本文提供了一种针对天然产物的单克隆抗体的制备与评价的详细实验方案，可用于多种免疫分析。该流程包括免疫接种、细胞融合、用于阳性克隆筛选的间接竞争ELISA以及单克隆杂交瘤细胞的制备。同时提供了利用MALDI-TOF-MS和ELISA分析对抗体进行表征的技术参数。
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摘要
摘要
食品和天然产物中生物活性成分的分析已成为传统中医、食品安全/毒理学等多个研究领域的热点。许多经典分析技术需要昂贵的设备和/或专业技术。值得注意的是，酶联免疫吸附测定（ELISA）已逐渐成为分析食品和天然产物的一种新兴方法。该方法基于抗体介导的目标成分检测。然而，由于天然产物中的许多生物活性成分分子量较小（<1,000 Da）且不诱导免疫反应，因此针对它们制备单克隆抗体（mAbs）通常较为困难。在本方案中，我们详细阐述了生成针对目标分子的单克隆抗体所需的各个步骤，以及建立相应间接竞争性（ic）ELISA 方法以快速分析多种样品中该化合物所需的流程。本方法描述了人工抗原的合成（即， 半抗原-载体偶联物的制备、免疫、细胞融合、单克隆杂交瘤的制备、单克隆抗体（mAb）的表征及其基于ELISA的应用。采用高碘酸钠法合成半抗原-载体偶联物，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定。免疫后，从抗体效价最高的免疫小鼠中分离脾细胞，并采用聚乙二醇（PEG）介导的方法将其与对次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）敏感的小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14进行融合。通过间接竞争ELISA（icELISA）筛选分泌针对目标抗原的特异性及交叉反应性mAb的杂交瘤细胞。进一步采用有限稀释法克隆单克隆杂交瘤。最终获得的单克隆抗体通过icELISA进一步表征，并用于建立基于ELISA的方法，以快速、便捷地检测天然产品中的示例性半抗原（柚皮苷（NAR））。
引言
单克隆抗体（mAbs），也称为单特异性抗体，由单一B淋巴细胞克隆产生，由结合相同表位的单价抗体组成1。近年来，许多源自药用植物的天然产物已被用于治疗多种疾病2。事实上，许多最初来源于天然产物的小分子化合物现已被用作一线药物，例如用于治疗疟疾的青蒿素和用于癌症治疗的紫杉醇（taxol）2,3。天然产物研究已取得快速进展，这主要得益于传统分析技术的巨大发展和优化，包括高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）。然而，这些方法仍存在一些局限性，例如复杂的前处理步骤，以及在时间、人力/专业技术及所需仪器方面的高昂成本4。
近年来，基于单克隆抗体（mAb）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）已被用于对食品和天然产物进行定性和定量分析。事实上，该方法已应用于生物样本分析和临床检测，具有准确、灵敏、高效的特点，同时避免了其他分析方法所需的繁琐前处理步骤5,6。
在使用基于单克隆抗体（mAb）的ELISA方法研究复杂天然产物时，制备单克隆抗体是其中的核心步骤之一。然而，针对此类物质中所含的小分子生物活性成分的特异性单克隆抗体，其可获得性通常远低于针对蛋白质抗原的抗体6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。为克服这一问题，我们开发了一种专门用于制备针对小分子化合物的单克隆抗体的技术方案。本文所述方案包括人工抗原合成、小鼠免疫、细胞融合、间接竞争性ELISA以及单克隆杂交瘤细胞的制备。
值得注意的是，我们研究团队多年来一直致力于研究针对传统中药中小分子活性化合物的单克隆抗体（mAbs）的制备，并开发其应用。在目前持续开展的研究中，我们已成功制备出针对黄芩苷16、葛根素17、甘草酸18、芍药苷19、人参皂苷Re20、人参皂苷Rh121以及多种其他小分子化合物的单克隆抗体。基于这些单克隆抗体建立的ELISA检测方法已被广泛应用于多项研究中，用于评估这些小分子的药代动力学特性及其与其他生物活性化合物之间的相互作用。此外，利用这些单克隆抗体，我们还开发了免疫亲和色谱方法，用于分离结构类似物，包括差向异构体。最近，我们利用抗葛根素单克隆抗体构建了一种侧向流动免疫分析法，并成功实现了对该化合物的快速、现场检测。研究结果表明，基于单克隆抗体的检测技术是研究天然产物来源化合物生物学特性及质量控制不可或缺且便捷有效的工具，尤其适用于传统中药中的活性成分研究。
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方案
本研究中所有动物实验程序均已获得北京中医药大学伦理审查委员会的批准（批准编号：2016BZYYL00109）。
注意：使用半抗原-载体蛋白偶联物免疫雌性 BALB/c 小鼠（8 周龄）。小分子（<1,000 Da）单独使用时无法引发免疫反应。然而，将小分子与载体大分子偶联后可实现抗原合成。在此背景下，该小分子被称为半抗原。半抗原偶联是单克隆抗体（mAb）制备中必要且有效的策略。为避免交叉反应，应使用两种不同的蛋白质载体（如牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA），或钥孔血蓝蛋白（KLH）和 BSA）分别作为免疫原（用于动物免疫）和包被抗原（用于包被酶标板以检测抗血清）。本实验方案以 BSA 和 OVA 为例进行说明。
