分析 拟南芥 不同光质下的生长行为

摘要

本文介绍了一种以可重复方式研究植物生长行为特别是表型的实验方案。我们展示了如何提供可变且同时稳定的光照条件。正确的分析依赖于足够的样本数量和有效的统计学评估。

摘要

植物生物学家通常需要观察所选物种的生长行为。为此，植物需要稳定的环境条件和恒定的光照条件，且光照的强度和质量最好能够调节，以便在不同设置下开展研究。配备发光二极管（LED）光源的气候培养箱能够满足这些要求，与荧光灯不同，LED光源可调节至不同波长。LED节能，即使在高强度光照下也几乎不产生热量，而这一点往往是其他光源存在的问题。本实验方案详细提供了如何对配备可调LED光源的气候培养箱进行编程操作的逐步指导，并介绍多种深入分析生长表型的方法。根据实验设计的不同，可对植物生长过程中的多种特征进行观察和分析。本文描述了如何测定鲜重、叶面积、光合作用活性以及气孔密度。我们证明，为了获得可靠的数据并得出有效的结论，必须使用足够数量的个体进行统计分析。若用于此类分析的植株数量过少，将导致较大的统计误差，从而影响数据解释的清晰性。

引言

Arabidopsis thaliana 作为分子时代植物研究的模式生物已有二十多年的历史。这种十字花科的小型植物具备多种特性，使其成为遗传学和分子研究的理想对象：其基因组相对较小，仅有五条染色体（相比之下，例如 Nicotiana tabacum 有24条染色体），并且其基因组已于2000年完成全序列测定¹。A. thaliana 可通过农杆菌（Agrobacterium）感染实现简便的遗传转化²，并适用于包括CRISPR/Cas在内的最新遗传工具³。尽管植株体型小，但其生长周期足够短，使得需要大量生物材料的生化实验成为可能。该植物可在琼脂平板或土壤中生长，甚至可进行液体培养⁴。Arabidopsis 可在气候可控的培养柜（例如 Percival 品牌）、人工气候室或温室中培养。为了能够比较生长行为并分析突变体的表型，提供可重复且同时具备灵活性的生长条件至关重要⁵。根据所研究的科学问题，可能需要在相同温度下设置不同的温度梯度、恒定光照条件、不同的光照强度或不同光质。光是植物生长中极为关键的参数，其影响常通过多种方法进行研究⁶。为确保所获得数据的可重复性和可比性，必须保证光源输出的稳定性，并使用相同类型的光源。

温室和气候室中常用的光源包括钠蒸气灯和荧光灯，这些光源虽能促进植物良好生长，但存在若干缺点。首先，这些光源会随着时间推移而老化，导致光谱输出不仅在强度上发生变化，而且在质量上也发生改变（作者观察）。然而，通常仅对光强进行持续监测，因此光质的变化可能未被察觉，但仍可能产生显著影响。其次，这两种光源在高光强下均会产生热量，其本身对植物生长具有显著的生理影响，可能掩盖任何光依赖性效应。第三，这些光源的光谱输出是固定的，且与自然日光相差较大⁷。上述所有缺点在使用发光二极管（LEDs）时均已得到克服^8,9,10,11。LEDs 具有长寿命，发光特性几乎不随时间变化，在极高光强下也不会产生废热，并且在光谱输出方面具有极高的灵活性。

本文介绍了如何设置一个具有独立红光、蓝光和白光LED光源的气候室，并随时间监测植物生长的不同参数。我们测量了鲜重、叶面积、气孔密度以及光合作用性能。同时，我们还展示了正确设置统计分析的重要性。

方案

本方案包含一些分析拟南芥（A. thaliana）植株生长行为的方法示例。

1. 准备

1. 开始前，仔细规划实验所需的植物数量，以确保能够进行可靠的统计分析，然后准备相应数量的花盆。
   注意：务必考虑到部分种子可能无法萌发的情况。
2. 使用具有多个可独立编程LED灯层的气候培养箱，在相同的一般环境条件下比较植物生长情况（见材料表）。

