通过流式细胞术测定分离的块茎原生质体的内复制

摘要

本文所述方案是一种用于测定马铃薯（Solanum tuberosum）块茎内内复制现象的方法。该方法包括质壁分离和原生质体提取步骤，以减少后续流式细胞术分析中的背景噪声和碎片干扰。

摘要

内复制是指细胞核基因组复制后不伴随胞质分裂，从而产生DNA含量增加的细胞，这一过程与细胞特化、发育及细胞体积增大相关。在植物中，内复制似乎有助于某些组织和器官的生长与扩展。其中就包括马铃薯（Solanum tuberosum）的块茎，其在执行碳水化合物储存功能时会经历显著的细胞扩张。因此，内复制可能在块茎容纳大量碳物质的过程中发挥重要作用。然而，由于块茎组织采用传统的粗提法进行核分离时会产生大量细胞碎片（尽管该方法在叶片中可有效应用），因而难以准确估算块茎的内复制指数（EI）。本文介绍了一种通过原生质体分离来评估块茎内复制水平的技术，并展示了从不同基因型及块茎不同区域组织中获得的代表性结果。该实验方案的主要局限性在于样品制备所需的时间和试剂成本较高，以及原生质体裂解后样品的存活时间相对较短。尽管该方案对技术操作差异较为敏感，但相较于传统的大规模特化细胞核分离方法已有明显改进。文中还提出了若干可能的优化方向，例如酶液的回收利用、固定剂的使用以及其他技术改良措施。

引言

内复制是指细胞放弃典型的细胞周期，转而经历一种替代性的发育过程，该过程包括多轮DNA复制而不伴随细胞分裂。最终形成的细胞具有增加的DNA含量和细胞核体积，这被认为在细胞调控、扩展和特化过程中发挥重要作用。通常，一轮内复制（称为内复制周期）及其相应的DNA含量增加与更大的细胞体积相关，这一观察结果促成了"核质比理论"，即更高的DNA含量是有效调控更大、可能更复杂的细胞所必需的¹。该现象在高等植物中较为常见，已在多种组织中被观察到，包括具有结构/防御功能（如毛状体）^2,3、营养功能（如玉米胚乳）^4,5以及库/储存功能（如番茄果皮；马铃薯块茎）^6,7,8的组织。在果实中，有研究表明内复制有助于果皮的快速扩张，这一点已由内复制程度与果实发育周期之间的负相关关系所证实⁹。例如，在番茄果皮中已观察到DNA含量高达512C（单倍体基因组的512倍）的细胞⁸。此外，Chevalier等（2014）证明，细胞周期基因表达的改变可导致果皮内复制水平升高，进而产生更大的果实¹⁰。因此，调控促进内复制的基因可能成为通过植物育种或遗传操作提高生物量或产量的潜在靶点。然而，此类改良依赖于对内复制成因及其生物学后果的更深入理解。

内复制通常通过流式细胞术进行测量，该方法利用粗制组织样品中释放的细胞核¹¹，与DNA结合的荧光染料（如碘化丙啶）共同孵育¹² (PI)。随后，过滤后的样品通过流式细胞仪的激光，可检测到与荧光染料相对应的发射波长。每个事件中的荧光强度（即， 细胞核的DNA含量与颗粒的DNA含量直接相关。因此，通过与已知标准进行比较，可计算出给定样品中细胞的相对和绝对DNA含量。内复制指数（EI）通过检测样品中每个细胞的平均内复制循环次数来确定，该值基于细胞DNA含量（C值）进行评估，其中1C代表单倍体细胞的DNA含量（具体计算公式见方案第6.7步）。例如，在二倍体生物中，体细胞的基础DNA含量为2C。若样品中仅有少量细胞达到4C（对应一次内复制循环）或更高，则其EI接近于0；而若几乎所有细胞均为4C，则EI约为1。然而，由于高等植物中常发生多轮内复制，所观测到的EI值可能远大于1。尽管内复制指数的计算相对直接，但其前提是必须能够可靠地测定细胞核C值的相对丰度，而这一条件在某些物种和组织（包括马铃薯块茎）中难以满足。这可能与细胞结构、化学成分或细胞壁组成方面的差异有关。¹³ 导致这些样品难以采用常规方法制备，即通常用于番茄中果皮等组织（内复制研究的模式材料）的、用剃刀片直接将细胞核释放到适当缓冲液中的方法⁸.