1. 免疫原和包被抗原的制备
注意：对于人工抗原合成，应使用相应的官能团（例如，以羟基、巯基、羧基或氨基作为侧臂，与载体蛋白进行共价结合。常用的偶联方法包括高碘酸盐氧化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、戊二醛法和琥珀酸法。本实验方案以柚皮苷（NAR）为例，柚皮苷是一种广为人知的黄烷酮糖苷，分子量较小（581 Da），存在于柑橘类水果及多种传统中药中。
- 采用高碘酸盐氧化法合成NAR-BSA和NAR-OVA偶联物。
- 将50 mg NAR溶于水中，终浓度为1 mg/mL22。
- 向5 mL NAR溶液中加入100 µL新配制的高碘酸钠溶液（0.1 M），室温下搅拌反应1小时。
- 将4 mg BSA和OVA分别溶于2.0 mL 50 mM碳酸盐缓冲液（pH 9.6）中，将该蛋白溶液加入NAR/高碘酸钠反应混合物中。
- 用1 M Na2CO3溶液调节混合物pH至9，室温下搅拌6–8小时。
- 将反应混合物使用透析膜（截留分子量10 kDa）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中透析3天，以置换CBS缓冲液。
- 采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析半抗原-载体偶联物。
- 将1–10 pmol偶联物与摩尔过量103倍的芥子酸在含0.15%三氟乙酸（TFA）的水溶液中混合，将混合物在样品板上自然干燥。
- 使用配备脉冲氮激光器（波长337 nm）的MALDI-TOF质谱仪进行分析。按照先前所述方法22，在线性模式下采集质量范围（m/z）为15,000–100,000的正离子MALDI质谱图。
2. 免疫接种
注意：共使用5只BALB/c雌性小鼠（8周龄）：其中4只用于NAR偶联物免疫，1只用于对照（PBS）免疫。
- 首次免疫时，将50 µg偶联物（溶于100 µL PBS中）与等体积的完全弗氏佐剂（CFA）混合，并充分乳化。每只小鼠注射100 µL该混合液。 通过 背部皮下注射
- 两周后，给予加强免疫接种（100 µL） 通过 皮下注射等量与不完全佐剂（IFA）混合的偶联物。
- 7天后从每只小鼠尾静脉抽取200 µL血液以获取血清。
- 以 3,000 x g 离心血液 10 分钟。将血清上清液转移至新的离心管中。
- 使用ELISA按照先前所述方法分析血清21选择血清效价最高的小鼠用于细胞融合。
- 在进行细胞融合前，对选定的小鼠进行脉冲式免疫接种 通过 融合前3天，在无佐剂条件下，于300 µL PBS中腹腔注射50 µg偶联物。
注意：如果滴度足够高，此步骤可以省略。
3. 细胞融合的准备
- 细胞融合培养基的制备
- 配制次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基：将50倍浓缩的HAT培养基添加剂溶解于10 mL RPMI-1640培养基中，然后将此混合液加入含有20%胎牛血清（FBS）的500 mL RPMI-1640培养基中。
注：当10 mL的50倍浓缩液稀释至500 mL培养基中时，次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的终浓度分别为100 µM、0.4 µM和16 µM。 - 配制次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HT）培养基：将50倍浓缩的HT培养基添加剂溶解于10 mL RPMI-1640培养基中，然后将此混合液加入含有20%胎牛血清（FBS）的500 mL RPMI-1640培养基中。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的终浓度分别为100 µM和16 µM。
- 配制次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基：将50倍浓缩的HAT培养基添加剂溶解于10 mL RPMI-1640培养基中，然后将此混合液加入含有20%胎牛血清（FBS）的500 mL RPMI-1640培养基中。
- Sp2/0-Ag14细胞的培养
- 在细胞融合前至少7天，将一管液氮冻存的SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞在温水中快速解冻。
- 将细胞悬液转移至5 mL新鲜培养基（RPMI-1640）中，于1000 × g离心10分钟。
- 离心后弃去上清液，用含10%胎牛血清（FBS）的新鲜RPMI-1640培养基重悬细胞。
- 将细胞和培养基转移至25 cm2培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 在细胞融合前将细胞扩增至3至4个75 cm2培养瓶。
- 腹腔饲养层细胞的制备
- 在细胞融合前一天，通过颈椎脱臼法处死一只12周龄的白色ICR小鼠，并将其浸入75%乙醇中消毒。
