本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞应能对受周围细胞多种因素影响的时变环境做出适当响应。Notch 信号通路是介导细胞间通讯的关键分子机制之一，在胚胎正常发育过程中发挥重要作用。该通路涉及具有超昼夜节律的振荡信息在细胞间的传递，但尽管分子生物学技术已取得进展，阐明多细胞相互作用对振荡基因动态的影响仍具挑战性。本文介绍了一种可实现光遗传学控制并以精确时间分辨率实时监测基因表达模式的实验方案。该方法成功揭示了Notch信号的细胞内和细胞间周期性输入可通过频率调谐和相位移动，在单细胞水平上同步内在的振荡行为。该策略适用于分析多种信号通路的动态特征，为研究多细胞系统中基因表达程序的动态功能意义提供了独特的平台。
引言
细胞间的通讯在发育过程中胚胎图式形成中起着至关重要的作用。在脊椎动物胚胎中，称为体节的节段性结构在体轴的前后方向上以精确的时间准确性形成，这一过程受一种称为“体节化时钟”的计时机制调控1。在此过程中，一群原节中胚层（PSM）细胞会以同步的方式周期性地转化为体节。该过程涉及基因表达的同步振荡，处于同相振荡的PSM细胞将形成同一个体节。在小鼠中，基因振荡的周期约为2至3小时，在斑马鱼中则约为30分钟。当PSM细胞被分离后，其振荡同步性会丧失2,3；但当它们重新聚集时，能够自我组织并恢复群体的同步性4，这表明细胞间的耦合是实现同步振荡的关键。
大量研究发现，Delta-Notch 信号通路中的信号分子与体节时钟基因的同步振荡密切相关。无论是使用药理学抑制剂还是Notch信号通路的基因突变，都会导致振荡器群体失去同步性。在斑马鱼中，Notch信号通路组分（如DeltaC、DeltaD和Notch1a）的突变体会表现出异步振荡5,6。在鸡或小鼠胚胎中，不仅Notch配体Delta样蛋白1（Dll1），而且Notch调节因子Lunatic fringe（Lfng）也是实现同步振荡所必需的7,8,9。然而，由于传统基因调控动态扰动的时间分辨率不足以研究时间尺度为2–3小时（超昼夜节律）的过程，因此很难检验这些分子在细胞间动态信息传递中的功能作用。
我们最近开发了一种整合方法，用于控制和监测哺乳动物细胞中的基因表达模式10。该技术能够通过在超昼夜时间尺度上进行周期性光照，诱导基因表达脉冲。本实验方案介绍了建立光敏细胞系的方法，并通过活细胞生物发光监测，观察报告细胞在细胞间通讯背景下的动态响应。该方法适用于分析许多其他信号通路。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 利用 Tol2 系统生成稳定细胞系
- 将基于 Tol2 的光遗传学模块质粒载体（图 1A）与转座酶（Tol2）表达载体（pCAGGS-mT2TP）共同转染至 C2C12 细胞中。所有步骤中，除非另有说明，均使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞（表 1）。
- 用细胞计数仪对胰酶消化后的细胞进行计数，于转染前一天在 12 孔板中每孔接种 5 × 104 个 C2C12 细胞。
- 使用脂质体转染试剂，共转染 0.375 μg 基于 Tol2 的光遗传学载体（pAI177 或 pAI218）、0.125 μg 药物筛选载体（pAI170）以及 0.5 μg 的 pCAGGS-mT2TP 载体。
- 转染后一天，将转染的细胞进行胰酶消化，并接种至 100 mm 培养皿中。
- 将转染细胞的培养基更换为添加了 100 mg/mL 潮霉素的培养基。
- 继续培养细胞 3 天以清除未转染的细胞。注意：此期间无需更换培养基。
- 将转染后的细胞进行胰酶消化，并通过荧光蛋白表达筛选纯化细胞群体。对于携带 pAI177 的受体细胞，设定分选门控至 Green-PE 通道，以纯化 mCherry 阳性细胞群体；对于携带 pAI218 的光敏感供体细胞，设定分选门控至 APC 通道，以纯化 iRFP713 阳性细胞群体。
- （可选）通过标准方法建立单克隆细胞群体，例如有限稀释法或流式细胞术单细胞分选（FACS）。
2. 群体水平上工程细胞光敏感性的评估
注意：本部分描述了一种通过生化实验（如定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹）检测蓝光照射下 Dll1 配体蛋白动态诱导的实验方案。
