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方法文章

神经元树突分支复杂性的定量分析 果蝇

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DOI：

10.3791/57139

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2019年1月7日

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

本文内容

摘要

本方案重点介绍果蝇（Drosophila）神经元树突分支复杂性（NDAC）的定量分析，可用于树突形态发生相关研究。

摘要

树突是神经元的分支状突起，树突形态反映了神经系统发育过程中突触的组织方式。Drosophila 幼虫神经元树突分支（da）是研究神经元树突形态发生及神经系统发育中基因功能的理想模型。da神经元分为四类，其中IV类结构最为复杂，其分支模式几乎覆盖整个幼虫体壁区域。我们先前已通过四个参数表征了沉默Drosophila中SOX5同源基因对IV类神经元树突分支复杂性（NDAC）的影响：树突长度、树突覆盖表面积、总分支数量以及分支结构。本实验方案介绍了NDAC定量分析的工作流程，包括幼虫解剖、共聚焦显微镜成像以及使用ImageJ软件进行图像分析的步骤。进一步深入研究da神经元的发育及其潜在机制，将有助于增进对神经元功能的理解，并为神经系统疾病和神经发育障碍的根本病因提供线索。

引言

树突是神经元的分支状突起，覆盖了神经元接收其他神经元感觉输入和突触输入的区域1,2。树突是突触形成的重要组成部分，在整合突触输入以及在神经元内传递电化学刺激方面发挥着关键作用。树突分支（da）是指神经元形成新的树突结构和分支以建立新突触的过程。树突分支的发育及其形态特征（如分支密度和分组模式）由多步生物学过程决定，并与神经元功能高度相关。本实验方案的目标是提供一种对果蝇（Drosophila）中神经元树突分支复杂性进行定量分析的方法。

树突的复杂性决定了突触类型、连接性以及来自伙伴神经元的输入。分支模式和树突密度参与处理汇聚到树突区域的信号3,4。树突在发育过程中具有可调节的灵活性。例如，在发育阶段以及成熟的神经系统中，突触信号传导会影响体感神经元的树突结构组织5。神经元连接的建立依赖于树突的形态发生和成熟过程。树突的畸形与神经元功能受损相关。研究表明，da神经元形态发生的异常可能与多种神经退行性疾病的病因有关，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS，又称卢·格里克病）6,7,8。在阿尔茨海默病早期即出现突触改变，并伴随神经元功能的下降和损伤7,8。然而，树突病理变化如何具体参与这些神经退行性疾病发病机制的细节仍不明确。

树突的发育受到编码复杂调控网络的基因调控，这些基因包括Wnt蛋白家族9,10、转录因子以及细胞表面受体上的配体11,12。Drosophila da神经元分为四类（I类、II类、III类和IV类），其中IV类da神经元具有最复杂的分支模式，已被广泛用作研究形态发生的有力实验系统13,14。在早期形态发生过程中，在IV类da神经元中对基因进行过表达和/或RNAi沉默会导致分支模式和树突修剪发生改变13。因此，建立一种用于神经元树突分支的定量分析方法具有重要意义。

我们先前已证明，沉默 SOX5 的 Drosophila 同源基因 Sox102F 会导致 da 神经元的树突变短，并降低 IV 类 da 神经元的复杂性15。本文介绍了在 Drosophila 中对神经元树突分支复杂性（NDAC）进行定量分析的实验流程。该方案改编自先前描述的方法，提供了一种简明的方法用于检测 da 感觉神经元的发育情况。本方案展示了对三龄幼虫体壁中 da 神经元进行稳定图像标记的技术16,17,18,19。对于希望在活体（in vivo）条件下研究 NDAC 及发育差异的研究人员而言，这是一项有价值的实验方案。

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方案

1. 实验准备

  1. 准备以下试剂：杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）；Triton X-100；0.2% PBST（PBS + 0.2% Triton X-100）；32% 多聚甲醛（PFA），使用前稀释至 4%；硅弹性体基液和固化剂；抗荧光淬灭封片剂（例如，ProLong Gold）；以及指（趾）甲油。
  2. 准备以下设备：解剖显微镜、两把尖头镊子和一把用于显微解剖的剪刀、若干显微解剖用大头针、用于制作解剖皿的培养皿、载玻片和盖玻片、共聚焦显微镜，以及安装了 Fiji ImageJ 软件的计算机。

