本方案重点介绍果蝇（Drosophila）神经元树突分支复杂性（NDAC）的定量分析，可用于树突形态发生相关研究。
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本文内容
摘要
摘要
树突是神经元的分支状突起，树突形态反映了神经系统发育过程中突触的组织方式。Drosophila 幼虫神经元树突分支（da）是研究神经元树突形态发生及神经系统发育中基因功能的理想模型。da神经元分为四类，其中IV类结构最为复杂，其分支模式几乎覆盖整个幼虫体壁区域。我们先前已通过四个参数表征了沉默Drosophila中SOX5同源基因对IV类神经元树突分支复杂性（NDAC）的影响：树突长度、树突覆盖表面积、总分支数量以及分支结构。本实验方案介绍了NDAC定量分析的工作流程，包括幼虫解剖、共聚焦显微镜成像以及使用ImageJ软件进行图像分析的步骤。进一步深入研究da神经元的发育及其潜在机制，将有助于增进对神经元功能的理解，并为神经系统疾病和神经发育障碍的根本病因提供线索。
引言
树突是神经元的分支状突起，覆盖了神经元接收其他神经元感觉输入和突触输入的区域1,2。树突是突触形成的重要组成部分，在整合突触输入以及在神经元内传递电化学刺激方面发挥着关键作用。树突分支（da）是指神经元形成新的树突结构和分支以建立新突触的过程。树突分支的发育及其形态特征（如分支密度和分组模式）由多步生物学过程决定，并与神经元功能高度相关。本实验方案的目标是提供一种对果蝇（Drosophila）中神经元树突分支复杂性进行定量分析的方法。
树突的复杂性决定了突触类型、连接性以及来自伙伴神经元的输入。分支模式和树突密度参与处理汇聚到树突区域的信号3,4。树突在发育过程中具有可调节的灵活性。例如，在发育阶段以及成熟的神经系统中，突触信号传导会影响体感神经元的树突结构组织5。神经元连接的建立依赖于树突的形态发生和成熟过程。树突的畸形与神经元功能受损相关。研究表明，da神经元形态发生的异常可能与多种神经退行性疾病的病因有关，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS，又称卢·格里克病）6,<....
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方案
1. 实验准备
- 准备以下试剂：杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）；Triton X-100；0.2% PBST（PBS + 0.2% Triton X-100）；32% 多聚甲醛（PFA），使用前稀释至 4%；硅弹性体基液和固化剂；抗荧光淬灭封片剂（例如，ProLong Gold）；以及指（趾）甲油。
- 准备以下设备：解剖显微镜、两把尖头镊子和一把用于显微解剖的剪刀、若干显微解剖用大头针、用于制作解剖皿的培养皿、载玻片和盖玻片、共聚焦显微镜，以及安装了 Fiji ImageJ 软件的计算机。
2. 幼虫采集
- 分别将 UAS-Sox102F-RNAi 果蝇与 UAS-GFP、ppk-GAL4 或 W1118 野生型果蝇杂交。在 25 °C 标准条件下培养果蝇。
- 约 5–6 天后，用镊子小心收集 UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4、UAS-GFP 或 UAS-GFP 以及 ppk-GAL4/+ 对照组的三龄幼虫，用于解剖。
3. 幼虫解剖
注意：本节所有操作均需在解剖显微镜下进行。放大倍数由研究人员自行决定，请尽量调整至最佳视野，建议使用 ~4 - 6X 的放大倍数。
- 将幼虫置于由硅胶弹....
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结果
通过在da神经元胞体及树突分支中共同过表达GFP（UAS-GFP；ppk-GAL4），标记da神经元的树突，用于GFP荧光成像分析。使用倒置共聚焦显微镜对da神经元树突的形态进行成像（图2）。
使用 Fiji ImageJ 软件追踪了 da 神经元的树突。该文件用于估算树突长度（图3）。在三龄幼虫中，da 神经元中沉默 Sox102F（N=21）（UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP）导致树突数量显著减少，分支长度变短，结构更简单，与对照组（N = 20）（UAS-GFP; ppk-GAL4 /+）相比差异明显（图6）。具体而言，Sox102F 被沉默的果蝇其平均树突长度减少至 127 µm，而对照组为 24.......
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讨论
支配表皮的树突是神经元的输入区域，其形态决定了单个神经元如何接收和处理信息。树突形态的发育反映了基因对树突结构的调控作用。Drosophila 外周神经系统中的幼虫da神经元是研究树突发育的重要模型，原因如下：1）与哺乳动物具有功能相似性11,12；2）根据树突结构可分为四类11,12；3）存在调控形态发生的多种遗传因子。在本实验方案中，我们介绍了从幼虫制备到Drosophila da神经元成像分析的完整工作流程。该方法详细描述了分析da神经元树突的四个关键参数：树突长度、表面积、总分支数量以及分支结构。关键步骤是尽可能去除幼虫体壁上的其他组织，以充分暴露da神经元，便于成像和分析。由于Z轴投影图像数量有限，部分短分支可能被截断。由于该方法是相对于对照组进行的树突长度相对测量，因此应对每组da神经元采集大量图像，以增加Z轴投影图像的覆盖范围。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 William A. Eimer 在成像技术方面的协助。本工作由 Cure Alzheimer's Fund [资助 R.E.T]、美国国立卫生研究院 [R01AG014713 和 R01MH60009 资助 R.E.T；R03AR063271 和 R15EB019704 资助 A.L.] 以及美国国家科学基金会 [NSF1455613 资助 A.L.] 提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 硅酮弹性体基础剂与固化剂 | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| 指甲油 | CVS | 72180 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| 培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 镊子 | Dumont | 11255-20 | |
| 剪刀 | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| 昆虫针 | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| 显微镜载玻片和盖玻片 | Fisher Scientific | 15-188-52 |
参考文献
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K.,....
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重印与许可