在马铃薯中，对块茎内内复制现象的研究仍局限于少数几项研究，部分原因可能是缺乏可靠的实验方案，因为前述的粗提取方法往往导致结果不一致。尽管这些方法在叶片中效果良好，但块茎样品常出现严重降解，并伴有大量碎片形式的背景噪音，使得区分具有不同C值的细胞核峰几乎不可能。这可能是由于细胞组成差异以及块茎细胞内存在大量细胞碎片（例如储存淀粉的淀粉体）。为克服这一难题，我们近期开发出一种更为可靠的马铃薯块茎流式细胞术分析方案，可获得清晰可辨的峰。随后可利用各峰中细胞的频率，准确计算不同基因型或块茎不同组织中的内复制水平。该方案采用改良的原生质体提取方法^14,15，并以前述的流式细胞术方法¹¹为基础，在马铃薯近缘种、栽培品种及不同组织中均表现出显著差异¹⁶。本文将结合倍性、组织类型和块茎大小等背景，详细阐述该方案在内复制指数（EI）测定中的应用。

方案

注意：必须包含适当的对照，通常采用与实验样本相同倍性的叶片组织。这是因为块茎样本的2C峰可能较小且难以识别。

1. 准备工作

注意：此处列出的溶液可预先配制并保存在 4 °C，但后续步骤中提到的溶液必须在使用当天新鲜配制。

1. 配制适量的质壁分离孵育液（PIS）（每样品15 mL）：0.55 M 甘露醇、2 mM CaCl₂、1 mM KH₂PO₄、1 mM MgCl₂、50 mM Tris 缓冲液（用 HCl 调节至 pH 7.5）。
2. 配制适量的质壁分离洗涤液（PWS）（每样品15 mL），其成分与 PIS 相同，但甘露醇浓度为 0.71 M。
3. 配制 250 mL 改良的 Galbraith 流式细胞术缓冲液¹¹（FCB）：13.6 mM 柠檬酸钠（三钠）、8 mM MOPS、18 mM MgCl₂、0.4% v/v Triton X-100。持续搅拌至少 30 分钟，以充分分散 Triton X-100。
4. 使用 0.22 µm 非对称聚醚砜（aPES）滤膜，通过真空驱动过滤装置对 PIS 和 PWS 溶液进行过滤除菌。
5. 为裂解的原生质体准备 106 µm 网格滤膜。准备可直接嵌入收集管中的 1.5 mL 微量离心管；但也可采用任何能将悬浮液通过 106 µm 滤膜的方法。
   注意：这些装置无需无菌。
   1. 若使用 1.5 mL 微量离心管，将每根管的管尖剪去约 1 cm。使用加热板或其他热源，将一块 1 cm² 的 106 µm 不锈钢网置于铝箔上加热。将剪切后的管端压入金属网中，直至两者融合固定。
6. 清洗待取样的马铃薯，彻底去除所有土壤和杂质。
   注意：块茎的大小和生理年龄应符合实验目的，但似乎不影响结果质量。本方案已成功应用于经冷藏（4 °C，95% 相对湿度）长达 8 个月的块茎。尽管存在缺陷（例如 块茎末端腐烂、空心、褐色坏死区域）的块茎仍可能具有反应性，但应尽可能避免使用。