- 用止血钳去除腹部毛发后，用75%乙醇对腹部区域进行消毒。剪开外层皮肤以暴露腹腔，向腹腔内注射3 mL无菌RPMI-1640培养基，轻轻按摩腹部以使更多细胞脱落进入液体中。将饲养细胞悬液吸出并转移至15 mL离心管中。
- 将细胞悬液在1000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，用20 mL HAT选择性培养基重悬饲养细胞。
- 将细胞接种至96孔细胞培养板中（每孔100 µL），在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
4. 细胞融合
- 在选定的免疫小鼠完成细胞融合前准备后（见步骤2.4），经腹腔注射10%水合氯醛（麻醉剂），处死该免疫小鼠 通过 颈椎脱位
- 从心脏收集额外的血液（1 mL），并按照步骤 2.3.1 中所述方法制备血清，用于杂交瘤筛选过程中的阳性对照。
- 用剪刀去除皮肤和肌肉组织，暴露脾脏。
- 用镊子小心分离脾脏，并用RPMI-1640洗涤脾脏。将脾脏切成小块，缓慢研磨以充分破碎。通过800目细胞筛网将脾组织压入50 mL离心管中，制备脾细胞悬液。
- 用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞悬液。离心收集脾细胞（1000 × g，10分钟，4 °C），弃去上清液。重复洗涤步骤三次。
- 从培养箱中取出培养并扩增的骨髓瘤细胞，轻轻振荡或摇动培养瓶以获得细胞悬液。用 RPMI-1640 培养基洗涤该悬液两次，以去除胎牛血清（FBS）。
注意：此步骤至关重要，因为胎牛血清（FBS）可能影响细胞融合。 - 计数细胞并在与脾细胞混合前调整浓度。脾细胞与骨髓瘤细胞的最终比例应在1:5至1:10之间。
- 将脾细胞悬液与骨髓瘤细胞混合。离心细胞混合物（1000 × g，10 分钟，4 °C），弃去上清液。
- 加入1 mL 50%聚乙二醇（PEG）溶液至细胞中，于37 °C轻轻搅拌1分钟，静置30秒。
注意：此步骤中使用的 PEG 溶液应包含 50% (w/v) 聚乙二醇 1500 和 10% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)，溶于不含钙 (Ca2+). - 加入2 mL RPMI-1640培养基，孵育2分钟以终止反应；再加入2 mL RPMI-1640培养基，继续孵育1分钟，随后加入10 mL RPMI-1640培养基。
- 以 800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液后，加入 HAT 溶液继续培养细胞。随后将 100 µL 细胞悬液加入饲养层培养板的每孔中，并将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 7 天。2.
注意：在此条件下，未融合的骨髓瘤细胞将会死亡，而杂交瘤细胞将在HAT培养基中继续生长。7天后，单克隆杂交瘤将形成单个细胞簇，而含有多克隆杂交瘤的孔中则会出现多个细胞簇。 - 吸走上清液用于分析，并用HT培养基替换。
注意：务必先将HAT培养基替换为HT培养基，因为直接更换为未补充的培养基会对杂交瘤细胞造成不利影响。
5. 间接竞争性ELISA（icELISA）
- 用 NAR-OVA（1 µg/mL，100 µL/孔）包被 96 孔板，在 37 °C 下孵育 1 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
- 加入 300 µL GPBS（含 1% m/v 明胶的 PBS）封闭板孔，37 °C 下孵育 1 小时，以防止非特异性吸附。
- 用 TPBS（含 0.05% v/v Tween-20 的 PBS）洗涤板孔三次。
- 将未标记的 NAR 用含 10% 甲醇的溶液稀释成一系列浓度，每孔加入 50 µL；在其他孔中，每孔加入 50 µL 抗血清或杂交瘤上清液（含 mAbs）。在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 每孔加入 100 μL 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠 IgG，并额外孵育 1 小时。
- 用 TPBS 洗涤板孔三次后，每孔加入 100 µL 显色底物溶液（含 0.015% v/v H2O2 和 2 mg/mL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的 0.1 M 柠檬酸缓冲液（pH 4）），孵育 15 分钟。
- 每孔加入 50 µL 1 M H2SO4 终止反应。
- 使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。选择分泌 NAR 抗体浓度最高的杂交瘤细胞株进行后续制备。
6. 单克隆杂交瘤细胞的制备
- 采用有限稀释法制备单克隆杂交瘤细胞。
- 去除所选杂交瘤的HT培养基后（即， 将分泌NAR抗体呈阳性的细胞用RPMI-1640重悬并计数。
- 将细胞用 RPMI-1640 培养基稀释至每孔 100 µL 中含 1 个、2 个和 4 个细胞，接种于 96 孔板中。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2.
