新型被动透明化方法用于快速实现全中枢神经系统组织光学透明

摘要

本文介绍了两种新颖的方法——psPACT和mPACT，可用于实现啮齿类动物完整中枢神经系统组织血管结构的最大光学透明化，并进而进行显微分析。

摘要

自从CLARITY技术（一种生物电化学组织透明化技术，可实现透明组织内的三维表型定位）问世以来，一系列新型组织透明化方法相继建立，包括CUBIC（透明、无阻碍的脑成像试剂与计算分析）、SWITCH（全系统化学相互作用时间与动力学控制）、MAP（蛋白质组放大分析）和PACT（被动透明化技术），进一步拓展了生物组织显微分析的工具箱。本研究旨在改进并优化原始PACT方法，使其适用于多种完整的啮齿类动物组织，包括完整的中枢神经系统（CNS）、肾脏、脾脏以及整只小鼠胚胎。这些新方法被称为psPACT（过程分离型PACT）和mPACT（改良型PACT），为在完整正常及病变组织中绘制细胞环路和可视化亚细胞结构提供了高效手段。在以下实验方案中，我们将详细逐步说明如何通过psPACT和mPACT在最大程度透明化组织的同时，最小程度破坏其结构完整性。

引言

科学研究与临床探究的一个基本目标是全面理解器官的结构与功能；然而，哺乳动物器官极其复杂的特性常常成为实现这一目标的障碍¹。CLARITY（透明脂质交换丙烯酰胺杂化刚性成像兼容组织水凝胶）^2,3,4技术通过在完整组织基础上构建丙烯酰胺水凝胶杂合体，可在保持组织结构完整性的前提下，实现包括脑、肝和脾在内的多种器官的光学透明化⁵。因此，CLARITY不仅实现了对组织的可视化观察，还提供了无需切片即可精细解析复杂细胞网络和组织形态学特征的机会。

为了实现组织透明化，CLARITY 采用电泳方法去除待测样本中的脂质成分。尽管 CLARITY 因可生成物理性质稳定的组织-水凝胶杂交材料而受到关注，但研究表明，其使用的电泳组织透明化（ETC）方法在组织质量方面结果不一，包括出现褐变、表位损伤和蛋白质丢失等问题^5,6。为解决这些问题，研究人员已开发出改进方案，例如 PACT（被动透明化技术），该方法以被动的、基于离子型去垢剂的去脂技术取代 ETC 处理^7,8,9。然而，尽管 PACT 在结果一致性方面有所提升，但其达到最大程度透明化所需时间更长。此外，目前这些技术均尚未应用于完整的中枢神经系统整体组织，也未在大鼠和豚鼠等较大的啮齿类动物模型中实现应用。

本研究旨在通过提出两种新方法——psPACT（分步处理的PACT）和mPACT（改良PACT），以克服上述局限，促进小鼠和大鼠模型中枢神经系统及内脏器官的快速透明化¹⁰。具体而言，psPACT在水凝胶形成过程中分两步进行组织处理，所用试剂为4%丙烯酰胺和0.25% VA-044；mPACT基本步骤相同，但在基于SDS的透明溶液中添加0.5% α-巯基甘油作为关键试剂。这两种技术均利用内源性的全身循环系统和脑脊液循环系统，显著缩短实现光学透明所需的时间。作为原理验证，我们展示了使用共聚焦显微镜分析透明化组织中血管结构的方法¹⁰。

方案

所有操作均已获得延世大学医学院相应研究伦理委员会的批准。所有实验动物的处死均遵循延世大学医学院实验动物护理委员会的指南。

1. 试剂的准备

注意：多聚甲醛（PFA）、丙烯酰胺和十二烷基硫酸钠（SDS）为有毒刺激物，应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE；实验服、手套、护目镜）。