- 设置两种类型的培养箱，分别配备或不配备光源，用于光照条件或黑暗条件。使用光度计设置蓝光LED透射仪的光照强度，如图1B所示，并通过向单板微控制器加载控制脚本，设定光照的时间和持续时长，以实现可编程的光照周期（图1C）。
- 使用细胞计数器对胰酶消化后的细胞进行计数，并将1.0 × 105个携带pAI218和pAI170的光敏供体细胞接种于直径35 mm的塑料培养皿中（光照条件至少12个培养皿，黑暗条件1个培养皿），并将培养皿分别置于对应光照或黑暗条件的培养箱中。接种完成后，直至收集细胞裂解液前，保持培养箱门关闭。
- 接种后约1.5天开始光照处理（此时细胞融合度预计超过80%）。避免将细胞暴露于光照下，以防发生非预期的光刺激。
注意：光照程序应根据实验目的进行调整。持续光照条件（例如，持续1分钟，间隔10分钟，光照强度为40 µmol/m2/s）足以初步检测光诱导效果；强光照射对细胞有害，因此应确保选择对细胞无害的光照参数。 - 接种后约2天，以30分钟为间隔制备细胞裂解液。将样品培养皿从培养箱中取出后立即置于冰上，并开始制备细胞裂解液用于后续分析。
3. 群体水平上的动态发送-接收检测：通过光电倍增管对细胞在光刺激下的实时响应进行监测
- 采用标准方法对供体细胞和受体细胞进行胰酶消化并计数。制备总体积为1 mL的混合悬液，其中包含2.5 × 104个受体细胞和1.25 × 105个供体细胞（比例为1:5）。
注：供体与受体细胞比例为2:1、1:1或1:2时也可行，总细胞数为1.5 × 105。10 - 将混合后的细胞接种至含1 mM荧光素的培养基的24孔黑色培养板中，每孔加一孔。
- 使用酶标仪进行荧光素酶检测分析，并确认输出信号未超出记录系统的检测上限。
注：若输出信号高于1 × 106 光子数/秒，可能出现信号饱和。此时应降低荧光素浓度至最佳水平，使输出信号低于1 × 106 光子数/秒。 - 将培养板置于记录系统上，启动记录程序（图1D）。例如，在开始记录后18小时启动光照。
注：时间滤波方法（如使用移动平均法或Savitzky-Golay滤波法对信号进行去趋势处理）有助于波形可视化和峰位检测。
4. 单细胞水平的动态发送-接收实验：在光遗传学扰动控制下对单细胞响应进行实时成像
- 将0.5 × 105个受体细胞和2.5 × 105个供体细胞接种至直径为35 mm、底部为27 mm玻璃的培养皿中。确保细胞混合比例及总细胞数量（细胞密度）已正确调整。
- 接种后一天，更换为2 mL记录培养基（含5% FBS、青霉素-链霉素和1 mM荧光素的酚红-free DMEM培养基），并将玻璃底培养皿置于显微镜载物台上。如有必要，用PBS (-) 洗去死亡细胞碎片。
注意：建议在避光条件下进行此步骤。 - 设置配备环境控制腔的倒置显微镜，维持37 °C和5% CO2的培养条件。
- 设置冷却CCD相机。确保CCD传感器温度已降至设定值（通常为-90 °C）。
- 在自动采集软件中设置“"多维延时成像"”窗口参数，以实现每5分钟采集一次图像，连续采集超过288次（超过一个晚上的记录时间）。
- 打开“"多维延时成像"”窗口，从下拉菜单中选择发光通道和慢速50 kHz读出模式，并设置4 × 4 binning及4分钟曝光时间。确保读出模式设为慢速50 kHz模式，这对降低读出噪声、检测微弱的生物发光信号至关重要。
- 打开“"多维延时成像"”窗口，从下拉菜单中选择荧光通道和快速1 MHz读出模式，并设置2 × 2 binning及400 ms曝光时间。确保读出模式设为快速1 MHz模式，以缩短荧光成像所需时间。
- 点击“"采集"”按钮，开始延时记录。
- 通过图像分析软件从延时视频中提取发光通道的单细胞信号轨迹，步骤如下：首先，将图像数据导入图像分析软件，生成发光和荧光的图像序列堆栈。对于发光图像，通过比较时间相邻帧中像素的强度，识别并去除由宇宙射线引起的热点像素，将这些像素值替换为前后帧对应位置像素强度的时间平均值（该操作在软件中实现为“"SpikeNoise Filter"”），然后对处理后的图像应用空间平滑滤波器，并从每帧中减去视野外区域的背景像素值。随后，在每个时间点的荧光图像上确定每个细胞的“"感兴趣区域"”（ROI），将该ROI应用于对应的发光图像，并测量每个ROI的发光强度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们改进了LightOn系统11,12，该系统可实现哺乳动物细胞中光诱导的基因表达，用于研究周期为2至3小时的遗传振荡器。该系统包含两个部分：光诱导型转录激活因子hGAVPO和一个UAS启动子盒，用于驱动任意目的基因的转录。为了加快光诱导基因表达的脉冲动力学，UAS启动子盒中的polyA序列被小鼠Hes1的3'非翻译区（3'UTR）取代，从而使mRNA半衰期在小鼠成纤维细胞中缩短至20分钟。