- 7-10天后，使用icELISA方案（第5步）检测培养上清中的NAR抗体。将产生NAR抗体阳性的杂交瘤细胞转移至24孔板，25 cm²2 烧瓶，以及 75 cm2 用于培养的烧瓶
- 冻存单克隆杂交瘤细胞。
- 收集细胞并转移至离心管中。
- 离心细胞（800 × g，10 分钟）后，弃去上清液，并将细胞重悬于冻存液（RPMI-1640、20% 胎牛血清（FCS）和 10% DMSO）中。将细胞悬液转移至冻存管中。
- 将冻存管置于梯度降温盒中，在 -80 °C 下保存 24 小时，随后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
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结果
单克隆杂交瘤细胞的制备
半抗原-载体偶联物的分子量通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析确认。由于牛血清白蛋白（BSA）和柚皮素（NAR）的分子量均已知，因此可计算出与BSA偶联的小分子数量。 图1 展示了NAR-BSA22的代表性质谱结果，显示在m/z 77,058处出现一个宽峰。由于BSA的平均分子量为66,430，表明至少有18个NAR分子（分子量581）与BSA发生偶联（摩尔偶联比（NAR:BSA）= 18:1）。
采用间接ELISA（icELISA）检测小鼠免疫后抗血清的效价
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讨论
本文介绍了一种针对天然产物来源小分子的单克隆抗体（mAb）成功制备方案。我们已概述该实验流程中的关键步骤，并以柚皮素查尔酮（NAR）作为示例小分子，展示了本方案的实用性。所提供的示例光谱、反应性分析及间接竞争酶联免疫吸附测定（icELISA）结果，均展示了采用本方案所获得的代表性实验组与对照组数据。杂交瘤的示例图像为研究人员提供了直观参考，有助于区分单克隆与多克隆杂交瘤。综上所述，我们证明了本文所提出的单克隆抗体制备、表征及应用策略，能够成功获得针对特定小分子的高效单克隆抗体，并基于该抗体建立一种新型ELISA方法，可用于检测其他天然产物中目标分子的表达情况。
使用任何类型的抗体时，该实验过程中最常见的问题与单克隆抗体（mAb）的敏感性相关。实际上，由于敏感性低、交叉反应性高或其他因素，mAb可能无法按预期发挥作用的风险较高。由于整个实验流程至少需要4个月才能完成，因此在对杂交瘤细胞分泌的mAb进行初步筛选时必须格外谨慎。为避免制备出无效的mAb，一个关键步骤是在细胞融合前通过间接竞争酶联免疫吸附试验（icELISA）对抗血清进行筛选，以确认其能与半抗原反应，但不与载体蛋白反应。该...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家自然科学基金（项目编号 81573573、81473338 和 81503344）以及北京中医药大学经典方剂基础研究团队资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 800目（40 μm 尼龙滤膜 | FALCON | 352340 | |
| 24孔培养板 | NUNC | 119567 | |
| 25 cm² 培养瓶 | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB） | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm² 培养瓶 | 康宁 | 430720 | |
| 96孔培养板 | NUNC | 117246 | |
| 牛血清白蛋白 | AMRESCO | 332 | |
| 细胞滤筛 | FALCON | 352340 | |
| 15 mL 离心管 | 康宁 | 430645 | |
| 50 mL 离心管 | 康宁 | 430828 | |
| 冻存管，1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| 耕作器 | DRP-9082 | 三星 | |
| 透析膜（10 kDa） | Heng Hui | 45-10000D | |
| 二甲基亚砜 | 国药化学 | DH105-10 | |
| 电子天平 | BS124-S | 赛多利斯 | |
| ELISA板，96孔 | NUNC | 655101 | |
| 乙醇，96% | 国药化学 | ||
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270106 | |
| 弗罗因德´完全佐剂 | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| 弗罗因德´不完全佐剂 | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| 明胶 | AMRESCO | 9764-500g | |
| 梯度降温容器 | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT培养基添加剂 | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | applygen | C1308 | |
| HT培养基添加剂 | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| 倒置显微镜 | IX73 | 奥林巴斯 | |
| 钥孔血蓝蛋白 | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR 加 | Axima | |
| 酶标仪 | BioTex | ELX-800 | |
| 小鼠 | 维通利华 | BALB/c | |
| 卵清蛋白 | 北京百欧迪 | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| 青霉素&链霉素溶液 | Hyclone | SV30010 | |
| 移液10 mL | COSTAR | 4488 | |
| 移液25 mL | 猎鹰 | 357525 | |
| RPMI 1640 | 康宁 | 10-040-CVR | |
| 脱脂牛奶 | applygen | P1622 | |
| 高碘酸钠 | 国药化学 | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne 吸头 1,000 个 µL | Starlab | S1111-2021 |
参考文献
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