2. 第1天：质壁分离薯块组织

注意：对照叶片样品可在此处用于制备原生质体，或在步骤 5.2 进行粗提，具体取决于实验需求。该操作必须在无菌环境（如超净工作台）中使用无菌工具进行。

1. 将马铃薯块茎浸入75%乙醇中至少5分钟，进行表面灭菌。
2. 从乙醇中取出块茎并风干。通常需要约5分钟，若块茎质量大于100 g，则所需时间更长。
3. 为每个样品准备并标记无菌的50 mL锥形管，并向每管中分装15 mL过滤灭菌的PIS溶液。
4. 使用灭菌的解剖刀或打孔器，从灭菌后的块茎中取约1 cm³的目标组织。
   注意：根据所取组织类型，可选择使用灭菌打孔器或刀具/解剖刀。例如，若需获取髓部组织，可使用打孔器从块茎顶端至远端取芯，并取芯部中央部分作为样品。然而，由于马铃薯块茎内部形态不对称，通过将块茎剖半后切割获取薄壁组织或皮层组织可能更为精确。内部块茎形态示意图见图1。
   1. 使用灭菌解剖刀将组织粗切成约3 mm³的小块，转移至含有PIS的锥形管中。于4 °C孵育过夜。
      注意：此步骤旨在增大组织表面积，以便PIS溶液及后续酶解液能够充分渗透组织，从而实现更彻底的消化。

图 1：马铃薯块茎的内部形态。 图中以黑线标示出髓部（P）与髓周薄壁组织（PM）之间的分界。分隔薄壁组织与皮层（C）的维管环以黑色箭头标出。同时标注了匍匐茎端（S）和块茎芽眼（E）。请点击此处查看本图的放大版本。

3. 第2天：制备马铃薯原生质体

注意：必须在无菌环境（如层流罩）中使用无菌工具进行此操作。

1. 准备适量酶解液（ES）（每样品10 mL），并用0.45 µm aPES滤膜过滤：0.71 M 甘露醇，3 mM CaCl₂，1 mM KH₂PO₄，1 mM MgCl₂，4% Onozuka R-10 纤维素酶，0.8% Macerozyme R-10，1% 半纤维素酶，10 mM MES 缓冲液，pH 5.8。确保此步骤使用适当的滤膜；孔径小于0.45 µm的滤膜容易堵塞，而低蛋白吸附的膜（如aPES）可最大限度减少过滤过程中酶的损失。
2. 使用无菌刻度移液管从锥形管中的样品中吸除PIS。
3. 向每个样品中加入10 mL ES溶液，并轻轻颠倒混匀2–3次。
4. 将样品在29 °C下以180 rpm水平振荡过夜培养，孵育时间至少16小时。

4. 第3天：收集原生质体并清洗原生质体

注意：此步骤之后不再需要无菌条件。

1. 从摇床中取出样品，静置约10分钟。
2. 尽可能吸除ES溶液。
   1. 使用血清移液管尽可能多地移除ES溶液，注意避免吸走已消化的组织。
   2. 使用微量移液器移除残留的ES溶液，同样注意避免接触已消化的组织。操作时可将离心管倾斜，使ES溶液流向管盖一侧，而消化后的组织仍停留在管底，这样操作最为方便。
3. 向每个样品中加入15 mL PWS，轻轻倒置混匀2–3次。静置10分钟使原生质体沉淀。
4. 使用血清移液管移除PWS，再用微量移液器吸除任何残留液体。
   注意：此步骤对于确保样品细胞核在流式细胞术中的完整性至关重要。在故障排查过程中发现，样品失败最可能的原因即为此步骤操作不当。

