嗜德维人神经元树突状树突状复杂度的定量分析

Summary

该方案的重点是定量分析嗜德维拉中的神经元树突状树突状树突状树突状的复杂性 (ndac), 可用于树突状形态发生的研究。

Abstract

树突是神经元的分枝投射, 树突形态反映了神经系统发育过程中的突触组织。嗜酸菌幼虫神经元树突树化 (da) 是研究神经系统发育过程中神经树突形态发生和基因功能的理想模型。有四类大神经元。第四类是最复杂的, 有分支图案, 几乎覆盖幼虫体壁的整个区域。我们以前用四个参数描述了sox5的嗜酸性粒正无量表对 iv 类神经元树突树树状树突状树突状树突状复杂性 (ndac) 的影响: 树突长度、树突覆盖的表面积、分支的总数, 和分支结构。该协议介绍了 ndac 定量分析的工作流程, 包括幼虫解剖、共聚焦显微镜和利用 imagej 软件进行图像分析的过程。进一步洞察 da 神经元的发育及其潜在机制将提高对神经元功能的理解, 并提供有关神经和神经发育障碍的根本原因的线索。

Introduction

树突是神经元的分枝突起, 它覆盖的领域包括神经元从其他神经元^1,2的感觉和突触输入。树突是突触形成的重要组成部分, 在整合突触输入以及在神经元中传播电化学刺激方面发挥着至关重要的作用。树突状树状树状树状化 (da) 是一个过程, 神经元通过这个过程形成新的树突树和分支, 形成新的突触。da 的发育和形态, 如分支密度和分组模式, 是多步骤生物过程的结果, 与神经元功能高度相关。该方案的目的是为五味子中神经元树突菌的复杂性的定量分析提供一种方法。

树突的复杂性决定了伙伴神经元的突触类型、连通性和输入。分枝模式和树突密度参与处理收敛到树突场 3^,4的信号。树突在发展中具有调整的灵活性。例如, 突触信号对发育阶段和成熟神经系统的体感神经元的树突组织有影响.神经元连接的建立依赖于树突的形态发生和成熟。树突畸形与神经元功能受损有关。研究表明, da 神经元形态发生的异常可能会导致多种神经退行性疾病的病因, 包括阿尔茨海默氏症 (ad)、帕金森病 (pd)、亨廷顿病 (hd) 和卢格里格病/肌萎缩侧索硬化症 (als)^6,....

Protocol

1. 实验准备

1. 制备以下试剂: dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs);triton x-100;0.2% pbst (pbs + 0.2% triton x-100);32% 的甲醛 (pfa), 稀释成 4%, 使用前;有机硅弹性体基座及固化剂;防褪色安装介质 (例如, prolong gold);和指甲油。
2. 准备以下设备: 解剖显微镜、两个锋利的钳子和一把用于显微解剖的剪刀、一些用于显微解剖的针脚、制作解剖盘的培养皿、显微镜幻灯片和覆盖物、共聚焦仪和计算机与斐济 imagej 软件安装。

2. 幼虫采集

1. 配合 uas-sox102f-rnai 分别与 uas-gfp、ppk-gal4 或 w¹¹¹⁸野生苍蝇飞行。养殖在25°c 的标准条件下飞行。
2. 在 ~ 5-6天内, 收集 uas-sox102f-rnai/ppk-gal4、uas-gfp 或 uas-gfp 的第三幼虫, 并小心地使用钳子进行解剖。

3. 幼虫的解剖

注: 本节中的所有程序均在显微解剖显微镜下操作。放大倍率由调查人员决定。尝试调整到最佳的视觉视图。~ 4-6x 放大倍率的建议。

1. 将幼虫放在由有机硅弹性体基座和组织培养培养皿....

Results

在 gfp 荧光成像分析中, 用共过度表达的 gfp (uas-gfp; ppk-gal4) 标记了 da 神经元的树突, 用于 gfp 荧光成像分析。用倒置共聚焦显微镜对达神经元树突的形态进行了成像 (图 2)。

利用斐济 imagej 软件追踪了 da 神经元的树突。该文件用于估计枝晶长度 (图 3)。sox102f在 da 神经元 (nuct21) (uas-sox102f-rnaice/gal4) 中的沉默uas-gfp) 导致树突的数量显著减少, 分支长度较短, 与第三幼虫的对照 (n = 20) (uas-gfp; ppk-gal4/+) 相比, 结构更简单 (图 6)。具体而言, sox102f沉默的苍蝇的平均树突长度从对照中.......

Discussion

支配表皮的树突是神经元的输入区域, 它们的形态决定了单个神经元如何接收和处理信息。枝晶形态的发展反映了枝晶组织的基因调控。外周神经系统的山龙幼虫是研究树突发育的重要模型, 因为: 1) 与哺乳动物^功能相似 11^,12;2) 基于枝晶结构^{11、12 的}四个类区别;3) 调节形态发生的遗传因素。在该协议中, 我们提出了从幼虫准备到红景天神经元图像分析的工作流程。这些方法详细描述了分析大神经元树突的四个重要参数, 即树突的长度、表面积、分枝总数和分枝结构。关键的一步是从幼虫体壁中取出尽可能多的组织, 以充分暴露 da 神经元进行成像和分析。由于 z 投影图像的数量有限, 可能会有一些短分支被切断。由于该方法是对树突长度与对照相比的相对测量, 因此应为每一组大神经元拍摄大量图像, 以增加 z 投影图像的覆盖范围。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco Life Sciences	10010-023
TritonX-100	Fisher Scientific	9002-93-1
多聚甲醛 （PFA）	电子显微镜科学	15714-S
Sylgard 184 有机硅弹性体基础和固化剂	道康宁公司	3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold抗淬灭封固剂Thermo	Fisher Scientific	P36931
油	CVS	72180
体视显微镜	尼康	SMZ800
共聚焦显微镜	尼康	Eclipse Ti-E
培养皿	Falcon	353001
镊子	Dumont	11255-20
剪刀	Roboz 手术器械公司	RS-5611
昆虫针	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6082-25
显微镜载玻片和盖玻片	Fisher Scientific	15-188-52