通过双分子互补亲和纯化技术（BiCAP）解析多蛋白信号复合物

摘要

本文描述了双分子互补亲和纯化（BiCAP）的实验方案。该新方法能够特异性地分离任意两个相互作用的蛋白质，并对其进行后续蛋白质组学表征，同时排除未形成复合物的单个蛋白质以及与竞争性结合伴侣形成的复合物。

摘要

蛋白质复合物的组装是调控多种细胞信号通路的核心机制。生物医学研究的一个重要方向是解析这些动态蛋白质复合物如何整合来自多个来源的信号，从而引导特定的生物学反应，以及这种调控在多种疾病状态下如何发生异常。尽管这一关键生化机制至关重要，但目前仍缺乏能够有效实现对这些多分子信号复合物进行特异且灵敏解析的实验技术。

本文通过将蛋白质互补检测与一种构象特异性纳米抗体相结合，解决了这一不足，我们将该方法命名为双分子互补亲和纯化（BiCAP）。这一新技术能够特异性地分离任何一对相互作用的蛋白质，并对其进行后续蛋白质组学表征，同时排除未形成复合物的单个蛋白质以及与竞争性结合伴侣形成的复合物。

BiCAP 技术可适用于多种下游实验分析，该技术提供的高特异性使得对蛋白质复合物组装机制的研究比目前使用标准亲和纯化技术所能实现的更为精细。

引言

蛋白质复合物的组装是维持许多信号通路时空特异性的关键过程^1,2。尽管这一调控作用的重要性已被广泛认可，但目前可用于深入研究这些复合物的实验技术仍然匮乏。大多数相互作用组学研究集中于单个蛋白质之间的相互作用，或对复合物各个组分进行逐个富集。本文介绍一种可特异性分离特定蛋白质二聚体的技术，同时排除各组分蛋白的单体形式以及与竞争性结合伴侣形成的其他复合物³。我们将该技术命名为双分子互补亲和纯化技术（Bimolecular Complementation Affinity Purification, BiCAP），因为它结合了已有的蛋白质片段互补检测方法——双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）——以及一种针对绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物的构象特异性重组纳米抗体的创新应用（参见材料表）。

典型的蛋白质片段互补检测依赖于“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白的表达，这些蛋白分别与报告分子（如荧光素酶⁴、β-半乳糖苷酶⁵或绿色荧光蛋白（GFP）⁶）的分裂片段融合（

方案

1. 质粒克隆

注意：为了构建在目的基因的N端或C端融合V1或V2标签的质粒载体，双分子荧光互补（BiFC）目的载体已存入Addgene [N端标签：pDEST-V1-ORF (#73635)，pDEST-V2-ORF (#73636)；C端标签：pDEST-ORF-V1 (#73637)，pDEST-ORF-V2 (#73638)]。目的基因需要位于特定的可用于重组克隆的入门载体中即， pDONR223 或 pENTR221），不含终止密码子，以进行后续克隆。许多相容性克隆已存在于各类质粒文库中，包括哺乳动物基因组文库（https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/）。

1. 在相应的BiFC目的载体的attR位点之间插入目的基因，进行重组反应：
   1. 在0.2 mL离心管中，加入150 ng入门载体、150 ng BiFC目的载体以及 8 µL TE缓冲液（pH 8.0）
   2. 添加 2 µL 重组酶混合液（参见 材料表充分混匀后短暂离心。
   3. 在室温下孵育反应1小时，或在 16 °C 过夜。
   4. 通过添加终止反应 1 µL 蛋白酶K溶液并孵育于 37 °C 10 分钟
2. 转化热激感受态细胞（参见 材料表）与LR反应产物：....