1. 4% 丙烯酰胺（A.A）溶液（A4P0）：将 20 mL 的 40% 丙烯酰胺溶液加入 180 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 0.25% VA-044 溶液：将 0.5 g 的 2,2´-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐（VA-044）粉末加入 200 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中。VA-044 粉末可在室温下保存，但溶于 PBS 后必须在 4 °C 下保存。为获得最佳效果，仅配制实验所需量的溶液。
3. PACT 混合液：将 10 g 丙烯酰胺加入 225 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中，并用 4% PFA 定容至 200 mL。使用前，在 50 mL 锥形管中向 40 mL 该混合液中加入 100 mg VA-044 粉末。
4. PACT 透明化溶液缓冲液：将 40 g 十二烷基硫酸钠（SDS）加入 350 mL 的 0.1 M PBS 中，并用 0.1 M PBS 定容至 500 mL。对于 mPACT 透明化溶液，需在 PACT 透明化溶液缓冲液中加入 0.5% α-巯基甘油。
5. 本研究使用的实验动物为 2 周龄的 BALB 雄性小鼠和 2 周龄的雄性 SD 大鼠。

2. 麻醉与灌注手术

注意：PFA 和丙烯酰胺为有毒刺激物，因此应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。

1. 在无病原体环境中，使用1 mL注射器和26号针头，以30 mg/kg剂量的唑拉西泮（zoletil）对动物进行麻醉。监测动物5–10分钟。
2. 当动物达到外科麻醉水平时，采用脚趾夹捏反应法评估麻醉深度，确认动物无反应性。
   注意：以下涉及小鼠和大鼠手术的步骤遵循先前研究中使用的类似方案¹¹。
3. 在肋骨下方穿过皮肤和腹壁做一道5–6 cm的切口。
4. 使用弯头钝头剪刀在膈肌上做切口，操作前通过触诊胸腔区域以确定切口位置。
5. 将切口沿整个肋骨长度方向延伸，以暴露胸膜腔。
6. 小心移开肺组织。沿肋骨切至锁骨处。使用虹膜剪刀在左心室后端做一小切口。将一支18号钝头或橄榄头灌注针插入升主动脉，并穿过切开的心室。
7. 用止血钳夹住心脏以固定针头并防止泄漏；或者，可使用改良止血钳夹住针尖周围的主动脉。
8. 在右心房处做一大切口，注意尽量避免损伤降主动脉。此时大鼠已准备就绪，可进行灌注。

3. 大鼠的全身灌注与解剖

注意：PFA 和丙烯酰胺为有毒刺激物，因此应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。

注意：以下完整灌注步骤与Woo et al.（2016）先前研究中使用的一种方案类似^10,11。

1. 将心脏的右心房连接到一支18号针头上，注意避免引入任何气泡。
2. 使用50 mL注射器，快速而均匀地泵入50 mL含肝素（10单位/mL）的冷0.1 M PBS溶液。
3. 将18号针头连接至蠕动泵的管路。
4. 以10 mL/min的循环速度，用200 mL含肝素（10单位/mL）的冷0.1 M PBS溶液进行冲洗。
5. 以10 mL/min的循环速度，用250 mL冷的4% PFA溶液进行固定。此时大鼠应变得僵硬。
6. 收集并储存剩余的PFA溶液以待处理。
7. 对于PACT方法，使用预冷的PACT混合液（含4% PFA、4%丙烯酰胺和0.25% VA-044粉末）通过18号针头灌注组织，然后移除头部和脊柱。从颈部至鼻部做中线切口以暴露颅骨。此额外灌注步骤在psPACT和mPACT方法中无需进行；固定后应立即分离头部和脊柱，并暴露颅骨。
8. 通过去除残留的颈部和脊柱肌肉，暴露颅底。
9. 使用咬骨钳和剪刀剥离颅骨，取出脑组织和脊髓。
10. 将组织置于4% PFA中，4 °C保存；组织可保存长达1周。