2. 植物生长与LED灯的设置

1. 准备适当数量的 6 x 7 cm 花盆（根据需分析的不同条件和/或突变体而定），装入土壤，并在每个花盆中播种一粒种子。
   注意：本实验中，每个条件下播种 36 株植物。
2. 在 4 °C 下春化处理两天。
3. 将相对空气湿度设为 65%，温度设为 22 °C/16 °C，光照周期为 16 小时光照/8 小时黑暗。通过气候室前方的触摸屏输入相应参数，将各层光照强度调节至 200 µM/cm²/s¹。若需比较四种不同的光质，请将 LED 设置为表 1 中提供的以下参数。

标识符	395 nm [%]	440 nm [%]	3 K [%]	660 nm [%]	770 nm [%]
"阳光"	100	11	100	15	100
红光和蓝光（RB）	100	15	25	10	100
蓝光（B）	100	15	25	2	25
红光（R）	90	2	25	10	100

表1：LED发射的光强度组成

4. 持续监测光谱输出， 例如 通过使用内置的校准光谱仪。
5. 将植物放置于气候室内的不同层架上，并用透明盖子覆盖，直至子叶充分发育可见。确保植物得到充足的水分供应。
6. 根据植物在所选条件下的生长速度，以适当频率通过肉眼观察和摄影方式对植物进行监测和记录。 例如 每两天拍摄一次。务必使用相机三脚架，以确保相机与物体之间的距离在所有照片中保持一致，从而便于比较。在适当情况下使用比例尺。
   注意：DAS（播种后天数）指包括春化处理在内的种子实际播种时间。

3. PSII 量子产额的测定

1. 使用脉冲调制式荧光仪。将相机镜头置于距离植物适当的位置，使活体窗口中能够完整显示整个莲座状叶丛。
2. 启动软件后 "选择单位" 窗口出现。勾选 "MINI" 然后 "好的。" 选择颜色 "蓝色" 在下一个弹出窗口中。单击 "好的。"
   注意：脉冲调制式荧光测量光将自动开启。监视器上将显示图像窗口，呈现荧光参数 Ft。此时置于摄像头下的植物会显示为橙色图像。
3. 为了聚焦图像和/或选择植物的特定区域，通过勾选切换到实时视频 "实时视频" 调节物镜的调焦环。单击右上角的关闭按钮，退出实时视频窗口。
4. 为测量光合参数，需定义一个兴趣区域（AOI）。可使用默认设置，即屏幕中央自动出现的圆形区域。其旁边的红色方框表示兴趣区域内所有像素的平均 Ft 值。通过右侧面板的 AOI 选项框选择不同形状，以定义合适兴趣区域。 在AOI标签页中点击“添加”，并将圆形放置在叶片区域内。每片叶片重复操作五次。
5. 保持制造商提供的默认设置（右侧选项卡） (表2).

测量光	强度	频率
	1	1
作用光	强度	脉宽
	8	0
图像校正	MINI
图像转换	电池电压
	16.7V
增益	5
阻尼	1
饱和脉冲	强度	次数	间隔 s
	8	1	30
慢诱导	延迟 s	时钟 s	持续时间 s
	40	20	315
吸收率	红光增益	红光强度	近红外强度
	340	25	13
显示	彩色
PS 限值	50
抑制参考区域	1
Fm 因子（勾选）	1,030

