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利用乳腺癌存档样本优化基于RNA的多重表达检测方法

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DOI：

10.3791/57148

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2018年8月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta, 2Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta, 3Department of Physiology & Biochemistry, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta

本文内容

摘要

核酸在存档组织中的降解、肿瘤异质性以及缺乏新鲜冷冻组织样本，可能对全球病理学实验室的癌症诊断服务产生不利影响。本文描述了利用多重磁珠检测技术优化一组生物标志物，用于乳腺癌的分类。

摘要

核酸降解、肿瘤异质性以及缺乏新鲜冷冻组织样本可能对全球病理实验室的癌症诊断服务产生不利影响。使用存档材料或需要运送到检测实验室的样本进行基因扩增和表达诊断检测时，需要一种更稳健且准确、并适应当前临床工作流程的检测方法。我们的研究团队优化了 Invitrogen™ QuantiGene™ Plex 检测法（Thermo Fisher Scientific）的应用，利用 Luminex xMAP® 磁珠上的分支DNA（bDNA）技术对存档材料中的RNA进行定量。本论文所述的基因表达检测是一种新颖、快速且可多重检测的方法，能够准确将乳腺癌分类为不同的分子亚型，避免了成像技术固有的主观解读问题。此外，由于该方法所需样本量极少，可利用苏木精和伊红（H&E）染色切片对异质性肿瘤进行激光显微切割。该方法具有广泛的应用前景，包括具有诊断潜力的肿瘤分类以及液体活检中生物标志物的检测，从而有助于改善患者管理和疾病监测。此外，在存档材料中对生物标志物进行定量检测在肿瘤学研究中具有重要价值，尤其可利用带有临床注释的样本库开展回顾性研究，以验证潜在生物标志物及其与临床结局的相关性。

引言

利用存档的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本优化基于RNA的检测具有挑战性，原因在于手术组织处理过程的差异性以及用于维持组织完整性的甲醛所导致的RNA降解1,2。为了克服从存档样本中开展准确基因表达研究的局限性，本研究团队采用了bDNA多重磁珠检测技术。该技术不依赖于靶标模板的酶促扩增，而是通过特异性探针的杂交及报告信号的放大来实现检测3。捕获探针和检测探针的短识别序列被设计为可与靶RNA的短片段进行杂交4。此外，该检测直接以组织匀浆作为起始材料，避免了需要预先提取和纯化RNA所不可避免的RNA损失。信号放大、短识别序列的应用以及省略纯化步骤，共同降低了检测的技术变异。该技术可实现多重检测（最多可同时检测80个RNA靶标），并能够在样本投入量较低的情况下对一组靶标进行表达水平测定。本方案描述了用于激光显微切割的组织样本制备与染色步骤。膜片上的染色有助于观察肿瘤及组织学结构，从而实现对以下目标的精确定位与分析：（1）乳腺组织中的肿瘤组织与正常导管；（2）异质性肿瘤内的恶性细胞克隆。

乳腺癌的分子分类是一种通过检测分子标志物将患者肿瘤分为三种分子类别的过程， 即，管腔型、人表皮生长因子受体2（HER2）富集型和基底样型。HER2富集型特征明确，由于ERBB2基因扩增导致HER2受体高表达，同时雌激素受体（ER）和孕激素受体（PgR）表达低或缺失。管腔型通常ER阳性，而基底样型一般对三种受体（HER2、ER、PgR）均为阴性，且与三阴性乳腺癌（TNBC）诊断亚型存在显著重叠5,6其他标志物用于确定上皮和间充质特征。纤维连接蛋白（FN1）是乳腺组织间充质区室的主要成分。FN1表达升高常伴随Ki67染色增强，提示肿瘤更具侵袭性7,8 并与转移相关9有趣的是，研究发现FN1存在于源自肿瘤细胞的微囊泡中，可诱导受体成纤维细胞中促有丝分裂信号的激活。10因此，外泌体等循环微囊泡可能是早期检测以及转移和复发的潜在标志物11.