4. 大鼠和小鼠中枢神经系统的水凝胶单体灌注与聚合

注意：丙烯酰胺、SDS、α-巯基甘油和多聚甲醛均为刺激性物质，因此应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。

1. PACT（被动透明化技术）
   1. 从固定后的小鼠和大鼠中分离并取出完整的中枢神经系统（脑和脊髓），放入含有冷的PACT混合液（含4% PFA、4% 丙烯酰胺和0.25% VA-044粉末）的50 mL离心管中，于4 °C保存24小时。确保组织完全浸没在溶液中。
   2. 使用连接氮气罐的组织凝胶杂交系统，在氮气环境中孵育样品10分钟：将系统设置为37 °C。将组织转移至含有新鲜冷（4 °C）PACT混合液的50 mL离心管中，并盖紧管盖，然后开启真空。
   3. 为使水凝胶聚合，将装有样品的离心管置于摇床培养箱中（150 rpm，37 °C）孵育3小时，或直至聚合完成。
   4. 使用吸水纸（见材料表）去除组织周围残留的已聚合水凝胶。
   5. 将组织转移至含有透明化溶液（0.1 M PBS中含8% SDS，pH 8.0）的50 mL离心管中。
   6. 将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约20天。
2. psPACT（分步式被动透明化技术）
   1. 在洁净台中使用骨剪和剪刀从PFA固定的的小鼠和大鼠中分离完整的中枢神经系统（脑和脊髓）。
   2. 将组织转移至含有4% PFA的50 mL离心管中，于4 °C保存24小时。确保组织完全浸没在固定液中。
   3. 用0.1 M PBS清洗固定后的组织1小时，然后转移至A4P0溶液（0.1 M PBS中含4% 丙烯酰胺），于37 °C保存24小时。
   4. 用0.1 M PBS清洗组织5分钟。
   5. 将组织浸入含0.25% VA-044的0.1 M PBS溶液中，于37 °C保存6–24小时，然后转移至新鲜的0.25% VA-044/PBS溶液中。
   6. 使用连接氮气罐的组织凝胶杂交系统（见材料表），在氮气环境中孵育样品10分钟：将组织转移至含有新鲜冷（4 °C）0.25% VA-044/PBS溶液的50 mL离心管中，并盖紧管盖，然后开启真空。
   7. 将组织转移至透明化溶液（0.1 M PBS中含8% SDS，pH 8.0）中。
   8. 将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中孵育，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约17天。
3. mPACT（改良型被动透明化技术）
   1. 在洁净台中使用骨剪和剪刀从PFA固定的的小鼠和大鼠中分离完整的中枢神经系统（脑和脊髓）。
   2. 按照psPACT方案中的步骤4.2.2–4.2.8进行操作。
   3. 将组织转移至透明化溶液中。注意，与PACT和psPACT方案不同，mPACT所需的透明化溶液除含有0.1 M PBS中的8% SDS（pH 8.0）外，还需添加0.5% α-硫甘油。α-硫甘油是一种抗褐变剂，有助于更快速且有效地实现组织透明化。确保组织完全浸没在溶液中。
   4. 将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约2周时间。

5. 透明化中枢神经系统组织的折射率匹配与免疫染色

注意：nRIMS（基于Nycodenz的折射率匹配溶液）由0.8 g/mL Nycodenz粉末溶解于30 mL基础缓冲液（含0.01%叠氮化钠和Tween-20的0.1 M PBS，pH 8.0）中配制而成。建议将溶液置于37 °C摇床培养箱中，以确保粉末充分溶解。