5. 第3天：流式细胞术样品制备

注意：除非另有说明，此后样品应始终保持在冰上。

1. 通过将碘化丙啶和RNase分别溶解于FCB中，配制碘化丙啶溶液（0.4 mg碘化丙啶/mL FCB）和RNase溶液（0.8 mg RNase A/mL FCB）。
   警告：碘化丙啶具有高毒性，避免接触皮肤或眼睛。请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
2. 向每个样品中加入1.5 mL预冷的FCB。轻轻振荡或涡旋各样品，以打散聚集的组织。充分打散块状块茎组织非常重要，以便FCB能够完全渗透细胞并释放细胞核。不同样品可能根据组织类型和基因型的不同，需要不同程度的振荡处理。
   注意：FCB可裂解原生质体，从而释放细胞核。因此必须将样品置于冰上，以防止降解。
   1. 若在原生质体制备步骤中未包含对照流式细胞术样品，则可在本步骤中添加。如需设置对照，可用剃刀将一小片叶片（约3 cm²）在1.5 mL预冷的FCB中切碎。对照样品应与实验样品具有相同的倍性，最好为相同基因型。体外培养的植株通常比温室或田间生长的植株产生更清晰的峰形信号。
3. 将1 mL FCB/组织悬液通过106 µm孔径的滤网过滤。使用如步骤1.5.1所述的方法，将金属滤网熔接在已剪去管尖的1.5 mL微量离心管底部制成过滤装置。该微量离心管可直接嵌套入2 mL微量离心管中，使样品直接滤入其中。若采用其他过滤方法，可先将滤液收集于预冷的培养皿中，再转移至2 mL离心管。
   注意：残留的组织团块和细胞碎片有时会堵塞滤网。此时，只需轻轻敲击两个嵌套的微量离心管数次，即可使堵塞物脱落。
4. 向每个样品中加入250 µL RNase溶液，颠倒混匀后于室温（RT）孵育30分钟。
   注意：此步骤旨在去除样品中的RNA，从而降低流式细胞术检测时的背景噪声。然而，由于细胞核寿命较短，若研究人员发现样品出现严重降解，可考虑缩短孵育时间或在冰上进行孵育。
5. 向每个样品中加入125 µL碘化丙啶溶液，颠倒混匀后置于冰上孵育30分钟。
   注意：样品应尽快用于流式细胞术分析，因为即使保存在冰上，样品在2小时内也会出现明显降解。

6. 第3天：马铃薯块茎细胞核的流式细胞术分析

注意：流式细胞仪的操作和软件会因仪器型号和制造商的不同而有所差异。有关流式细胞仪的具体操作说明，请参阅仪器的用户手册。

1. 使用对数刻度创建两个点图：前向散射 vs. 侧向散射，以及碘化丙啶（PI）vs. 侧向散射。同时创建一个以 PI 为横轴的直方图。由于细胞核的荧光强度可能存在显著差异，因此必须使用对数刻度，以确保所有事件均在量程范围内。
2. 加载一个已知的对照样品管，并调节电压，使所有事件均在量程范围内。我们使用来自某一基因型样品的体外叶片组织作为对照。如果待测样品具有不同的倍性，则每种倍性均应包含相应的对照样品。
   1. 记录对照样品中2C峰所在的通道位置。实验样品的2C峰应落在相同位置。
3. 加载实验样品（块茎样品），并再次确认所有事件均在量程范围内。若需调整，请重复步骤6.2，以确定2C峰的通道位置。
4. 使用侧向散射 vs. PI 图手动圈选原生质体细胞核。
5. 设置 PI 直方图，仅显示已圈选的原生质体细胞核区域。
6. 从每个样品中收集所需数量的事件。研究人员通常在流式细胞术中使用10,000个圈选事件；然而，对于块茎原生质体样品，我们使用2,000个事件，以便容纳更多样品以及浓度较低的样品。
7. 根据 PI 直方图，使用以下公式计算每个样品的内复制指数（EI）：
   EI =
   其中，4C 表示处于4C的细胞核百分比（代表一次内复制循环），8C 表示处于8C的细胞核百分比，依此类推。直方图示例及各峰C值请见图4。

结果

原生质体制备

要获得可重复的马铃薯块茎流式细胞术结果，必须先制备原生质体，其总体形态如图1所示。研究人员可能希望在添加FCP之前确认已成功产生高质量的原生质体，尤其是在需要进行问题排查时。大多数原生质体应呈球形，突起极少（图2），且大小可能存在显著差异，这可能反映了EI的差异。

