探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

摘要

在此，我们介绍一种引入新方法集的实验方案 体外培养 研究早期鸡胚脑扭转过程中形态发生力学的实验与物理建模方法。

摘要

胚胎发育的传统研究主要基于生物分子遗传学视角，但力学因素在形态发生中的根本重要性正日益受到重视。特别是鸡胚心脏和脑管在发育过程中会经历显著的形态变化，因此成为研究物理力在形态发生中作用的理想模型之一。在鸡胚发育过程中，管状鸡胚脑在器官水平左右不对称形成的最早阶段即发生持续的腹侧弯曲 和向右扭转。卵黄膜（VM）限制了胚胎的背侧，并被认为提供了诱导脑部扭转所必需的力学作用。本文介绍了一种结合新型离体（ex-ovo）实验与物理建模的方法，用以揭示脑扭转的力学机制。在Hamburger-Hamilton 11期，将胚胎取出并在培养基中进行离体培养（ex ovo）。随后使用拉制毛细管移除卵黄膜。通过调节液体水平并使胚胎暴露于液-气界面，可利用培养基的液体表面张力来替代卵黄膜的机械作用。此外，还进行了显微外科手术以改变心脏的位置，从而观察脑扭转手性随之发生的变化。本实验方案的结果阐明了力学因素在驱动形态发生过程中的基础性作用。

引言

现代发育生物学研究主要集中在从分子遗传学的角度理解发育过程^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。已知物理现象在形态发生（即生物形态的形成）中起着核心作用^14,15,16,17；然而，发育的具体力学机制在很大程度上仍未得到充分研究。在Hamburger-Hamilton 11期（HH 11）之后，原始脑管的腹侧弯曲和向右扭转是导致胚胎形态变化的两个主要过程¹⁸。特别是，胚胎脑部扭转发育背后的物理机制仍尚未完全阐明^19,20。

鸡胚的胚胎扭转是发育过程中左右（L-R）不对称性最早的形态发生事件之一。当L-R不对称性过程受到干扰时，将导致诸如situs inversus、isomerism或heterotaxia等出生缺陷²¹。
本文介绍了一种结合ex-ovo实验^22,23与物理建模的方法，用于表征早期胚胎脑发育过程中的机械力。本方法的目标是识别导致脑部扭转的机械力以及影响早期发育过程中扭转程度的因素¹²。基于实验观察发现卵黄膜（VM）限制了胚胎背侧，我们提出假设：VM提供了诱导发育中脑部发生扭转所需的力。因此，在本方法中，我们移除了覆盖脑区部分的卵黄膜，以探究其对脑扭转的影响。此外，采用施加液体表面张力的方法，进一步验证VM的力学作用，并估算脑扭转所需的作用力，此前尚未有研究实现这一点。在胚胎形态发生过程中测量这些力是一项具有挑战性的任务。值得注意的是，在一项开创性研究中，Campàs及其同事²⁴开发了一种利用注入微滴来量化细胞应力的新方法。然而，该方法仅限于测量细胞水平的力，因而不适用于组织或个体水平上的力探测。本文所提出的方案正是为了部分填补这一空白而开发的。

方案

1. 组织培养基的制备

1. 使用一瓶 0.5 L 的含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为培养基的基础。
2. 在无菌超净工作台中，向 0.5 L DMEM 中加入 10 mL 抗生素。
3. 使用无菌移液管，将 50 mL DMEM 抗生素溶液转移至一支无菌的 50 mL 锥形管中。
4. 在无菌超净工作台中，向 0.5 L 瓶内剩余的 DMEM 抗生素溶液中加入 50 mL 鸡血清。
5. 将最终溶液（以下简称鸡胚培养基 [CCM]）分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。

2. 卵的孵化

1. 使用含70%乙醇的无尘擦拭布清洁已受精的无特定病原体白来航鸡卵，并将卵以纵向方向放置于卵架上。
2. 开启卵孵化箱，设定目标温度为37.5 °C，并将湿度维持在48 - 55%。 通过向孵化箱内添加适量水来控制湿度。
3. 将卵孵化至Hamburger-Hamilton 11-13期，约需40 - 44小时。
4. 在用70%乙醇喷洒或清洁前，让卵在室温下冷却约15 - 30分钟。

3. 拉制玻璃毛细管

1. 将一根长度为 10 cm、外径为 1.0 mm、内径为 0.5 mm 的玻璃毛细管安装到微电极拉制仪上。
2. 将加热参数和拉制参数分别设置为 750 和 400，按下拉制按钮，将毛细管拉制成细针。