表2：制造商提供的PAM测量默认设置。

6. 应用饱和光闪光，通过荧光淬灭分析（饱和脉冲）测量光合参数。在此之前，通过测定暗适应植物的最小和最大荧光产量来确定淬灭系数。为此，将植物置于暗处（例如 将植物置于抽屉或暗盒中避光数分钟。然后将植物放置于相机镜头下方，在图像下方的选项行中勾选“Measure”和“ML”（测量光） 选择 "Fv/Fm" 通过进入圆圈进行计时， 并点击屏幕底部的 Fo、Fm。
   注意：Fo/Fm 表示暗适应植物的 PSII 实际光化学效率。因此，该值用作施加光照后测量值的归一化基准。当前的 Fo/Fm 测量值将持续有效，直至启用“新记录”。所有由饱和脉冲测定的 F 和 Fm' 值均相对于 Fo/Fm 进行关联，淬灭参数也据此计算。
7. 在报告标签页中找到这些结果，并勾选右侧与实验相关的所有选项例如Y(II)、qP、qN 等等。).
8. 将结果导出至分析软件 例如单击左上角的导出按钮，将文件导出至 Excel 并以合适的文件名保存。 每片叶片至少生成五个感兴趣区域（AOIs），并对同一植株的多片叶片进行测量（每次测量后需将植株再次短暂暗适应），同时测量同一条件下多株植物，以便进行统计分析。 
9. 对于统计分析，需从所有时间点/条件下的所有感兴趣区域（AOIs）以及至少三个独立植株中计算均值和标准差，并进行学生t检验以评估数据是否具有显著性。¹²当 p 值小于 0.05 时，数据被认为具有显著性差异。

4. 气孔密度的测定

1. 每种处理条件下，取三株不同植株的三片完全展开的莲座叶，放入玻璃培养皿中的70%乙醇中以提取叶绿素。室温下孵育过夜，或于4 °C保存。
2. 为彻底清除色素，将叶片转移至水合氯醛溶液（水合氯醛 : 水 : 甘油 = 8 : 2 : 1 w/v/w）中孵育，直至叶片完全变白。
3. 使用40倍放大倍率对叶片远轴面进行微分干涉差显微镜（DIC）成像。计数视野中的气孔数量，并借助标尺换算为每平方毫米的气孔数。每种处理条件至少重复检测4片叶片。通过计算同一处理条件下所有叶片的平均值，并进一步计算平均误差，进行统计分析。

5. 鲜重的测定

1. 使用剃刀从每种条件下六株植物的莲座叶上移除所有叶片及叶柄。立即称量所有叶片重量，并按上述方法对数据进行统计分析。

6. 莲座叶面积的测定

1. 每种条件下使用八株植物的图片进行叶面积的图形分析。将同一条件下的图片合并为单张图像，并保存为 *.jpeg 或 *.tiff 格式。
2. 下载相应的软件（材料表）。
   注意：当然也可以使用任何其他能够执行此任务的程序。
3. 打开图像文件。选择工具 "自由选择工具。圈选包含叶柄的一个莲座叶丛。点击 "分析 - 设置测量参数" 并检查 "面积，“最小” & 最大灰度值，“积分密度”" 和 "平均灰度值。选择合适的小数位数，建议为两位或三位，然后点击 "好的。"
4. 为了获得毫米² 而不是像素，使用 "设置比例尺" 命令。使用直线选择工具绘制一条直线选区，该选区对应一个已知距离， 例如 根据图像比例尺易于计算的叶片直径，然后打开“设置比例尺”对话框，输入该已定义的距离和测量单位。随后返回 "分析" 并点击 "测量。"
5. 一个名为的新窗口出现 "结果" 包含当前莲座叶的相关数据。对图像中的所有植株重复此操作，并使用 Ctrl + M 为每株新植株初始化面积测量。
   注意：对于叶片不重叠的小型植物 "魔棒工具" 可用来使该过程更简便、快速。一旦叶片开始相互遮挡，此工具便无法提供可靠结果。
6. 或者，剪下所有叶片并将其摆放整齐，以便拍摄整体照片，然后使用魔棒工具。需要注意的是，采用此方法时需要更多的植株。
7. 选择 "文件" -"保存为" 在结果窗口中生成合适的文件名，并选择计算机目录中的保存位置。文件将自动以 Excel 格式保存。

7. RNA 的制备

1. 从每种条件下十个独立植株中各采集三个样品。根据试剂盒说明书，使用植物RNA提取试剂盒提取总RNA。测定RNA浓度、纯度 并使用生物分析仪检测其完整性。随后，RNA可用于下游应用，如qRT-PCR或基因表达分析。 例如 RNA测序¹³.