图 2：在实验方案第 4.4 步获得的代表性叶片与块茎原生质体。 分离得到的原生质体应呈球形且对称，质膜完整。注意叶片（A-C）与块茎（D, E）原生质体之间的大小差异，以及同一组织内原生质体大小的差异，后者可能表明不同水平的内复制（endoreduplication）。叶片原生质体含有叶绿体，而块茎原生质体中可见淀粉体。比例尺 = 1,000 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术结果的评估

实验的成败可通过流式细胞术直方图中峰的宽度及其分离程度来判断。由于内复制的测量需要计算每个峰内细胞核的相对丰度，因此当噪声过大导致无法在峰之间划定有意义的边界时，仅凭峰的存在或缺失是不够的。图3展示了研究人员在流式细胞术散点图和直方图中可能遇到的结果差异。失败样本的潜在原因在讨论部分中进行了阐述。

图3：完整和降解髓组织原生质体核流式细胞术分析的代表性结果。 完整的细胞核（A）在峰之间表现出清晰的分离，可使用适当的软件定量各峰中细胞的相对丰度；而降解样品中的峰（B）则表现出偏移、宽化且基底重叠。在完整（C）和降解（D）样品的散点图中，黑色方框表示用于直方图分析的核事件门控区域，事件的聚集情况反映在直方图峰的宽度上。门控区域外的事件代表碎片、严重降解的细胞核或其他聚集体。PI-H对应于荧光强度，以任意单位测量。文中讨论了防止样品降解的故障排除方法。请点击此处查看该图的放大版本。

不同组织间的内复制差异

此前我们报道过，块茎的髓组织比皮层组织具有显著更高的内复制水平¹⁶。为了验证并扩展这一发现，我们检测了“Superior”品种中三种不同组织的内复制水平：髓组织、髓周薄壁组织和皮层组织，每组样本设三个重复，每个样本采集2,000个门控事件。我们的结果证实了之前的观察：髓组织的内复制指数（EI）显著高于皮层组织，其平均值分别为每细胞1.79和1.12个内复制周期（p = 0.018；Student t检验）。 somewhat 出乎意料的是，薄壁组织的内复制水平与皮层组织相似，且与髓组织之间差异显著（均值 = 1.14；p = 0.013；Student t检验）。这些结果总结于图4中。

图4：品种Superior三个组织中的内复制现象。 显示了叶片（A）、块茎皮层（B）、薄壁组织（C）和髓部（D）组织的直方图，以及根据这些直方图计算出的EI值。各峰所含细胞核的相对丰度差异明显，尤其是叶片与块茎组织之间。各峰对应的C值也已标出。PI-H代表荧光强度，以任意单位测量。E图展示了块茎组织EI值的均值比较，其中星号表示差异显著（p <0.05），误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

块茎大小和倍性的影响

我们先前报道过，对于同一基因型，大小不同但成熟度相似的块茎在电导率（EI）上并未表现出相应的差异¹⁶我们旨在验证这一结果，并评估倍性与内复制之间的关系。本实验中，我们使用了三个不同基因型的薄壁组织，每个基因型设三个重复：四倍体品种 Superior（4x），以及通过刺花授粉法从该品种获得的双单倍体 VT_SUP_19（2x）¹⁷，以及 VT_SUP_19 4x，一种双二倍体单倍体¹⁸ 与VT_SUP_19基因型相同。我们纳入了一组大型（90–130 g）和小型（<35克）的块茎，而另外两种基因型的块茎为90–130克。所有块茎均来自温室种植、完全成熟的植株收获所得， 即 植株顶部已出现衰老。我们观察到VT_SUP_19与其亲本Superior之间存在显著差异（p = 0.04）；然而，VT_SUP_19与VT_SUP_19 4x之间未观察到显著差异（p = 0.69）。这表明，尽管内复制可能具有遗传成分——这一点通过基因组缩减得以显现——但其并不由倍性决定，至少在该遗传背景下如此。最后，我们再次观察到大薯块与小薯块的Superior品种之间无显著差异，如图所示。 图5.

