本方案描述了一种简单且实用的方法，用于保存外周血和血清/血浆，以便进行后续分析，如单核苷酸多态性（SNP）检测和ELISA实验。
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本文内容
摘要
摘要
血液样本的质量对于确保下游分析（如实时 PCR 或 ELISA）结果的准确性至关重要。正确保存生物材料是获得可重复且可靠结果的基础。从血液采集到储存的整个过程，所有样本均应采用相同的方式处理。根据拟进行的分析类型，全血和血清样本应保存在 -20 °C 或 -80 °C，直至使用。血液/血清样本还应进行分装，以避免反复冻融。另一个重要问题是样本在不同实验室之间运输过程中的保存条件。如果无法使用干冰，或运输时间超过数天，则需要采用替代方案。一种选择是使用滤纸进行血液采集。本文提出一种利用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）进行血液和血清样本采集的方法。我们已建立从 DBS 中提取 DNA 的操作流程，并用于后续通过实时 PCR 检测若干单核苷酸多态性（SNPs）。此外，我们还优化了从 DSS 洗脱蛋白后进行 ELISA 检测的实验方案。该方法也可适用于其他 ELISA 检测或蛋白质分析流程。
引言
癌症生物标志物研究的主要目标是鉴定可用于诊断、预测患者预后以及判断患者是否会对特定治疗产生反应的新生物学参数。该研究领域对于发现创新性癌症治疗方法至关重要，并在个体化治疗中发挥关键作用。
生物标志物鉴定与验证的每一步操作都必须可靠且可重复。转化医学研究成功的关键在于正确储存血液和血清等生物样本。这是获得高质量生物材料的第一步，这些材料可用于开展分子生物学实验或蛋白质检测。
多中心研究通常需要招募足够数量的患者，以获得可靠的数据。并非所有研究机构都具备在 -80 °C 下保存样本的能力，或无法使用干冰将样本送往其他国际中心。使用滤纸采集血液是一种简单保存血液和血清的方法，无需立即冷冻样本1,2。只需将一滴血液或血清点在滤纸上，过夜干燥后，可在室温下保存长达14天1,2。这为研究人员提供了将样本寄送至其他实验室的时间。因此，使用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）可简化发达国家与发展中国家各研究机构之间的合作。
由于操作简便，干血斑（DBS）取样已广泛应用于多种血清学或遗传学下游分析检测。例如，过去干血斑常用于发展中国家的HIV筛查1,2,3,4,5。该储存方法的另一优势在于，血液样本可通过指尖采血获得，因而适用于新生儿筛查6,7,8。样本易于处理和运输是干血斑的进一步优势，尤其适用于在缺乏实验室设备的偏远地区采集的样本。在之前的一项研究中，我们曾利用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）检测一系列高加索人和非洲患者的维生素D及其维生素D结合蛋白（DBP）9。我们的非洲同事无法获得干冰。为了比较生物标志物，以了解两种族人群之间维生素D代谢通路的差异，我们进一步优化了实验流程，采用在标准条件下保存以及保存在滤纸上的配对样本进行分析。在优化干血斑/干血清斑操作流程后，我们得以在两组患者血清中成功检测DBP和维生素D。此外，在从高加索人全血和非洲人干血斑提取DNA后，我们还评估了多个单核苷酸多态性（SNPs）位点9。本方案可实现高质量血液样本在室温下的长期保存，且不影响从分子生物学实验到ELISA检测等多种下游分析。该方法推荐用于多中心研究中的生物样本管理，或用于不具备标准储存条件的实验中心。以下方案即为上述优化流程的最终整合。
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方案
采集并保存了健康供者和患者的外周血及血清，所有供者和患者均签署书面知情同意书，同意参与本研究。研究方案经当地伦理委员会批准，符合1964年《赫尔辛基宣言》中规定的伦理标准。
1. 干血斑中的血液储存
- 血液样本采集
- 使用含有5.4 mg乙二胺四乙酸（EDTA）的3 mL试管采集3 mL外周血样本。
注意：应尽快将外周血制成干血斑（DBS），最迟不超过8小时。 - 在保存卡的右下角写上患者代码编号。
- 用5 mL移液器小心重悬血液。
- 使用含有5.4 mg乙二胺四乙酸（EDTA）的3 mL试管采集3 mL外周血样本。