1. 将组织在含有0.1% Triton X-100的0.1 M PBS中孵育2小时，然后在含有2%牛血清白蛋白（BSA）的0.1 M PBS中封闭6小时。
2. 用PBST（含0.1% Tween-20的0.1 M PBS）洗涤切片三次，每次2小时。加入一抗（本实验中为兔抗PECAM-CD31抗体，用于标记血管）在4℃孵育2天。
3. 在含有2% BSA的溶液中，加入二抗（本实验中为Cy3荧光标记的 goat anti-rabbit IgG）孵育切片2天。
4. 用PBST洗涤标记好的组织三次，每次2小时，然后将其置于15 mL nRIMS中保存2至10天。
5. 成像前，将标记好的组织转移至35 mm或60 mm组织培养皿中少量的nRIMS内，并用硅胶固定于培养皿底部边缘。
6. 加入1.5–2 mL新鲜的nRIMS。

6. 图像处理

1. 使用共聚焦激光扫描显微镜（见材料表）在10倍放大倍数下通过拼图扫描获取透明化组织的图像。对于Cy3标记的组织，使用550-600 nm波长。

结果

利用优化的被动透明化技术构建整个中枢神经系统的透明模型

利用多种被动透明化技术，可快速实现小鼠和大鼠完整中枢神经系统组织的光学透明化（图1）。图2A展示了组织透明化随时间变化的示意图。与原始的PACT方法不同，psPACT（分步处理PACT）通过两个独立步骤分别使用4%丙烯酰胺（A4P0）和0.25% VA-044引发剂溶液处理样本，以形成水凝胶杂合物。mPACT（改良PACT）在psPACT基础上进一步优化，通过在8% SDS透明化溶液中添加0.5% α-巯基甘油实现。在第14天经PACT、psPACT和mPACT处理的样本比较结果如图2B所示。

讨论

尽管PACT中采用的被动式、非电泳提取方法显著提高了此前组织透明化技术（如CLARITY^2,3,4,7,8）所达到的一致性，但该技术仍存在若干不足，其中最突出的问题是实现最大组织透明度所需的时间较长¹²。在本研究中，我们提出了改进的PACT方案，可显著缩短组织透明化所需时间，同时仍能保持组织完整性和结构^6,10。此外，我们首次展示了组织透明化方案在完整中枢神经系统组织以及更高级啮齿类动物模型——大鼠中的应用¹⁰。

具体而言，psPACT 在水凝胶形成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
十二烷基硫酸钠（SDS）	Affymetrix, Inc.	75819	透明溶液
Nycodenz	Axia-Shield	1002424	nRIMS 溶液
40% 丙烯酰胺溶液	Bio Rad Laboratories, Inc.	161-0140	聚合反应（A4P0）
2,2´-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	017-19362	聚合反应（VA-044）
硫代甘油	Sigma-Aldrich	M1753-100ML	透明溶液（mPACT）
吐温-20	Georgiachem	9005-64-5	nRIMS 溶液
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML	免疫染色
牛血清白蛋白（BSA）	Bovogen	BSA100	免疫染色
肝素	Merck Millipore	375095	灌注（PBS）
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002-25G	nRIMS 溶液
PECAM-CD31 抗体	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-28188	免疫染色
山羊抗兔 IgG Cy3 荧光偶联物	Jackson ImmunoResearch Inc.	111-165-003	免疫染色
4% 多聚甲醛	Tech & Innovation	BPP-9004	灌注，聚合
20X 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）	Tech & Innovation	BPB-9121	灌注，缓冲液
10 mL 移液管	Coatar	4488	溶液转移
50 mL 离心管	Falcon	352070	透明化用管
35 mm 细胞培养皿	SPL	20035	成像
共聚焦培养皿	SPL	211350	成像
1 mL 注射器	Korea vaccine Co., Ltd	26G 1/2	麻醉
50 mL 注射器	Korea vaccine Co., Ltd	21G1 1/4	灌注
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A3553	聚合反应（A4P0）
Whatman 3MM 滤纸	Sigma-Aldrich	Z270849	凝胶去除用吸水纸
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM780	成像
ZEN lite 软件	Zeiss	ZEN 2012	成像
蠕动泵	Longerpump	BT100-1F	灌注
EasyGel	Lifecanvas Technologies	EasyGel	组织凝胶杂交系统