样品后向散射光的振幅而非其强度。 
      1. 计算每个en face堆栈的平均灰度值。
      2. 减去最小灰度值，并用最大灰度值进行归一化。
      3. 以对数尺度显示其随基质深度（占基质厚度的百分比）的变化。
      4. 用一条线性回归直线近似拟合所得的对数曲线，该直线使残差平方和最小（最小二乘法拟合）。
      5. 记录R平方值（R²）作为线性度的衡量指标。R²值低于0.94可能提示存在角膜病理改变²⁵。
         注： 为了区分由于病理存在导致的线性对数回归模型（或单指数衰减模型）拟合不佳与单纯的测量噪声，可采用贝叶斯推断进行信号分析³¹。此外，对于具有线性对数（或单指数）基质深度分布曲线的角膜（例如，R平方值³⁰ 或Birge比值³¹接近1的情况），可通过信号衰减速率计算光子平均自由程，以进一步量化透明度程度³¹。
4. 评估其他基质特征及疾病指征的可见性。
   1. 检查是否存在瘢痕、纤维化组织、湖状结构或Vogt条纹。
   2. 若神经足够清晰可辨，则评估基质内神经的平均厚度²⁴。
      1. 选择一张基质神经最清晰可见的en face图像（通常位于中基质区域）。
      2. 测量神经厚度，例如在五个点位进行测量²⁴，然后计算平均值和标准差。神经厚度超过9 µm可能是病理状态（如圆锥角膜）的额外指征²⁴。

结果

本研究中使用的FF-OCM设备（见材料表）²⁸ 及其通用装置如图1所示。图2显示了人供体角膜在器官培养液中保存后出现的肿胀情况，该模型可模拟水肿性角膜的病理生理状态，但由于穿透深度有限，无法通过整个角膜厚度获取完整的FF-OCM图像。转移至添加右旋糖酐的器官培养液后，角膜发生脱水收缩，恢复为正常厚度的供体角膜，如图3所示。病变角膜可通过形态学改变及典型的基质特征进行识别，包括基质层厚度减少且不均一（图4）和/或Bowman层异常（图5）。角膜细胞密度（图6）和基质反射率（图7）的评估可进一步辅助实现类似组织学的分析，并利用FF-OCM技术区分正常与病变角膜组织，其分辨能力超越了临床OCT系统（图8）。

图1：本研究所用全场光学相干断层扫描（FF-OCM）装置的整体结构示意图与实物照片。（A）FF-OCM装置实物照片（参见材料表）²⁸。（B）装置的光路结构与光学系统示意图。（C）置于样品架中的人类供体角膜实物照片。（D）浸没式物镜与样品架的局部放大图。请点击此处查看该图的高清版本。