4. 滤纸载体法

1. 从滤纸上裁剪出直径约 3 cm 的圆形。
2. 使用打孔器从圆形滤纸上切下一枚大小约为 1 cm × 2 cm 的矩形。确保去除任何突出或尖锐的边角。

5. 胚胎采集与制备

1. 从底部敲裂鸡蛋，轻轻掰开蛋壳，小心地将内容物倒入 150 mm × 15 mm 培养皿中 培养皿。为确保胚胎面朝上，在打蛋时应保持鸡蛋的摆放方向与孵化时一致。
2. 使用一次性巴斯德吸管去除薄层白蛋白。
3. 使用钝头镊子将浓稠的蛋清与蛋黄分离。 用钝头镊子轻轻刮去蛋黄表面，以确保去除浓稠的白蛋白。
4. 使用尖头镊子将样品居中并 将滤纸环置于胚胎上方，使滤纸环的长轴与胚胎的长轴对齐。
5. 用剪刀剪开滤纸环周围的蛋黄。
6. 以倾斜方向将环和胚胎从卵黄上拉起，朝向最初切割卵黄的位置。
7. 在两个连续的100毫米培养皿中，用室温的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胚胎。
8. 先将一张滤纸环放入35 mm培养皿中，然后将胚胎背侧朝上置于已放置在35 mm培养皿中的滤纸环上。
9. 将一个不锈钢环置于滤纸夹层上方，注意不要损伤胚胎。
10. 加入3 mL 将先前配制的CCM分别加入每个培养皿中。
11. 用拉制的毛细玻璃针轻轻从胚胎顶部掠过，从胚胎前端（前脑正上方）开始，逐步剥离并移除每个胚胎的卵膜（VM），直至完成 脊索（图1A).
12. 将八个35毫米的培养皿放入一个已铺有经水饱和的柔软擦拭纸（以维持湿度）的150毫米培养皿中。
13. 将150毫米培养皿放入可密封的塑料袋中，然后向袋内充入由95% O₂和5% CO₂组成的混合气体₂ 和5% CO₂₂.
14. 密封袋子并将其放入37.5 °C培养箱中。
15. 将胚胎继续孵育27小时，直至HH15-HH16阶段（图1B).

6. 诱导表面张力

1. 从培养箱中取出胚胎，使用光学相干断层扫描（OCT）系统对胚胎进行成像。利用OCT确定神经管（NT）的扭转角度（图2）。
2. 将胚胎转移至光学显微镜下，在10倍放大倍数下进行观察。使用200微升移液器逐步从培养皿中移除0.2 mL培养基。
3. 在每个时间点拍摄明场图像，以观察培养基-空气界面对于胚胎的影响。
4. 持续移除培养基，直至胚胎表面张力引发扭转（图1C）。
5. 再次使用OCT系统对胚胎成像，以确定最终的扭转角度，并与对照组胚胎进行比较。  注意：明场图像通过体视显微镜获取。采用配备显微镜的光学相干断层扫描系统获取活体胚胎的横截面图像序列。图像在3 × 10 mm × 3 mm³的扫描范围内采集，随后在图像处理软件中进行处理。最后，物理模型图像使用数码单反相机拍摄。

7. 表面张力/体积力的物理建模

1. 在商业建模软件中构建一个简化的三维几何模型，以模拟HH14-17时期的胚胎形态图3A).
2. 在商业3D计算机图形软件中设计三维几何结构的负模。
3. 使用装有1.75 mm丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（acrylonitrile butadiene styrene）线材的3D打印机，以立体光刻（.stl）格式打印设计好的模具。
4. 为了制备模具，将硅橡胶弹性体组分A和B等比例混合，并立即将混合物倒入模具中；将浇铸模具在室温下固化12 h图3B).
5. 沿胚胎背侧的神经管标记物理模型，以观察扭转。
6. 使用盖玻片以复制施加于模拟的三维物理模型上的力 VM 的或表面张力的图3D).
7. 在物理模型的一侧插入一系列等长的刚性金属丝。当盖玻片对脑模型施加外力后，金属丝会因位置不同而倾斜一定角度。通过计算每根金属丝投影长度与其原始长度比值的反正切（arctan）来确定其旋转角度。图3E).

8. 改变心脏环化的方向

1. 按照步骤 3.1 和 3.2 操作，制备拉制好的毛细管。
2. 按照5.1至5.10步骤准备胚胎。
3. 使用一对镊子翻转滤纸，使胚胎腹面朝上。
4. 使用拉制的毛细管进行切割 在脏壁层（SPL）膜上切开一个裂口。
5. 使用毛细管施加机械力，将心脏从右侧推向左侧。
6. 按照5.12至5.15步骤操作，观察扭转的变化。

结果

本研究中，将HH11期胚胎从头端至胸段弯曲处的卵黄囊膜（VM）去除，并利用OCT系统对胚胎进行成像。在此阶段，神经管的扭转尚未开始（图1A）。当胚胎继续孵育至HH15-16期时，去除VM的胚胎表现出明显的脑神经管扭转减少，扭转角度约为35度（图1B），而对照组胚胎的扭转角度约为90度。当降低培养基液面以在去除VM的胚胎背侧诱导表面张力时，其脑部扭转程度恢复至与对照组胚胎相当的水平（图1C）。图2展示了HH13期胚胎的代表性OCT图像，其中标注了胸段方位角和头段方位角（图2A）。这些角度是相对于神经管横截面的垂直位置进行测量的（图2B、C）。实验结果表明，正常的脑神经管扭转是由胚胎背侧所...

讨论

尽管物理现象在形态发生过程中起着关键作用^{26,27,28,29,30}，但具体的力学机制以及力学与分子机制之间的协调作用在很大程度上仍未被探索。已知原始脑的腹侧弯曲和向右扭转是早期胚胎形态发生的两个核心过程^{18,31,32,33,34}，但此前尚无研究探讨脑扭转的力学起源，而脑扭转是最早发生的器官水平左右不对称事件之一。

该方案的关键步骤包括...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无特定病原体受精白来航鸡卵	Charles River
光学相干断层扫描显微镜	Thorlabs	GAN220C1
硅胶弹性体	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
解剖显微镜	Leica	MZ8
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	Lonza	12-604F
抗生素	Sigma	P4083
鸡血清	Sigma	C5405
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	Model P-30
滤纸	Whatman	5202-110
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Corning	21-040-CV
Comsol 多物理场仿真软件	Comsol
三维计算机图形软件	Rhino 5
配备光学相干断层扫描的显微镜	Nikon	FN1
数码单反相机	EOS	Rebel T3i