图 5：品种 Superior 及其二倍体（VT_Sup_19）和四倍体（VT_Sup_19 4x）衍生系中两种大小马铃薯块茎的内复制情况。 条形图显示了小块茎（<35 g）和大块茎（90–130 g）的品种 Superior 的平均值，以及二倍体 VT_SUP_19 和同源加倍二倍体 VT_SUP_19 4x 的大块茎（90–130 g）的平均值。显著差异（p <0.05）通过连接字母标记法标示。误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案为研究人员提供了一种评估马铃薯块茎内内复制（endoreduplication）的方法，由于其细胞内容物的改变及细胞体积的增大，传统的流式细胞术制样方法往往难以适用。本方案依赖原生质体的制备，以减少背景噪声和碎片干扰，同时保持细胞核的完整性。此前，研究人员已报道过针对特别难处理的流式细胞术样本的类似制备方法，并已利用块茎原生质体研究多种课题，如病原体侵染过程^19,20。然而，据我们所知，尚无研究将此类块茎原生质体制备与流式细胞术结合用于内复制的研究。此外，我们发现，相较于典型的粗提制样方法，以及此前仅有的两项块茎内复制研究中所采用的技术^6,7，使用原生质体的方法更为可靠。本文将讨论该方案的局限性、在操作与样本制备过程中可能遇到的问题，以及采用该方法的典型实验结果。

尽管块茎流式细胞术方案具有实用性和可重复性，但仍存在一些局限性需要讨论。首先，该方案耗时较长，需要两次过夜孵育。此外，该方案需要使用一些昂贵的试剂，特别是纤维素酶和离析酶。另外，样品制备过程对时间高度敏感，在数小时内即会降解，这可能限制单日内的样本通量，尤其是在需要获取大量数据事件的情况下。最后，尽管该方案整体可靠，但对样品制备过程中的操作误差较为敏感，任何失误似乎都会导致细胞核受损，从而降低结果质量。例如，在质壁分离和原生质体生成步骤（1–3.4）中，若无菌操作技术不当，可能发生微生物污染。样品污染虽然并不总是完全阻碍实验成功，但似乎会显著降低所获得直方图的质量，原因很可能仍是细胞核受损所致。

如前所述，该方案的主要缺点在于成本高、耗时长以及对操作误差敏感。研究人员可考虑采取措施以减轻上述每一项问题。关于成本问题，计划将该方案应用于大量样本的研究人员可考虑调整酶浓度和/或消化步骤的持续时间，因为不同组织和基因型在反应性上可能存在差异。这包括过滤并重复使用酶解液（ES）的可能性，此前已有相关报道，但本研究中未予采用²¹。关于耗时问题，据我们观察，省略第一次孵育（质壁分离步骤）仍可提取原生质体，但其完整性和得率将受到影响，从而对实验结果产生负面影响。为减少样本降解，研究人员可考虑某些流式细胞术方法中使用固定剂（例如，甲醛）以维持样本完整性²²。该方法可能有助于防止样本降解，并允许样本储存，而不必如本文所述在同一天完成原生质体制备与流式细胞术分析。另一种防止细胞核损失的方法可能是在酶解液（ES）和/或流式缓冲液（FBC）中添加核酸酶抑制剂；在本方案开发过程中，2-巯基乙醇未引起明显变化，但其他抑制剂尚未在此进行测试。

在我们的观察中，最关键的一步是步骤 4.4，即在添加流式细胞术缓冲液（FCB）之前彻底去除所有质壁分离洗涤液。即使残留少量体积（<当剩余体积为10 µL时，样品更易发生降解，可能导致样品质量差甚至完全失败。这可能是由于酶溶液中存在杂质所致。 （例如 核酸酶，蛋白酶^23,24 在孵育期间以及样品运行间隔期间，即使在低浓度下，也会迅速降解细胞核。另一个重要考虑因素是碘化丙啶（PI）和RNase孵育步骤的持续时间。如实验方案中所述，加入FCB后样品在数小时后便不再稳定，因此研究人员可能需要缩短这些孵育步骤的时间，以适应更多样品的处理，或应对因细胞核浓度过低而导致的长时间流式细胞术检测。这也要求研究人员权衡每个样品获取的事件数与待测样品总数之间的关系，或考虑如前所述使用固定剂。