乳腺癌转录亚型分析中的肿瘤区域选择通常通过大体解剖完成12,13。为克服组织异质性并提高检测灵敏度，我们已可靠地将经典组织染色与多重分子谱分析方法相结合。作为原理验证，两种不同的乳腺癌克隆已根据其上皮-间质特征及转移潜能被明确区分。本方案所述工作流程可轻松整合至当前临床操作中，用于通过靶向mRNA谱分析选择性分离并表征组织亚型。

方案

本研究使用乳腺组织材料的伦理批准已由马耳他大学大学研究伦理委员会（UREC）批准（编号：22/2012）。

1. 组织制备

  1. 采用适当的苏木精-伊红（H&E）染色程序14，制备染色后的参考组织切片，并对玻片进行数字扫描，以便在显微切割过程中作为参考。
  2. 使用切片机将20 µm厚的组织切片切入40 °C的无RNase水浴中。使用洁净且经RNase去污染的设备和材料，将切片收集到用于激光显微切割的膜载玻片上。
  3. 将膜载玻片置于37 °C的干燥培养箱中过夜干燥。采用适当的H&E染色程序15，使用分子生物学级试剂进行染色，并将苏木精染色时间延长至6分钟。如有需要，可按照相应的免疫组织化学染色方案16对膜载玻片进行染色。

2. 激光显微切割

  1. 设置切片限位并校准载物台移动。
    1. 将激光视野移至膜片的空白区域。通过以递增的聚焦间隔（5%）发射激光脉冲，校准激光焦点，直至激光开始穿透膜片。绘制并进行任意形状的显微切割，精细调节激光焦点以在激光切割过程中最大化激光效率。
    2. 将载物台移动速度提高至不影响激光切割效率的程度。在选定的物镜下校准激光，若更换物镜则需重新校准（使用4X物镜时，激光速度设为1–15%，聚焦设为70–75%，功率设为90–100%）。
  2. 使用4X物镜扫描染色后的膜片。
  3. 在膜片上选择目标区域并用圆圈标出。激光显微切割的面积至少为42 mm2。记录切割面积，以确定所需样本匀浆缓冲液的体积。
  4. 使用帽提升机制，将切割下的组织转移至已标记管子的扩散帽上，管子应连接至相应的附件。若切割下的组织未成功转移至帽上，请重复对该区域进行激光切割。

3. 组织裂解

注意：多种溶液和材料随 材料表 中提及的试剂盒一并提供。

  1. 使用裂解液与蛋白酶K按60:1的比例配制所需体积的匀浆混合液，用于样品裂解。
  2. 每1 mm2组织面积，向每支离心管中加入2.4 µL匀浆液，最大转速涡旋震荡10秒，然后在室温下以2,500 × g离心5秒。
  3. 在65 °C加热金属块中振荡孵育12–18小时，振荡频率为600 rpm。
  4. 在室温下以21,000 × g离心裂解液5分钟。
  5. 使用移液器小心吸取澄清的上清液，并转移至已标记的新离心管中。避免吸取组织/膜碎片，以免影响结果质量。
  6. 将澄清的上清液储存于-80 °C超低温冰箱中。