结果

对植物生长特别是突变体植物表型的观察与分析，依赖于稳定且可重复的环境条件。这些条件可通过气候室提供。光照强度尤其是光质，在很大程度上取决于所采用的光源，本研究中光源由LED灯提供。

图1展示了一个配备LED面板的气候室示例。图1A显示了控制面板的截图，其中可调节所有气候和光照条件。在24小时内可设置二十个不同的时间段。在此示例中，已设定为长日照条件，即16小时光照/8小时黑暗。该气候室具有四个独立层级，可分别编程，从而可在完全相同的环境条件下研究植物在四种不同光照设置下的生长情况。左上层设定为尽可能在技术上模拟太阳光谱输出，右上层则为增强的红光（660 nm）和蓝光（440 nm），同时降低白光（3K）。左下层设定为增强蓝光，右下层则以红光为主。图1B展示了不同设置下LED的整体情况（中间图）以及相应的放大视图（外侧小图）。通过肉眼即可明显观察到光照质量的差异。

内置光谱仪持续测量、监控并调节光谱输出。图2显示了左上角1.1级的光谱，该级别设置为模拟日光。与标准荧光灯泡相比，其紫外光和蓝光部分的成分显著更高⁷。

在图3中，展示了播种后10天、13天和17天分别处于四种条件下的A. thaliana植株示例。所有植株均通过将相机固定在三脚架上，以相同距离进行拍摄。比例尺为1 cm。播种10天后，植株在大小或颜色上差异不明显；但至17天时，红光条件下生长更快的现象已十分明显。除目视分析外，还进行了多项生理学分析。

图4 遵循PAM测量的不同步骤，该测量用于分析 例如 光合作用能力。在 图4A 实时视频的截图如图所示，该设置用于使植物进入焦点，以确保测量结果的最优质量。除了对整株植物进行对焦外，也可选择单片叶片进行分析。 图4B 展示在实际测量开始前，暗适应植物当前的荧光产量 Ft。本例中选择了五个圆形感兴趣区域（AOIs）。每个 AOI 旁边红色框中的数字直接给出相应的数值结果，这些数据也可保存为表格形式。要开始进行光合参数 Fo、Fm 的测量，需先进行设置。设置完成后 Ft 的截图如下所示 图4C注意，此时“Fo,Fm”按钮将不再处于激活状态。要开始新的测量，需点击“New Record”以清除之前的归一化数据。最后， 图 4D 显示给予饱和光脉冲（“SAT-Pulse”）后有效的PSII量子产量Y(II)。示例数据的定量结果如图所示 图5在200 µM/cm²阳光下生长的植物²/s¹ (图5A播种后第12、21和28天分别对样品进行了分析。我们的数据表明，生长三周的植株叶片PSII效率显著高于生长12天的植株。28天与12天之间的差异仍具有显著性，但p值较高。在 图4B比较了在不同光质条件下生长两周的植物的光系统II（PSII）产量。有趣的是，在富含高比例蓝光的光照条件下长期生长，可显著提高PSII的产量。在红光富集条件下培养的植物也观察到类似效应，但增幅略低。

不同光质已被证明会影响气孔发育¹⁴。因此，本研究对气孔密度进行了考察。图6展示了叶片在色素提取后的外观，单个表皮细胞清晰可辨，气孔易于计数。图中以星号标示出各个气孔。有关不同光照条件下植物气孔密度的详细数据可参见其他文献⁹。

除了目视检查（图3）外，鲜重也是衡量生长进程的良好指标。本示例中，分别称量了播种后8、10和12天在“阳光”条件下生长的植株叶片鲜重。这些数据的统计分析结果见图7。与预期一致，鲜重随时间增加而增加。