组织与基因型之间的差异

为了提供能够代表本实验方案的结果，我们设计了两个简单的实验，以验证先前报道的组织间差异，并考察倍性与基因型对结果的影响。组织实验的结果表明，该方案能够产生可重复的结果，因为髓组织再次被证实具有最高的内源性内复制指数（EI）。 somewhat 出乎意料的是，薄壁组织此前从未被评估过，其 EI 值与皮层组织相似，且显著低于髓组织。这一结果出人意料，因为薄壁细胞通常比髓细胞或皮层细胞更大，至少在成熟状态下如此。一种可能的解释是，所用块茎（90–130 g）发育尚不充分，导致构成成熟块茎体积主体的薄壁细胞尚未完全扩展并达到其最大 C 值²⁵。这也可能解释为何双单倍体（VT_SUP_19）及其染色体加倍后的双单倍体（VT_SUP_19 4x）的 EI 显著高于品种 Superior 的块茎；尽管从每种基因型中采集的块茎大小大致相等，但 VT_SUP_19 或其同源四倍体的最大块茎尺寸远小于其亲本。因此，它们表现出更高的 EI 可能仅仅是因为相对于其可达到的最大尺寸而言更大。另一种可能是，VT_SUP_19 从其四倍体亲本继承的基因组组成导致了这一差异。还有一种可能性是，在从四倍体中提取双单倍体过程中发生的基因组缩减可能暴露了有害等位基因，从而引起全株水平的胁迫，而胁迫也已被证明会导致 EI 升高²⁶。然而，这表明研究人员在选择用于比较 EI 值的块茎和组织时必须谨慎，尤其是在不同基因型之间进行比较时。

未来应用

本文所述方案为研究人员提供了理解马铃薯内复制现象的重要工具。该方法可用于研究内复制的遗传和环境影响因素、块茎不同组织发育过程的时间进程，以及自然变异的评估。最终，内复制可能成为改良马铃薯的一个有前景的靶点，而这一目标的实现将依赖于可靠且可重复的评估手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血清移液管	Fisher	13-676-10k	（无菌）
Pipet Aid XP（自动移液器）	Drummond Scientific	4-000-101
锥形管（50 mL）	Thermo Fisher Scientific	339652	（无菌）
微量离心管（1.5 mL）	Globe Scientific	111558
微量离心管（2 mL）	Globe Scientific	111552
真空过滤装置（0.22 µm）（aPES）	Thermo Fisher Scientific	564-0020	（无菌）
真空过滤装置（0.45 µm）（aPES）	Thermo Fisher Scientific	168-0045	（无菌）
纤维素酶 "Onozuka R-10"	Yakult		联系公司
果胶酶 "Onozuka R-10"	Yakult		联系公司
半纤维素酶	Sigma	H2125
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-1
MES 缓冲液	Acros Organics	172590250
Triton X-100	MP Biochemicals	194854
氯化镁（六水合物）	Fisher Scientific	M35-500
氯化钙（二水合物）	Fisher Scientific	C79-500
D-甘露醇	Acros Organics	423922500
MOPS	Acros Organics	17263-0250
磷酸二氢钾（一碱式，无水）	Sigma-Aldrich	P-5379
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	用于流式细胞术样品制备
核糖核酸酶 A	Sigma-Aldrich	R5000	用于流式细胞术样品制备
带打孔器的软木钻	American Scientific	2093-02	用于采集目标组织
镊子	Thermo Fisher Scientific	16-31	用于采集目标组织
手术刀	Thermo Fisher Scientific	08-920B	用于采集目标组织
106 µm 不锈钢筛网或其他相同孔径的筛具	New Jersey Wire Mesh Co.		联系公司