4. 基于杂交的检测

  1. 进行以下准备工作。
    1. 将试剂瓶置于37 °C培养箱中预热30分钟，并通过轻轻颠倒混匀裂解液混合物。
    2. 若组织匀浆样品为冷冻状态，请在室温下解冻，并于37 °C孵育30分钟。孵育结束后，以最大速度涡旋震荡样品。
    3. 将振荡培养箱设定为54 °C，并将温度验证套件的探针插入96孔板的一个空孔中。2小时后检查数字温度计读数，并调节振荡培养箱的温差校正值，以校正任何温度偏差。
    4. 解冻探针组和封闭试剂，涡旋震荡10秒，室温下以2,500 × g离心5秒，随后置于冰上保存。
    5. 使用过程中将蛋白酶K小瓶保持在冰上。
    6. 以46 kHz对捕获磁珠进行超声处理3分钟，随后以最大速度涡旋震荡3分钟。
  2. 按比例配制每孔25 µL的工作磁珠混合液：每孔加入4.25 µL无核酸酶水、16.65 µL裂解液混合物、1.00 µL封闭试剂、0.10 µL蛋白酶K、0.50 µL捕获磁珠和2.50 µL探针组。
  3. 以最大速度涡旋震荡工作磁珠混合液10秒，然后每孔加入25 µL至磁分离板中。
  4. 向磁分离96孔板中每孔加入25 µL组织匀浆液，并向3个孔中各加入25 µL匀浆溶液作为空白对照。
  5. 使用透明塑料压封膜密封磁分离板，并将板置于54 ± 1 °C的振荡培养箱中，以600 rpm振荡孵育18–22小时。
  6. 为24个孔配制1X洗涤缓冲液：将31.5 mL无RNase水与0.1 mL洗涤缓冲液组分1和1.67 mL洗涤缓冲液组分2混合均匀。
  7. 从培养箱中取出反应板，将振荡培养箱温度设定为50 ± 1 °C。
  8. 将磁分离板安装至手持式磁板洗涤器上并锁定位置。移除压封膜，静置1分钟，使磁珠充分沉降。
  9. 洗涤步骤：将安装在洗涤器上的磁分离板倒置于水槽上方，轻轻在纸巾上吸除残留液体。使用多通道移液器向每孔加入100 µL 1X洗涤缓冲液，静置15秒。重复此步骤共洗涤3次。
  10. 向每孔加入50 µL预扩增试剂。用铝箔板封膜密封反应板，在室温下以800 rpm振荡1分钟。随后在50 ± 1 °C、600 rpm振荡条件下孵育1小时。
  11. 重复步骤4.9（洗涤步骤）。
  12. 向每孔加入50 µL扩增试剂。用铝箔板封膜密封反应板，振荡方式同步骤4.10。
  13. 重复步骤4.9（洗涤步骤）。
  14. 以最大速度涡旋震荡标记探针10秒。向每孔加入50 µL标记探针。密封后振荡反应板（操作同步骤4.10）。
  15. 重复步骤4.9（洗涤步骤）。
  16. 以最大速度涡旋震荡链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE）10秒。向每孔加入50 µL SAPE。密封后振荡反应板（操作同步骤4.10）。
  17. 重复步骤4.9（洗涤步骤），但使用SAPE专用洗涤缓冲液代替常规洗涤缓冲液。
  18. 向每孔加入130 µL SAPE洗涤缓冲液，并用铝箔板封膜密封反应板。在室温下以800 rpm振荡3分钟。
  19. 启动磁珠分析仪。按照制造商说明执行校准和验证程序。
  20. 在磁珠分析仪上设置分析方案，参数如下：样本体积：100 µL；DD门控：5,000–25,000；超时时间：90秒；磁珠事件/磁珠区域：100；点击下一步。在面板中选择相应的磁珠编号，并根据制造商指示定义各磁珠区域对应的目标基因。
  21. 在批次选项卡中选择“使用现有方案创建批次”以添加新的分析任务。在板布局中将各孔分别指定为未知样本或空白，并在样本面板中为每个样本添加标签。
  22. 移除96孔反应板上的铝箔封膜。点击弹出按钮推出载板托架，将反应板装入磁珠分析仪。点击收回|运行批次启动分析。读数完成后，弹出并取出96孔板。按照制造商建议清洁并关闭磁珠分析仪。