图2：去水肿前器官培养的正常人角膜。 横截面（A）和 正面 视图（B，切穿因器官培养液储存导致的肿胀（“水肿性”）角膜基质，在图像中可见暗区（如箭头所示）为液化区域。角膜厚度已增加一倍，超过1,100 µm，导致无法获取全层深度的成像。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：去水肿后正常人角膜的器官培养状态。 通过整个角膜的横截面图（A）和去水肿角膜在含右旋糖酐培养基中浸泡后的表面基质观（en face，B），显示规则分布的高回声（白色）角膜细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：间质形态及特征的总体评估，包括间质厚度。 与正常人角膜（A）相比，圆锥角膜（B）的间质厚度减小且不均一，同时可见大量平行排列的Vogt条纹，在横截面视图中表现为深色垂直条带，以及可在间质中层en face切片中观察到的增粗的间质神经（C）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：Bowman层厚度的评估，其前界为高反射性的上皮基底膜，后界为角膜前基质层中高反射性的角膜细胞。 与正常人角膜（A）相比，病理性角膜（例如，圆锥角膜）（B）由于中断和瘢痕形成，Bowman层厚度减小且不均一。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：角膜成纤维细胞密度评估。（A）在选定300 µm × 300 µm感兴趣区域后，于增强并反相的en face图像上人工计数角膜成纤维细胞核。（B）已计数的细胞核由箭头标示。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：基质反射率的评估。 在正常供体角膜的基质中，向后散射的光量随深度增加而呈指数下降（见图3和图4A），从而形成接近线性的对数深度分布曲线，其特征为R平方值接近1（绿色曲线）。但对于存在基质区域光散射增强的病理性角膜（见图4B），这一规律可能不成立。当存在此类宏观结构特征时，例如感染性角膜炎后遗留基质瘢痕的角膜（见插图），将导致非线性的对数强度深度分布曲线，表现为R平方值低于某一阈值（例如，低于0.94²⁵；红色曲线）。需注意，此处所示的对数振幅深度分布曲线实际上是基于全场光学相干显微术（FF-OCM）测量的样品背向散射光的振幅，而非其强度。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：FF-OCM相较于组织学和谱域OCT的优势演示。 (A组织学与（B同一角膜上获取的相应谱域光学相干断层扫描图像 体内 角膜移植术前。 (C对应的FF-OCM横截面图像 离体 角膜移植术后角膜瓣，显示出相比临床谱域OCT图像更优的分辨率。与组织学图像相比，FF-OCM图像中纤维化区域也更为清晰可见。在上部基质层中高密度的角膜细胞，在（C横截面和（D) 正面 观点 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文所述利用傅里叶域光学相干层析技术（FF-OCM）对角膜供体基质进行定性和定量评估的方案，基于对提示基质状态的大体和显微特征进行类似组织学的分析，其能力超越了谱域OCT和共聚焦显微镜^21,24,25，并能够区分病变与正常的人体组织。

除了通过裂隙灯显微镜对人供体角膜的内皮质量进行优良评估外，目前在眼库中对角膜基质质量的评估仍具挑战性，现有方案通常仅限于使用裂隙灯生物显微镜和/或光学显微镜进行粗略观察。现有方法缺乏精细分辨率，不仅可能导致带有一定程度基质病变的角膜被误选，从而影响角膜移植术的效果，还可能导致一些实际上病变仅局限于前部基质或上皮区域的角膜因基质混浊而被弃用，而这些角膜仍可用于内皮角膜移植手术¹⁴。

目前的眼库方案可通过增加全场光学相干显微成像（FF-OCM）进行补充，由于其具有更高的分辨率，FF-OCM成为一种强大且无创的工具，可用于完成角膜（尤其是基质层，包括鲍曼层）的质量评估。与裂隙灯检查不同，在整个FF-OCM图像采集过程中，角膜移植片始终浸没在充满保存液的密闭腔室内，从而降低了任何潜在的污染风险。

为了成功进行FF-OCM成像（参见材料表），必须确保显微镜物镜充分浸没在涂布于样品架盖玻片表面的光学凝胶中（步骤2.2.3）。此外，建议定期检查设备的校准状态，此操作在自动调节失败后也应执行（步骤2.2.2），并通过采集软件中的"工具与选项"菜单进入（参见材料表）。该校准程序需使用样品架中的校准镜，其操作步骤与常规样品制备相同（见步骤1.2），唯一区别是在放置盖玻片前，应先将光学凝胶涂布于校准镜表面。

采用一系列供体角膜移植物（根据现有眼库操作规程判定为具有正常基质）来描述本文中的实验方案，并特别展示傅里叶域光学相干显微术（FF-OCM）在精确且可靠地评估供体角膜基质质量方面的适用性。将这些正常供体角膜与浸泡在保存液中的病变角膜进行比较，结果表明，利用FF-OCM对角膜移植物中多种基质特征进行类组织学分析（如图2、图3、图4、图5、图6、图7和 图8所示），能够有效区分病变与正常的入类角膜组织。

除了形态学改变（如瘢痕（图5 和 图7）、纤维化组织（图8）、湖状结构（图2）、Vogt条纹（图4）或基质神经直径增大（图4））外，患病角膜中仍存在典型的基质特征。在基质质量评估中尤为重要的基质参数包括Bowman层的厚度及其变异性，以及基质反射率。因此，本方案中的关键步骤为4.1和4.3。