2. 幼虫采集

  1. 分别将 UAS-Sox102F-RNAi 果蝇与 UAS-GFP、ppk-GAL4 或 W1118 野生型果蝇杂交。在 25 °C 标准条件下培养果蝇。
  2. 约 5–6 天后，用镊子小心收集 UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4、UAS-GFP 或 UAS-GFP 以及 ppk-GAL4/+ 对照组的三龄幼虫，用于解剖。

3. 幼虫解剖

注意：本节所有操作均需在解剖显微镜下进行。放大倍数由研究人员自行决定，请尽量调整至最佳视野，建议使用 ~4 - 6X 的放大倍数。

  1. 将幼虫置于由硅胶弹性体基质和组织培养培养皿制成的解剖皿上。
  2. 用解剖针固定幼虫的口钩，使背侧朝上，然后固定幼虫尾部。尽可能将背侧置于中央位置，以暴露中线，该中线将作为打开的标记线。
  3. 向幼虫加入 200 µL PBS，以保持组织湿润。
  4. 使用剪刀沿气管之间的背中线从尾端向头端剪开，并在幼虫身体的四个角各做一小切口。
  5. 在身体的四个角各插入一枚解剖针，使组织平展。
  6. 在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定幼虫体壁 25 分钟。
  7. 用 PBST 洗涤 5 分钟，重复洗涤两次。
  8. 从组织上移除解剖针，然后将组织转移至载玻片上，加入抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片。室温下干燥 1 小时后，用指甲油封固盖玻片边缘。

4. 成像处理

注意：图像使用倒置共聚焦显微镜系统拍摄。建议用户使用 20X 物镜对样本进行拍照。

  1. 采集Z系列图像。在共聚焦显微镜软件中打开"采集Z系列"对话框。确定采集Z系列图像的范围。
    1. 点击"顶部和底部"按钮。确定顶部和底部位置，并将数值分别输入到"底部："和"顶部："输入框中。在"采集Z系列"对话框中将"步进"设置为0.5 µm。然后点击"立即运行"按钮以获取Z系列图像。
  2. 将获得的图像保存为*.tiff或*.nd2文件。
  3. 成像后将载玻片存放在4 °C的避光盒中。

5. 树突评估

注意：在UAS-GFP和ppk-GAL4果蝇的da神经元中共同过表达GFP蛋白，用于GFP荧光成像分析。对三龄幼虫中da神经元的长度、分支及结构进行了定量分析。分析参数包括树突长度（µm）、表面积（µm2）、总分支数以及分支结构（%）。图1详细展示了这些分析参数。