5. 数据分析

  1. 在 Batch| Results 选项卡中，选择相应的分析文件，然后点击 export to.csv 按钮。使用电子表格软件打开该 .csv 文件。
  2. 观察微球计数，剔除任何微球数 < 40 个/区域的结果。
  3. 计算空白孔的平均值，并计算每个目标基因的标准差（SD）和检测限（LOD）（空白平均值 + (3×SD)）。将低于 LOD 的值设为未检出。
    注意：如果任何归一化表达值为未检出，则认为该样本数据不充分。若表达值超过 20,000，则视为超出上限灵敏度。这些样本的裂解液应稀释后重新分析。
  4. 从每个基因的原始数据中减去空白孔的平均值。
  5. 计算每个样本中选定的归一化基因的几何平均值。将各个样本数据归一化至相应的几何平均值。
  6. 在数据科学平台中或使用预定义算法分析数据。
    1. 通过点击 Add Data 将数据导入数据科学平台。将数据文件拖入 Process Workspace，并连接至 [Select Attributes] 操作符，再连接至 Principal component analysis (PCA) 操作符，最后连接至 result 端口。
    2. 在 Select Attribute 操作符中，选择归一化基因数据的子集以及一个名义变量（如乳腺癌亚型）。点击 Play 运行流程。在 Charts 选项卡中，选择图表样式为“Scatter 3D Color”，并在 Color 字段中选择该名义变量。通过三维散点图评估 PCA 数据的变异性。

结果

本方法已用于同时检测苏木精-伊红（H&E）染色（图1）、显微切割（图2）获得的、高度降解的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的40种转录本。利用该方法，我们实现了对受体状态的精确表征（图3A），将肿瘤准确分类为管腔型和基底型分子亚型17，并在不同受体阳性与阴性亚型中，比较肿瘤组织与其配对对照组织，揭示了间充质标志物FN1的差异表达（图3B）。

染色与未染色肿瘤裂解液的相关性分析图，线性拟合 R²=0.987。
图1：使用苏木精-伊红（H&E）染色材料进行基因表达分析。 由未染色肿瘤切片与染色肿瘤切片获得的基因表达谱之间的相关性。[皮尔逊相关性 p 值 = 5.34E-26]。经许可转载17。 请点击此处查看该图的高清版本。

组织样本的组织学分析；显微镜图像显示细胞结构，比例尺为100μm。
图2：FFPE组织的激光显微切割。（A）H&E染色切片；（B）ER表达的免疫组织化学染色；（C）HER2免疫组织化学染色；（D）未染色的20 µm厚切片，置于激光显微切割膜载玻片上。黄色箭头指示侵袭性肿瘤区域，由于缺乏染色而边界不清。（E）经H&E染色的20 µm厚切片，以更清晰地界定感兴趣区域。白色箭头指示激光切割轨迹，红色箭头显示切割过程中的激光焦点。所有图像均在10倍放大倍数下采集。请点击此处查看本图的高清版本。

HER2/ER/TNBC受体状态、FN1标志物表达箱线图、组织来源比较、统计学数据
图3：乳腺肿瘤与配对正常组织中（A）受体状态和（B）间充质标志物FN1的表达情况 经典的乳腺癌诊断亚型根据免疫组织化学和荧光检测的诊断结果进行定义 原位 荧光原位杂交（FISH）用于HER2免疫组织化学染色结果不确定的检测。标准化表达的（AHER2 和 ER，（B) 通过基于杂交的检测方法测量的FN1在HER2阳性、ER阳性以及三阴性乳腺癌病例中，与患者自身匹配的正常乳腺组织进行了比较。Kruskal-Wallis检验统计量（K-W χ2) 表明 HER2 的表达显著（p < 在HER2阳性队列中，肿瘤组织中的表达显著高于配对的正常组织（P < 0.05），而在三阴性乳腺癌（TNBC）队列中则显著降低。在ER阳性队列和TNBC队列中，肿瘤组织与配对正常组织相比，ER表达水平未见显著升高。FN1在HER2阳性及ER阳性亚型的肿瘤组织中显著升高，在TNBC队列中也呈现肿瘤组织表达升高的趋势。 请点击此处查看该图的放大版本。