- 在DBS卡上点样血液
- 使用50–200 µL吸头，通过移液将一滴血液（50 µL）转移至保存卡（材料表）上。
- 重复步骤1.2.1，共制备3–5个血斑。每次吸取血液时均需丢弃旧吸头并更换新吸头。
- 将DBS卡水平放置于开放的非吸附性表面上，在室温下过夜晾干，避免阳光直射。保持保存卡盖子打开，以促进血液干燥。
注意：此干燥过程中空气中的微粒或灰尘不会影响后续应用。 - 将保存卡置于含干燥剂的塑料袋中，室温保存直至使用。
2. 根据DNA提取试剂盒说明书（干血斑部分）从干血斑开始进行DNA提取
- 样本制备
- 使用采血卡上的3个干血斑。用镊子将每个干血斑从卡片上剪下，并剪成小碎片（直径约1 mm）。
- 将剪碎的样本放入1.5 mL离心管中。
- 样本消化
- 向离心管中加入180 µL试剂盒提供的裂解缓冲液1（材料表）。再加入20 µL蛋白酶K。在将溶液加入含有血斑的1.5 mL离心管前，切勿将裂解缓冲液1与蛋白酶K预先混合。通过涡旋振荡充分混匀。
- 将离心管放入恒温孵育器中，在56 °C下孵育60分钟。若恒温孵育器无振荡功能，则每10–15分钟涡旋振荡一次，每次至少10秒，注意避免样本温度下降。短暂离心以去除管盖上的液滴。
- 洗涤步骤
- 加入200 µL裂解缓冲液2（材料表），涡旋振荡10秒。
- 将离心管放入恒温混匀器或加热振荡孵育器中，在70 °C下孵育10分钟。若孵育器无振荡功能，则至少涡旋振荡一次，持续至少10秒，注意避免样本温度下降。
- 重复步骤2.3.1。将400 µL裂解液从1.5 mL离心管转移至洗脱柱（材料表）。以6,000 × g离心1分钟。
- 将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。
- 加入500 µL洗涤缓冲液1（材料表），以6,000 × g离心1分钟。
- 将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。
- 加入500 µL洗涤缓冲液2（材料表），以6,000 × g离心1分钟。
- 将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。
- 以20,000 × g离心3分钟，以干燥膜。
- 洗脱步骤
- 将洗脱柱放入新的1.5 mL离心管中，弃去收集管。
- 将50 µL去离子水加至膜的中心位置，在室温下孵育10分钟。
- 以20,000 × g离心1分钟。收集洗脱液并再次加至膜的中心位置。
- 以20,000 × g离心1分钟，弃去洗脱柱。
- 使用分光光度计测定DNA浓度。
- 将DNA于-20 °C保存直至使用。
注意：从干血斑（DBS）提取的DNA可用于多种分析，如通过实时PCR进行SNP检测或DNA Sanger测序。
3. DSS 的血清储存
- 血液样本采集
- 在不含EDTA的7 mL试管中采集7 mL外周血样本。将血液样本在室温下静置凝固30分钟。
- 在保存卡右下角写上患者代码编号。
- 在室温下以980 × g 离心15分钟。
注意：应尽快将血清作为干血清斑（DSS）保存，且不得超过8小时。 - 小心移除试管中的上清液，并转移至新的15 mL试管中。使用5 mL移液器小心重悬血液。
- 在DSS上进行血清点样
- 用移液器吸取并转移一滴血清（50 µL）至保存卡上。重复此步骤，共制备3–5个血清斑。
注意：务必精确移取每滴50 µL血清。血清不应超出卡片上的虚线范围。 - 将DSS在室温下过夜晾干。保持保存卡盖子打开，以促进血液干燥。
- 将卡片置于含干燥剂的塑料袋中，于室温保存至使用。若保存时间超过14天，应将卡片储存在-20 °C。
- 用移液器吸取并转移一滴血清（50 µL）至保存卡上。重复此步骤，共制备3–5个血清斑。
4. 从 DSS 开始的 ELISA 检测
- 从DSS中洗脱蛋白质。
- 如有必要，将每个样品的DSS解冻。将DSS切成小块（直径约1 mm），放入含有400 µL PBS的1.5 mL离心管中。
- 在4 °C下轻轻振荡过夜。
注意：振荡强度应较低，避免PBS润湿管盖。
- 根据ELISA试剂盒说明书，将蛋白洗脱液经适当稀释后作为血清样品用于分泌蛋白/生长因子分析。
注意：该方法适用于DBP检测9；对于其他ELISA检测，可能需要进行优化步骤。
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结果
