一种简便且可适应的肉汤微量稀释法，用于筛选抗真菌化合物和提取物。
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方法文章
微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近几十年来，真菌感染已成为重要的医学问题，但可用的抗真菌药物种类有限。在此背景下，寻找新的抗真菌药物十分必要。本文报道的实验方案详细描述了一种用于筛选具有抗真菌特性的肽类分子的方法。该方法基于美国临床与实验室标准协会（CLSI）M27-A3指南中的肉汤微量稀释敏感性试验，并进行了修改，以适用于将抗菌肽作为潜在新型抗真菌药物的研究。本方案描述了一种功能检测方法，用于评估抗真菌化合物的活性，且可根据所研究的任何特定类别分子进行简便调整。由于实验在96孔板中以小体积进行，因此可在短时间内完成大规模筛选，尤其适用于自动化操作环境。该操作流程展示了标准化且可调节的临床检测方案如何助力实验室研发新分子，从而改善真菌病的治疗手段。
引言
近几十年来，真菌感染已成为重要的医学问题，其发病率显著上升，主要原因是免疫功能低下人群的数量增加，例如接受癌症治疗的患者、艾滋病病毒/艾滋病（HIV/AIDS）感染者以及器官移植受者1,2。然而，可用的抗真菌药物种类极为有限，且关于真菌对这些药物产生耐药性的报道日益增多，这给系统性真菌病的治疗带来了重大挑战3。
新型抗真菌化合物的潜在来源之一是抗菌肽（AMPs），这是一类由多种生物体产生的阳离子小分子肽，作为其对感染的先天免疫反应的一部分4。然而，目前尚无标准化的方法用于检测这些化合物对真菌病原体的活性。已有多种不同实验流程被用于评估AMPs的抗真菌活性，有时甚至在同一模式微生物中也采用不同方法5,6,7。这些方法间的差异以及部分实验方案中细节描述的缺失，使得不同化合物之间的比较变得复杂，并阻碍了实验的可重复性。
标准化新药候选物测试的一种方法是遵循临床环境中定义抗真菌药物敏感性的指南，例如美国临床和实验室标准协会（Clini....
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方案
1. 溶液与培养基
- 根据表1配制2倍浓度的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、沙氏葡萄糖肉汤和沙氏葡萄糖琼脂。
2. 真菌接种物培养条件
- 将所有真菌菌株以含35%甘油的冻存液在-80 °C下保存，直至使用。
- 每次实验前执行以下步骤。
- 对于Candida albicans菌株：
- 解冻一支冻存管，取200 µL转移至含有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL聚丙烯管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养过夜。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以利于培养物更好地通气。
- 对于Cryptococcus neoformans菌株：
- 刮取冻存管表面的冷冻菌体，将细胞接种至沙氏葡萄糖琼脂平板上，在30 °C下培养48小时。待出现单菌落可见生长后，用封口膜密封平板并置于冰箱（4 °C）中保存，最多可保存15天。
- 使用无菌牙签或无菌接种环从平板上挑取一个中等大小的单菌落，接种至装有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL锥形管中，在30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养约24小时。
- 培养时间不得超过24小时。注意将....
- 对于Candida albicans菌株：
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结果
最低抑菌浓度（MIC）定义为在孵育期结束时能够完全抑制真菌可见生长的最低抗菌化合物浓度。由于本实验方案的目的是建立一种快速筛选潜在抗真菌药物的方法，因此任何孔中培养基清澈透明、与空白对照孔相似的结果均视为阳性；而任何孔中培养基出现类似阴性/生长对照孔的浑浊现象则视为阴性。然而，若需进一步确定某种特定抗菌肽（AMP）是抑菌性还是杀菌性，可将阳性孔中的培养基接种至沙保葡萄糖琼脂（Sabouraud Dextrose Agar）平板，或通过其他活菌检测方法进行验证。
由于新化合物的作用机制未知，因此在检测该化合物（本例中为一种抗菌肽；图1 和 图2）的最低抑菌浓度（MIC）之前，必须验证参照抗真菌药物对真菌分离株的活性是否处于预期范围内（请查阅官方指南、文献中的表格或数据），以确认实验条件适宜。若参照药物的活性不在规定范围内，则必须重复实验.......
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讨论
微量稀释试验可利用少量目标化合物分析其潜在的抗真菌活性，同时在一系列浓度下进行测试。因此，本方案推荐作为筛选潜在新型抗真菌化合物的第一步。此处提供的方案基于M27-A3方案，该方案最初设计用于协助临床选择抗真菌治疗药物，但可适用于多种新型抗真菌化合物。总体而言，本方案可重点关注提取物或化合物的理化特性。例如，由于培养基中的某些成分可能阻碍化合物与真菌细胞的相互作用，导致检测中潜在有效物质被误判为无效，如RPMI对组蛋白5（Histatin 5）的影响14。在此情况下，当RPMI产生干扰时，可选用酵母氮碱基（Yeast Nitrogen Base, YNB）缓冲液配以MOPS，pH 7作为替代培养基15。
该方案还允许在预培养条件、接种物浓度、培养温度以及对光敏感组分等方面进行修改，前提是参照抗真菌结果处于指南规定的范围内。参照抗真菌药物应基于所测试真菌物种的当前治疗方案。此外，若存在与潜在药物性质相似的参照化合物—— 例如一种已知的具有抗真菌活性的抗菌肽，可作为针对所测.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢巴西高等教育人员培训基金会（CAPES）、巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）以及巴西联邦区基金会（FAP/DF）提供的经费支持。我们感谢 Hugo Costa Paes 博士对本文手稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>培养基与试剂 | |||
| 含L-谷氨酰胺、不含碳酸氢钠的RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-吗啉代)丙烷磺酸 (MOPS)（我们使用的含有一个s）ódio，請補全他的名字 | Sigma-Aldrich | 用于配制2倍浓度RPMI培养基的缓冲液 | |
| 氯化钠（NaCl） | 丁â云母 | 1528-1 | 磷酸盐缓冲液（PBS）中的 137 mM |
| 氯化钾（KCl） | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM 磷酸盐缓冲液（PBS） |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Sigma-Aldrich | V000129 | 磷酸盐缓冲液（PBS）中10 mM |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM 磷酸盐缓冲液（PBS） |
| BD Difco 沙氏葡萄糖肉汤 | BD | 238230 | |
| BD Difco 沙氏葡萄糖琼脂 | BD | 210950 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | V000123 | 35%（溶液ção 储存？冷冻保存ção?) |
| 无菌水 | 用于稀释çã药物稀释ção seriada | ||
| <强>抗真菌药物 | |||
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 氟康唑 | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| 卡泊芬净 | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| <强>塑料 | |||
| 50 mL 一次性无菌离心管 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 培养皿 | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96孔板 | 康宁 | 3595 | |
| 无菌溶液储液罐 | KASVI | K30-208 | 使用多通道移液器吸取溶液 |
| <强>仪器与其他材料 | |||
| 光学显微镜 | 尼康 | E200MV | |
| 离心 | 赛默飞世尔科技 | MegaFuge 16R | |
| 培养箱 | Ethik 技术 | 403-3D | 设定为37° C |
| Shaker | 新不伦瑞克科学公司 | Excella E25 | 设定为37° C，200 转/分钟 |
| 细胞计数板，Neubauer | BOECO 德国 | BOE 13 | |
| 多通道移液器 | HTL | 5123 |
参考文献
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A.
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重印与许可