肿瘤组织学分析；显微镜图像及显示不同肿瘤中基因表达的图表。
图 4：病例研究：肿瘤异质性。 形态学上不同的肿瘤被显微分离，并作为独立样本处理。(A) H&E 染色切片的主扫描图。(B、C) 分别为每种识别出的肿瘤形态的 10 倍和 40 倍放大图像。(D) ER 的免疫组化染色（10 倍放大）。(E) Ki67 的免疫组化染色（10 倍放大），显示肿瘤 1 具有更高的有丝分裂活性。(F) 每个肿瘤中 ESR1 基因的标准化表达水平，结果显示各肿瘤间表达相对较高且相等，与免疫组化结果一致。(G) FN1（一种间充质标志物）的标准化表达水平，其中 FN1 表达升高伴随强 Ki67 染色，提示更具侵袭性的肿瘤表型。在肿瘤 2 中则观察到相反情况，其表现为增殖较慢、恶性潜能较低的肿瘤，表现为 FN1 表达降低。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

已优化基于微珠的多重bDNA检测方法，用于定量分析来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺癌组织和正常乳腺导管的降解RNA中的基因表达。该检测方法的优化包括开发一种算法，利用8种已知的生物标志物和5种潜在的标准化基因，对乳腺癌肿瘤进行管腔型和基底型亚型分类。数据标准化通过标准化基因的不同组合进行。标准化基因的选择依据是利用管腔/基底分类基因对受体状态具有最佳预测能力。为从FFPE组织中分类管腔/基底亚型，所选的标准化基因为β-肌动蛋白（ACTB）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）。

在适当选择标准化基因集后，该方法可适用于其他诊断和研究领域。该方法在科研领域的一个重要应用是检测具有完善临床结局注释的存档样本中的生物标志物。这能够在回顾性研究中快速、准确地验证潜在的预测性标志物，避免开展长期的前瞻性研究以等待无病生存期和总生存期数据。目前，我们课题组正在研究利用该检测方法来识别受体阳性外泌体，这需要开发一种新的算法，采用不同的标准化基因进行数据归一化。液体活检与可靠的基因表达检测技术相结合，将实现高通量多重检测，适用于治疗过程中对患者的管理，并为监测治疗效果、因治疗耐药导致的潜在复发以及肿瘤的转移能力提供手段。

该方法在肿瘤诊断中也具有广泛的应用前景，并可适应当前的诊断工作流程。该方法在诊断领域的主要优势包括：（1）可实现高通量检测；（2）避免基于图像测量所带来的主观性和结果不确定性；（3）能够同时准确检测多个靶标，从而提高检测准确性并最大限度减少对珍贵患者样本的消耗；（4）无需高度专业化的设施和人力资源。优化的取样流程，结合基于微球的多重检测对起始材料需求量低的特点，使得对肿瘤异质性的进一步研究成为可能；通过激光显微切割技术，可从同一样本切片中精确分离出多个恶性组织病灶，进而比较它们之间的多个基因表达水平，并与配对的正常组织进行对比（图4）。低样本投入量对于仅能提供有限肿瘤组织的活检样本的诊断应用至关重要。该检测方法能够从降解的RNA样本中测量基因表达，便于样本在机构内部或送往检测实验室过程中的运输。此外，也可使用苏木精和伊红（H&E）染色的组织全切片进行分析（图1）。

要确保本实验方案的成功，必须做到以下两点：（1）对用于裂解检测的肿瘤部位进行恰当取样；（2）针对每种基因表达检测 panel 和/或各个预后或预测性生物标志物，开发经过充分优化和验证的数据标准化算法。前者取决于执行取样的技术人员或科研人员的技术经验。建议额外采集一个组织核心样本，并以与多重磁珠检测相同的格式（96孔板格式）制备组织微阵列（TMA）。这将为RNA检测所用样本中的肿瘤部位提供一份存档复制品。TMA还可用于其他技术手段，以开展后续研究或结果验证。标准化算法的开发取决于所研究的样本材料以及所选用的标准化基因。根据所分析样本中基因表达水平及其变异程度，需选择不同的标准化基因组合；该组合在不同来源的癌组织、血浆来源的外泌体或循环肿瘤细胞之间可能存在差异。检测方法的验证应包括样本处理过程，因为不同的样本制备方式也会导致不同的标准化算法。