我们利用干血片（DBS）和干血清片（DSS）技术，在室温下储存血液和血清，且不影响生物材料的质量。图1展示了蛋白保存卡在采血前和采血后的示例。为了验证滤纸储存及血液洗脱操作不会影响样本质量，我们将其与标准储存方法进行了比较。根据方案部分所述，我们从3份配对样本中提取了DNA，这些样本的全血分别采集于2 mL离心管中或以DBS形式储存。通过实时PCR分析了5个单核苷酸多态性（SNP）位点。配对样本所得数据的一致性达到100%。
关于ELISA分析，我们保存了8份血清样本，这些样本采集于2 mL离心管中（立即于-80 °C保存），以及干燥血清斑点（DSS）（室温保存一周后转移至-20 °C）。我们按照方案部分所述方法从DSS中洗脱蛋白质，随后根据试剂盒制造商提供的DBP检测说明书对这8份样本进行ELISA检测。结果如表1所示。配对样本间的变异系数（CV）范围为2%...
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讨论
本方案探讨了在实验室缺乏处理血液样本所需人员或基础设施的情况下，将血液和血清储存在滤纸上的可行性。具体而言，采用标准试管或指尖采血方式采集的全血或血清均可使用此方法储存，且无需在采血后立即将样本冷冻于-20 °C或-80 °C。干血斑（DBS）/干血清斑（DSS）在室温下可稳定保存长达14天，而血液/血清的完整性不受影响。储存过程中的一个关键问题是水分的存在，其对生物材料性质的影响大于温度。该问题可通过使用含干燥剂的塑料袋来避免。当卡片置于塑料袋内时，水分问题即可得到有效控制。在过夜孵育过程中，未观察到空气中的颗粒物、液滴、灰尘或湿气所导致的问题10。我们此前曾在针对意大利和非洲队列人群的生物标志物研究中，使用滤纸储存血液和血清样本11。我们优化了从DBS中提取DNA的方法，并在两个病例系列中分析了多个单核苷酸多态性（SNPs）。由于我们同时关注蛋白水平的评估，因此进一步优化了从DSS中洗脱蛋白质的方法，以用于ELISA检测。用于ELISA检测的DSS血清储存比用于定性分析的全血储存更为精细，因为实验人员必须确保在所有样本中移取完全等量的血清...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Gráinne Tierney 提供的编辑协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Whatman 蛋白质保存卡 903 型，100 片/包 | Sigma | Z761575 | 适用于在室温下保存样本，用于后续分析 |
| Falcon 血清移液管，5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL 吸头 | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA 微量提取试剂盒 | Qiagen | 56304 | 这是一种用于分离微量 DNA 的 DNA 提取试剂盒 |
| Buffer ATL（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中） | Qiagen | 在文中称为裂解缓冲液 1 | |
| Buffer AL（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中） | Qiagen | 在文中称为裂解缓冲液 2 | |
| QIAamp mini elute 柱 | Qiagen | 在文中称为柱 | |
| AW1 （包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中） | Qiagen | 在文中称为洗涤缓冲液 1 | |
| AW2 （包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中） | Qiagen | 在文中称为洗涤缓冲液 2 | |
| 人维生素 D 结合蛋白 Quantikine ELISA 检测试剂盒 | R&D systems | DVDBP0 |
参考文献
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重印与许可
