脂肪酸13C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

摘要

脂肪酸营养标记方法 即， 以完整分子形式同化脂肪酸并将其转移至消费者组织而几乎不发生修饰的过程，因对小型土壤无脊椎动物脂肪酸代谢的认知空白而受到阻碍。同位素异构体分析被作为一种有效工具，用于解析营养相互作用。

摘要

脂肪酸（FAs）在食物网生态学中是重要的生物标志物，因为它们通常以完整分子形式被同化，并几乎不加修饰或仅轻微修饰地转移到消费者组织中，从而能够揭示不同营养级之间的食物来源路径。然而，脂肪酸营养标记方法的应用仍受限于对土壤动物脂质代谢知识的不足。本研究采用了完全标记的棕榈酸（palmitic acid）¹³C16:0，99 原子%）作为两种广泛分布的土壤弹尾虫脂肪酸代谢途径中的示踪剂， Protaphorura fimata 和 Heteromurus nitidus为了研究该前体的命运及其代谢修饰，本文介绍了一种通过质谱单离子监测进行的同位素异构体谱型分析方法。此外，还描述了上游的实验室饲喂实验，以及主要脂质组分（中性脂质、磷脂）的提取与甲基化处理，及相关公式与计算方法。同位素异构体谱型分析不仅能够提供整体 ¹³脂肪酸中衍生的C富集 ¹³C标记的前体，还会产生超过母离子质量的同位素异构体模式（即， FA分子离子M⁺每种标记脂肪酸（FA）的质量数增加一个或多个质量单位（M⁺¹，M⁺²，M⁺³, 等等。）。这一知识可用于推断某种完全被摄入的脂肪酸在饮食分配中的比例，相较于 从头合成 生物合成。同位素异构体分析被建议作为一种有效工具，用于评估土壤动物脂肪酸代谢，以解析营养相互作用。

引言

在土壤等隐蔽生境中，营养关系难以明确，且常因动物体型微小而进一步受限。近十年来，化学生态学取得了进展，尤其是在利用脂肪酸作为生物标志物来确定田间条件下土壤动物摄食策略方面的应用^1,2,3。该方法基于一个事实：资源中的脂肪酸可作为完整分子被整合到消费者组织中，这一过程称为饮食途径转移⁴。已有研究报道脂肪酸可在三个营养级间传递，i.e., 从真菌到线虫再到弹尾纲动物⁵。最近，研究开始关注捕食性动物类群^6,7，并已发表关于脂肪酸作为土壤食物网营养标记物的首批综述文章^8,9。

通过脂肪酸稳定同位素探针技术（FA-SIP）可获得更详细的营养相互作用信息。该方法的测定 ¹³C/¹²饮食和消费者中脂肪酸的碳同位素比值可用于确定二元联系并估算相关的碳流动，该方法已应用于陆地、淡水和海洋食物网

方案

所述方案不属于动物伦理委员会的管辖范围。然而，当人们将所述方案应用于较高等动物时，需确保该动物操作方案已获得机构动物伦理委员会的批准。

1. 动物培养

注意：所有阐述的实验步骤均基于成熟的实验方案^26,27,28。实验室内的生物测定需要持续供应易于培养的生物体。本研究中采用了弹尾纲物种Protaphorura fimata (Gisin, 1952) 和 Hetermurus nitidus (Templeton, 1835)。这两种物种易于维持，可作为以酿酒酵母为食的高效实验室培养种群。

1. 在带有紧密盖子的塑料微宇宙装置（直径 7 cm，高 4.5 cm）中，加入活性炭、熟石膏和蒸馏水的混合物，以提供高度湿润的繁殖基质（图1A).
   1. 制备微宇宙时，混合足量的基质， 例如， 用于一批中的10个微宇宙实验。在石膏容器中将9份熟石膏（225 g）与1份干燥的活性炭（25 g）混合，小心加入约10份蒸馏水（250 mL），于室温下静置5分钟，期间不搅拌。
   2. 用实验勺以....