综上所述，将bDNA技术与磁珠技术结合，并选择适当的目标基因组合，能够直接检测由少量患者样本（包括显微切割组织、外泌体和循环肿瘤细胞）制备的组织裂解液中的基因表达，从而获得额外优势。除了可检测肿瘤异质性外，合理使用基因组合还有望检测肿瘤来源的外泌体，用于早期诊断及复发的早期发现。由于无需核酸扩增步骤，利用bDNA技术进行信号放大，结合基于磁珠的多重检测方法，可在具有临床注释的存档样本中同时测定多个基因的表达水平，为生物标志物的验证提供宝贵资源。

披露

Invitrogen™ QuantiGene™ Plex 检测试剂盒 是赛默飞世尔科技公司的专有财产 Fisher Scientific 本视频文章的制作和开放获取出版由Luminex Corporation赞助。

致谢

本工作获得以下资助：（1）由乳腺癌防治基金会和ALIVE 2013通过研究、创新项目资助的乳腺癌研究项目奖学金（2014–2016） & 马耳他大学研究与创新信托基金（RIDT），（2）医学院 & 外科学，马耳他大学，以及（3）由马耳他科学理事会资助的ACT项目 & 技术通过融合：R&I 技术开发计划 2016。本论文的发表由 JoVE-Luminex 基金资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
切片机LeicaRM2235
迈耶氏苏木精染液SigmaMHS16-500mL
伊红Y水溶液SigmaHT110216-500mL
正常兔血清MonosanMONX10963工作稀释比例：1/40
生物素标记兔抗小鼠二抗DakoE0354工作稀释比例：1/200
ER抗体（6F11）Vector LaboratoriesVPE614工作稀释比例：1/45
HER2抗体（CB11）NovocastraCB11-L-CE工作稀释比例：1/325
Ki67抗体（MIB-1）DakoM7240工作稀释比例：1/500
亲和素-生物素复合物试剂盒Vector LaboratoriesPK-6100
尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜NikonTi-E配备4x、10x、20x和40x物镜
激光显微切割膜Molecular Machines &IndustriesS0103
mmi CellCamera 1.4Molecular Machines &IndustriesMX4285c-ACK07
mmi Cellcut PlusMolecular Machines &Industries
扩散帽Molecular Machines &Industries50210
mmi Celltools 软件 v.4.01rclMolecular Machines &Industries
Eppendorf Thermomixer comfort 恒温混匀仪Eppendorf5355000038
Eppendorf Thermomixer用1.5 mL加热模块Eppendorf22670522
Eppendorf Thermomixer用96孔板加热模块Eppendorf22670565
Labnet Vortemp 56 振荡培养箱Labnet52056A-220
LX200 100/200Luminex磁珠分析仪
Invitrogen QuantiGene样本处理试剂盒 - 石蜡包埋组织ThermoFisher ScientificQS0109
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 检测试剂盒（磁性分离）ThermoFisher ScientificQP1011
Thermaseal RTS 密封膜Thermaseal765246
手持式磁性板洗板机ThermoFisher ScientificQP1011
Invitrogen QuantiGene 孵育器温度验证试剂盒Affymetrix/PanomicsQS0517
蛋白酶K（50µg/µL）ThermoFisher Scientific14622
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 检测组ThermoFisher ScientificVarious
多速涡旋振荡器Kisker BiotechMSV-3500
超声波破碎仪Silvercrest
RNASEZAPSigmaR2020-250ML
铝制96孔板密封膜SigmaZ721549-100EA
温度验证试剂盒ThermoFisher ScientificQS0517
RapidMiner Studio 社区版 7.1.001RapidMiner数据科学平台
杂交炉Hybaid (Thermo Scientific)

参考文献

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