在人类角膜发育过程中分泌时，鲍曼层尤其在妊娠19周时变得明显，且出生后永不修复³²。因此，鲍曼层的损伤是不可逆的，可作为供体角膜组织中既往基质损伤（包括由屈光手术、感染性角膜炎、圆锥角膜等所致损伤）的理想指标。此类角膜疾病是供体角膜使用的禁忌证，由于结构中断和瘢痕形成，常表现为鲍曼层厚度降低且不均一（图5），当供体病史不详时，现有的眼库检测规程很可能遗漏这些病变。

尽管角膜透明度在供体死亡后因 死后 角膜水肿，后向散射光的量或基质反射率在基质深度方向上预计呈指数级下降（参见 图3 和 图4A）；因此，在正常供体角膜中，标准化基质反射率的对数将与基质深度呈线性函数关系，以接近1的R平方值表示。相反，宏观特征的存在与非线性的对数深度分布相关，提示基质病变。图4B 和 图7)²⁵.

由于角膜基质细胞密度与基质胶原纤维及细胞外基质的合成和更新密切相关，因此可以合理推测，角膜基质细胞密度是评估供体基质质量的另一项重要参数，而细胞计数极低的组织不应用于移植。因此，本方案包含一种基于全视野光学相干显微成像（FF-OCM）图像精确且可靠的角膜基质细胞密度测量方法，可便于眼库常规使用²⁵ 并遵循共聚焦显微镜的惯例。需要注意的是，使用傅里叶域光学相干层析成像（FF-OCM）时，亦可通过在横截面视图中直接计数角膜基质细胞来确定角膜基质细胞密度。³³，这可能是相较于共聚焦显微镜的一种潜在优势，后者需要在多个层面计数角膜细胞 正面 切片。然而，与活体患者不同的是，已有研究表明，疾病患者的角膜基质细胞密度低于正常对照组^34,35,36,37 并与疾病严重程度相关联^34,38，但在人类中情况并非如此 离体 组织样本²⁵，且需要进一步研究以确定供体角膜中角膜基质细胞的最低数量是否会影响移植后良好的视力恢复。供体组织中角膜基质细胞密度较低的情况，与病理性组织相似，可能由衰老引起。 死后 缺血导致的细胞丢失和/或供体组织的保存^27,39,40,41需要指出的是，本方案中获取并成像的正常供体角膜，根据欧洲眼库协会的标准，因内皮质量不佳而在移植前已被眼库废弃，这些角膜或处于保存后水肿状态，或已脱水消肿。若将FF-OCM成像结合本方案应用于眼库环境中，角膜通常可在比本研究更新鲜的状态下进行评估，这可能影响角膜基质细胞密度的测量结果。

本文所述的基质质量分析方案可进一步扩展用于评估后弹力层，后弹力层的厚度和结构也可通过全视野光学相干显微镜（FF-OCM）进行分辨^21,24。这一方法可能有助于选择适合进行后弹力层内皮角膜移植术的组织，因为在该手术中，较薄的后弹力层可能更难以与基质分离。

综上所述，傅里叶域光学相干断层扫描（FF-OCM）能够在角膜供体基质储存期间实现精确且可靠的评估。通过提高移植物质量，将该方案纳入当前的眼库操作流程，有望改善供体组织的筛选与选择，从而提升角膜移植术的效果。得益于定制CMOS相机的开发，实现了更快的图像采集速度和更大的视场，同时设计了用于成像过程中角膜储存与操作的定制无菌一次性匣盒，这些近期的技术更新将有助于推动FF-OCM设备在眼库日常操作中的实际整合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Light-CT 扫描仪	LLTech，法国	http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/	本文用于成像的FF-OCM设备
CorneaJet	EuroBio，法国	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html	保存供体角膜所用的器官培养基
CorneaMax	EuroBio，法国	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html	用于脱水的含葡聚糖的器官培养基
Fiji（ImageJ）	美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院	https://fiji.sc/	开源图像处理软件
Matlab	Mathworks, Inc.，美国马萨诸塞州纳蒂克	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	数学计算软件