结果

弹尾虫的鲜重和脂质含量
在本项描述的实验过程中，非长链脂肪酸（NLFAs）和磷脂脂肪酸（PLFAs）的含量随时间推移未发生显著变化，而弹尾虫个体的鲜重略有增加，但差异不显著²⁴。这两个参数均表明弹尾虫个体具有良好的生理健康状态。请注意，在整个实验过程中应定期测定弹尾虫的鲜重和脂质含量，以对应脂肪酸和同位素分析的采样时间点。需注意的是，若在实验期间出现体重下降和/或脂质含量降低，表明测试生物体的健康状况下降，所获得的数据将显著降低其科学意义。

同位素异构体检测
同位素异构体谱分析项目的特殊意义在于能够对特定脂肪酸中的分子离子及其所有同位素异构体进行 individually 检测与定量。例如，在16:0的情况下，离子的质量范围从270开始， 即， 分子离子 M⁺ （主要由C骨架构成的 .......

讨论

同位素异构体分析

对脂肪酸（FAs）中¹³C分布的定量特征进行详细分析，需要前沿技术以确定食物网中的碳分配。本研究采用同位素异构体谱分析法（isotopologue profiling），评估常见脂肪酸生物标志物中用于营养级相互作用研究的¹³C/¹²C比值。该方法在利用液相色谱（LC-MS）进行氨基酸分析方面已较为成熟，并已被用于病原性细菌碳代谢的研究^17,23。直至最近，Menzel et al.²⁴才进一步发展该技术，将其作为研究小型土壤无脊椎动物体内脂质膳食分配的工具。由于该方法不受¹³C信号“残留”效应的干扰，因此相较于气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）³²，在评估特定同位素高度富集的有机组织时具有优势。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
neoLab-圆形广口瓶	neoLab	2-1506	69 x 40 mm，每包10个
活性炭	Carl Roth	X865.1	p.a.，粉末，CAS编号 7440-44-0
熟石膏牙科用	RÖHRICH-GIPSE	---	http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
氯仿	Carl Roth	7331.1	HPLC ≥ 99.9%
甲醇	Carl Roth	P717.1	HPLC ≥ 99.9%
己烷	Carl Roth	7339.1	HPLC ≥ 98%
tert-丁基甲基醚（MTBE）	Carl Roth	T175.1	HPLC ≥ 99.5%
丙酮	Carl Roth	7328.2	HPLC ≥ 99.9%
NaOH	Carl Roth	6771.1	p.a. ≥99%，颗粒状
磷酸氢二钠	Carl Roth	P030.1	p.a. ≥99%，无水
磷酸二氢钠二水合物	Carl Roth	T879.1	p.a. ≥99%
次氯酸（6 N）	VWR International	26,115,000	AVS TITRINORM 体积溶液
Bond Elut（柱）	Agilent Tech.	14102037	HF Bond Elut-SI，500 mg，3 mL，每包50个
Präparatengläser Duran	Glasgerätebau Ochs	135215	Ø 16 x 100 mm，带螺纹盖，配有方便的滚花和集成PTFE/硅胶垫圈
Supelco 37组分FAME混合物	Sigma-Aldrich	47885-U Supelco	10 mg/mL 溶于二氯甲烷，分析标准品
FlowMesh	Carl Roth	2796.1	聚丙烯网，厚度约0.3 mm，丝间距1 mm
细菌酸甲酯（BAME）混合物	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco	10 mg/mL 溶于己酸甲酯，分析标准品
十九烷酸甲酯	Sigma-Aldrich	74208	分析标准品 ≥ 98.0%
1-13C标记棕榈酸（十六烷酸）	Larodan Fine Chemicals	78-1600	GC ≥ 98.0%（13C：99.0%）
RVC 2-25 CDplus	Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen		紧凑型台式中试浓缩仪
Alpha 2-4 LDplus	Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen		干燥歧管
MZ 2C NT	Vacuubrand GMBH		真空泵
Roto-Shake Genie	Scientific Industries		摇动与旋转组合装置
XP64 微型比较仪	Mettler Toledo		超高精度天平
GC-系统 7890A	Agilent Tech.		气相色谱仪
7000 GC/MS 三重四极杆	Agilent Tech.		三重四极杆质谱仪
7683B系列进样器	Agilent Tech.		样品进样器
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Scientific		带10 mL试管转子的离心机