结果

在利用重组克隆技术将目的基因的V1和V2标签与BiFC pDEST质粒构建完成后，共转染含有相互作用蛋白对的两种质粒，大约8-24小时后可观察到Venus荧光信号的产生。若未检测到阳性信号，可能的原因包括：蛋白相互作用未发生、细胞系选择不当、转染效率过低，或BiFC标签的方向不够理想。以下将针对上述各种情况进行故障排查说明。

我们此前观察到，在HEK-293T细胞共转染约16小时后，多种不同类型的蛋白质之间存在正向相互作用。这包括RTK ERBB2在质膜上的二聚化图 3A)³ 以及泛素与主要位于细胞核内的E3连接酶UBR5的结合（图3A)¹²能够观察到这些蛋白质-蛋白质相互作用的特定亚细胞定位，而非全长Venus蛋白的全细胞荧光（

讨论

BiCAP 是一种强大的方法，可用于分离特定的蛋白质二聚体，同时排除其单个组分及竞争性结合伴侣³。BiCAP 基于对一种称为 BiFC 的荧光蛋白互补检测技术的改进⁶。现有方法（包括 BiFC 和邻近连接检测）已被广泛用于在活细胞中可视化和定量蛋白质相互作用⁷，但无法有效分离并表征这些相互作用所形成的二聚体。

基于蛋白质互补的亲和纯化技术也在不断发展。Schopp 等人近期描述了一种利用 BioID¹⁴ 进行蛋白质二聚体邻近标记的系统。通过将生物素连接酶 BirA 的分裂片段分别与两个相互作用的蛋白质融合，他们实现了对包含 Ago2、参与 miRNA 介导的基因沉默的蛋白质复合物的选择性富集。Split-BioID 与 BiCAP 互补：Split-BioID 可富集处于 BioID 邻近范围内的蛋白质，而 BiCAP 则富集直接的复合物相互作用蛋白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LR Clonase II Plus 酶	Thermo Fisher Scientific	12538120	Gateway 克隆（第一步）进入 pDEST BiFC 目的载体所需的重组酶
蛋白酶 K，重组，PCR 级	Thermo Fisher Scientific	EO0491
14 mL 圆底聚丙烯管	Corning	352059
氨苄青霉素	Roche Diagnostics Australia	10835242001	用蒸馏水配制为 100 μg/mL 的储存液。
质粒小提试剂盒	Promega Corporation	A1330
质粒大提试剂盒	Life Technologies Australia	K2100-07
DMEM	Gibco	11995-073
FBS	Life Technologies Australia	10099-141
青霉素/链霉素	Life Technologies Australia	15070-063
jetPRIME 转染缓冲液	Polyplus	114-15
jetPRIME 转染试剂	Polyplus	114-15
PhosSTOP（磷酸酶抑制剂）	Sigma-Aldrich	4906837001
cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11873580001
细胞刮刀	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	gta-100	偶联于琼脂糖微珠的 GFP 纳米抗体
N 端 GFP 单克隆抗体	Covance	MMS-118P	可检测 BiFC 载体中的 V1 标签
C 端 GFP 单克隆抗体	Roche	11814460001	可检测 BiFC 载体中的 V2 标签
上样缓冲液	Invitrogen	NP0008	添加 1 mL β-巯基乙醇。
测序级修饰胰蛋白酶	Promega Corporation	V5117h
LoBind 微量离心管	Point of Care Diagnostics	0030 108 116
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149-5G	用超纯水配制成 5 mg/mL 溶液
三氟乙酸 - 测序级	Thermo Fisher	10628494
3M Empore 固相萃取 C18 圆盘（十八烷基）- 4.7 cm	Thermo Fisher	14-386-2	用于制备 stage tips，使用合适尺寸的打孔器切割出 1 mm 圆盘。或者，也可直接购买预装好的 stage tips，见下文。
C18 Stage Tips，10 µL 填料	Thermo Fisher	87782
甲酸 OPTIMA LC/MS 级 50 mL	Thermo Fisher	FSBA117-50
1.9 μm C18 ReproSil 颗粒	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.	固定相颗粒
乙腈 OPTIMA LC/MS 级	Thermo Fisher	FSBA955-4
Easy-nLC HPLC	Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	非离子型去垢剂（100%）
DH5α 感受态细胞	Thermo Fisher		热激感受态细胞