为建立稳定细胞系，采用了基于Tol2转座酶系统的三顺反子载体13（图1A）。Tol2表达载体对于提高质粒盒在染色体上的整合效率至关重要14。这些载体不仅携带由UAS启动子驱动的光诱导基因表达盒，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们展示了一种控制基因表达动态的方法，其周期为2至3小时。这一时间尺度远短于其他传统系统（包括Tet-On系统和原始的LightOn系统）中的时间尺度。实现这种超昼夜节律时间尺度的关键参数是光诱导分子产物、mRNA和蛋白质的半衰期。这些动力学参数可能依赖于细胞类型和物种。为了调节动力学特性，用其他序列替换Hes1的3'非翻译区（3'UTR）是一种直接有效的方法，因为该方法不会改变目标蛋白的序列和功能。为了在特定感兴趣的细胞中获得理想的脉冲表达模式而筛选其他3'UTR序列时，通过光照诱导对dLuc进行活细胞实时监测是一个良好的起点，可用于筛选和验证。
最常被问到的问题之一是关于光敏细胞的日常操作。在Notch信号通路的动态发送-接收检测中，我们能够在室内光线下进行每日的细胞传代，因为我们的系统（光诱导型dLuc或Dll1细胞以及接收细胞）不会改变细胞增殖，并且在细胞转移至黑暗环境后6小时内迅速恢复到静息状态。如果目标基因为细胞命运决定因子，渗漏表达可能诱导细胞分化或阻碍细胞扩增，因此在细胞操作过程中建立红光环境至关重要，以避免不必要的光遗传学干扰。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了以下资助：日本科学技术振兴机构（JST）先驱性研究项目（PRESTO）（A.I.）、核心研究推进计划（CREST）（JPMJCR12W2（R.K.））、文部科学省（MEXT，日本）创新科学领域研究专项基金（26119708（A.I.）和16H06480（R.K.））、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（A类）（24240049（R.K.））以及青年科学家（A类）项目（15H05326（A.I.））、文部科学省（MEXT，日本）创新科学领域研究专项基金“"荧光活体成像"”，以及来自文部科学省（MEXT，日本）的“生命系统动态研究平台”项目支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞仪 | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| 相机 | Andor | iKon M-934 | |
| 显微镜 | Olympus | IX-81 ZDC | |
| 光电倍增管设备 | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| 蓝色LED照明器 | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| 青霉素-链霉素 | Nacalai | 26253-84 | |
| 胎牛血清 | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24（黑色24孔板） | Hi-tech | 303012 | |
| D-荧光素钾盐 | Nacalai | 20028-24 | |
| 光度计 | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| 抗HA-辣根过氧化物酶抗体 | Roche | 克隆 3F10 | |
| 抗肌动蛋白-辣根过氧化物酶抗体 | Wako | 克隆 2F3 |
参考文献
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141(2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3(2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
