方法文章

探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

DOI：

10.3791/57150

⸱

2018年6月5日

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1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们介绍一种引入新方法集的实验方案 体外培养 研究早期鸡胚脑扭转过程中形态发生力学的实验与物理建模方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎发育的传统研究主要基于生物分子遗传学视角，但力学因素在形态发生中的根本重要性正日益受到重视。特别是鸡胚心脏和脑管在发育过程中会经历显著的形态变化，因此成为研究物理力在形态发生中作用的理想模型之一。在鸡胚发育过程中，管状鸡胚脑在器官水平左右不对称形成的最早阶段即发生持续的腹侧弯曲 和向右扭转。卵黄膜（VM）限制了胚胎的背侧，并被认为提供了诱导脑部扭转所必需的力学作用。本文介绍了一种结合新型离体（ex-ovo）实验与物理建模的方法，用以揭示脑扭转的力学机制。在Hamburger-Hamilton 11期，将胚胎取出并在培养基中进行离体培养（ex ovo）。随后使用拉制毛细管移除卵黄膜。通过调节液体水平并使胚胎暴露于液-气界面，可利用培养基的液体表面张力来替代卵黄膜的机械作用。此外，还进行了显微外科手术以改变心脏的位置，从而观察脑扭转手性随之发生的变化。本实验方案的结果阐明了力学因素在驱动形态发生过程中的基础性作用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

现代发育生物学研究主要集中在从分子遗传学的角度理解发育过程1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。已知物理现象在形态发生（即生物形态的形成）中起着核心作用14,15,16,17；然而，发....

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方案

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1. 组织培养基的制备

  1. 使用一瓶 0.5 L 的含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为培养基的基础。
  2. 在无菌超净工作台中，向 0.5 L DMEM 中加入 10 mL 抗生素。
  3. 使用无菌移液管，将 50 mL DMEM 抗生素溶液转移至一支无菌的 50 mL 锥形管中。
  4. 在无菌超净工作台中，向 0.5 L 瓶内剩余的 DMEM 抗生素溶液中加入 50 mL 鸡血清。
  5. 将最终溶液（以下简称鸡胚培养基 [CCM]）分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。

2. 卵的孵化

  1. 使用含70%乙醇的无尘擦拭布清洁已受精的无特定病原体白来航鸡卵，并将卵以纵向方向放置于卵架上。
  2. 开启卵孵化箱，设定目标温度为37.5 °C，并将湿度维持在48 - 55%。 通过向孵化箱内添加适量水来控制湿度。
  3. 将卵孵化至Hamburger-Hamilton 11-13期，约需40 - 44小时。
  4. 在用70%乙醇喷洒或清洁前，让卵在室温下冷却约15 - 30分钟。

3. 拉制玻璃毛细管

  1. 将一根长度为 10 cm、外径为 1.0 mm、内径为 0.5....

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结果

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在本研究中，将 HH11 期胚胎从头端至胸段弯曲处的卵黄囊膜（VM）移除。利用光学相干断层成像系统（OCT）对胚胎进行成像。在此阶段，脑管的扭转尚未开始（图 1A）。当孵化至 HH15-16 期时，移除 VM 的胚胎表现出脑管扭转程度降低，约为 35 度（图 1B），而对照组胚胎的扭转角度约为 90 度。当降低培养基液面以在移除 VM 的胚胎背侧诱导表面张力时，其脑部扭转程度恢复至与对照组胚胎相当的水平（图 1C）。图 2 显示了 HH13 期胚胎的代表性 OCT 图像，其中标注了胸段方向角和头段方向角（图 2A）。这些角度是相对于神经管（NT）横截面的垂直位置进行测量的（图 2B、C.......

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讨论

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尽管物理现象在形态发生过程中起着关键作用26,27,28,29,30，但具体的力学机制以及力学与分子机制之间的协调作用在很大程度上仍未被探索。已知原始脑的腹侧弯曲和向右扭转是早期胚胎形态发生的两个核心过程18,31,32,33,34，但此前尚无研究探讨脑扭转的力学起源，而脑扭转是最早发生的器官水平左右不对称事件之一。

该方案的关键步骤包括.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z.C. 感谢达特茅斯学院启动基金以及由苏黎世联邦理工学院管理的布兰科·魏斯科学学会奖学金的支持。作者感谢 Larry A. Taber 博士、Benjamen A. Filas 博士、Qiaohang Guo 博士和 Yunfei Shi 博士提供的有益讨论，同时也感谢匿名审稿人的意见。 本研究工作得到美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：DGE-1313911）的支持。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。 

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无特定病原体受精白来航鸡卵Charles River
光学相干断层扫描显微镜ThorlabsGAN220C1
硅胶弹性体Smooth-On, Inc.EcoFlex 00-50
解剖显微镜LeicaMZ8
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)Lonza12-604F
抗生素SigmaP4083
鸡血清SigmaC5405
微量移液器拉制仪Sutter InstrumentModel P-30
滤纸Whatman5202-110
磷酸盐缓冲液 (PBS)Corning21-040-CV
Comsol 多物理场仿真软件Comsol
三维计算机图形软件Rhino 5
配备光学相干断层扫描的显微镜Nikon FN1
数码单反相机EOS Rebel T3i

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
  2. Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 13....

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