  1. 树突长度
    注意：树突长度是示踪插件中标记的所有树突长度的总和。
    1. 设置并运行 Fiji ImageJ 软件（https://fiji.sc/）20 。如果图像包含多个通道，请将图像拆分为独立通道。
      ​注意：本实验方案中的图像仅包含一个 GFP 通道。
    2. 在软件中执行 "图像 | 叠加 | Z 投影" 以生成 Z 投影图像；新窗口将显示为“Z-投影”。在投影类型中选择 "最大强度"，并根据个人需求设置起始切片和终止切片的编号，然后点击 "确定”。将生成一张清晰显示树突投影的 Z 投影图像。
    3. 追踪神经突。
      1. 在窗口中选择 "插件 | 分割 | 简单神经突追踪器" 来追踪树突。找到神经元胞体，然后在从胞体起始的一条树突上点击一个起点，在该树突末端再点击一个终点。
        注意：程序将用一条蓝色线连接这两个点。
      2. 如果路径清晰，按插件窗口中的 "Y" 键；树突路径将沿可见图像中选定路径的终点进行追踪。在同一个插件窗口中点击 "完成路径"，该段路径即完成（图 2）。
        注意：某些树突末端距离起点较远，此时路径可划分为多个小段。这些小段可合并，以提供完整的示踪路径。
    4. 完成一段路径后，返回分支点处的新起点继续追踪。新路径可继续构建；"所有路径" 窗口框将显示所有路径的长度值（图 3）。保存追踪文件，并继续完成未完成的追踪，如 图 2 所示。
    5. 在“插件”窗口中点击 "文件 | 导出为 *.cvs"，导出树突长度数据。然后将所有路径长度相加，并将数据导入数据分析/电子表格软件（图 3）。
  2. da 神经元的表面积
    1. 在“Fiji ImageJ”窗口中选择自由手绘工具。沿轮廓绘制路径，然后连接起点与终点。从“分析”菜单中选择 "设置测量值 | 面积”。然后从“分析”菜单中点击 "测量"。结果将在新弹出的窗口中显示所选区域的面积值（图 4）。将该数值复制到数据分析软件中。
  3. da 神经元的总分支数及分支结构
    1. 在追踪插件窗口中打开 "分析"，然后选择 "渲染 | 分析骨架化路径"，以计算总分支数（图 5）。
      注意：树突分支结构按分支层级进行划分。路径定义为从胞体到树突末端之间的连接，一条路径可包含多个分支。例如，一级分支（primary arbors）指直接从神经元胞体发出的树突；二级分支（secondary arbors）指从一级分支上发出的分支，依此类推，包括三级、四级和五级分支。树突分支结构根据分支层级进行分类。例如，一级分支百分比（primary %）为一级分支数量除以总分支数，其余类推。

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结果

通过在da神经元胞体及树突分支中共同过表达GFP（UAS-GFP；ppk-GAL4），标记da神经元的树突，用于GFP荧光成像分析。使用倒置共聚焦显微镜对da神经元树突的形态进行成像（图2）。

使用 Fiji ImageJ 软件追踪了 da 神经元的树突。该文件用于估算树突长度（图3）。在三龄幼虫中，da 神经元中沉默 Sox102F（N=21）（UAS-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; UAS-GFP）导致树突数量显著减少，分支长度变短，结构更简单，与对照组（N = 20）（UAS-GFP; ppk-GAL4 /+）相比差异明显（图6）。具体而言，Sox102F 被沉默的果蝇其平均树突长度减少至 127 µm，而对照组为 24...

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讨论

支配表皮的树突是神经元的输入区域，其形态决定了单个神经元如何接收和处理信息。树突形态的发育反映了基因对树突结构的调控作用。Drosophila 外周神经系统中的幼虫da神经元是研究树突发育的重要模型，原因如下：1）与哺乳动物具有功能相似性11,12；2）根据树突结构可分为四类11,12；3）存在调控形态发生的多种遗传因子。在本实验方案中，我们介绍了从幼虫制备到Drosophila da神经元成像分析的完整工作流程。该方法详细描述了分析da神经元树突的四个关键参数：树突长度、表面积、总分支数量以及分支结构。关键步骤是尽可能去除幼虫体壁上的其他组织，以充分暴露da神经元，便于成像和分析。由于Z轴投影图像数量有限，部分短分支可能被截断。由于该方法是相对于对照组进行的树突长度相对测量，因此应对每组da神经元采集大量图像，以增加Z轴投影图像的覆盖范围。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 William A. Eimer 在成像技术方面的协助。本工作由 Cure Alzheimer's Fund [资助 R.E.T]、美国国立卫生研究院 [R01AG014713 和 R01MH60009 资助 R.E.T；R03AR063271 和 R15EB019704 资助 A.L.] 以及美国国家科学基金会 [NSF1455613 资助 A.L.] 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 硅酮弹性体基础剂与固化剂Dow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36931
指甲油 CVS72180
体视显微镜NikonSMZ800
共聚焦显微镜NikonEclipse Ti-E
培养皿Falcon353001
镊子Dumont11255-20
剪刀 Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
昆虫针 Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
显微镜载玻片和盖玻片Fisher Scientific15-188-52

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