除了鲜重之外，叶面积也是衡量生长的良好指标。本实验中，分别在播种后10、13和17天观察植株的发育情况（图8A）。通常至少评估六株独立的植株，以获得可靠的统计数据。为了说明大样本量的重要性，分别计算了分析两株和六株植物时平均值的百分比误差（图8B），即计算标准差相对于平均值的百分比。显然，在样本量较小时，误差比样本量较大时高出5–10%。通过增加被评估植株的数量，可以将误差最小化，从而使数据的解读更加清晰。

图 1：LED 提供不同光质。A) LED 培养箱控制面板的截图。光照时长设定为 16 小时（右上角），光强设定为 200 µmol cm^-2 s^-1。四个层级的光质各不相同：1.1 表示在技术上尽可能接近太阳光光谱，1.2 表示富含红光和蓝光波长（RB）的光，2.1 主要设定为蓝光（B），2.2 主要为红光（R）。B) 中间面板显示所有层级的概览；外侧面板以更高倍数展示各个单独层级。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：模拟日光条件下的波长光谱。 显示的是LED培养箱内置光谱仪的截图，该设备位于1.1层。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：一周内植物的发育情况。 分别来自四种光照条件下的代表性 A. thaliana 植株，拍摄于10、13和17天幼苗期（DAS）。所有植株均使用三脚架固定数码单反相机拍摄。比例尺在所有图像中均代表1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。

图 4：拟南芥（A. thaliana）植物PAM测量过程中代表性步骤的截图。 A) “实时视频”视图的截图，可在其中调整图像焦距。 B) 在施加任何光脉冲之前当前的荧光产量Ft。 C) 设置Fo/Fm后当前的荧光产量Ft。 D) 施加饱和光脉冲后对PSII量子产量的影响。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：PSII 量子产量（YII）效应的图示。 A) 对播种后 12、21 和 28 天，在模拟日光（“日光”）下以 200 µmol/cm²/s¹ 光照培养的植株进行 PAM 分析，所得数据经统计评估。图中显示的是每天五株植株及每个植株五个感兴趣区域（AOI）的平均值。一个星号表示与第 12 天相比具有显著差异（p 值 <0.05），两个星号表示具有极显著差异（p 值 <0.02），依据为学生 t 检验。 B) 对分别在模拟日光（SL）、富蓝光（B）或富红光（R）条件下，以 200 µmol/cm²/s¹ 光照培养的植株数据进行统计评估。图中显示的是每天五株植株及五个感兴趣区域（AOI）的平均值。显著性差异以“日光”组为参照进行比较计算。

图6：拟南芥（A. thaliana）叶片远轴面气孔的代表性图像。 叶片按上述方法制备，并在40倍放大倍数下使用微分干涉差（DIC）设置的光学显微镜进行观察分析。每种条件下至少统计4片叶子可见区域内的气孔数量。图像由连接至显微镜镜筒的数码相机拍摄。借助标尺计算每平方毫米（mm²）的气孔数目。星号标记单个气孔。标尺代表200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：A. thaliana 植物在模拟日光/200 µmol/cm²/s¹ 条件下生长的鲜重图示。 在播种后第8、10和12天，采集植株的莲座叶。图中显示了每天6株植物的平均值（单位：mg）。请点击此处查看此图的放大版本。

图8：不同光照条件下生长的 A. thaliana 叶面积的统计评估。 A) 通过 ImageJ 图像分析法测定生长10、13和17天的 A. thaliana 的叶面积，对 n = 6 株植物的数据进行统计分析。将每种条件下全部六株莲座叶的叶面积相加后除以六，得到平均值；基于该平均值计算标准差，并以误差线表示。 B) 使用 ImageJ 图像分析法测定叶面积，分别对 n = 2 或 n = 6 株植物的数据进行统计分析，方法同 A 图所示。随后计算平均值的误差百分比，并以图形方式展示。绿色条形表示 n = 6 分析所得的误差百分比，蓝色条形表示 n = 2 株植物分析所得的误差百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

研究植物生长的第一步是根据所需的条件设置气候室。这可以通过将所有变量输入相应软件的程序界面轻松完成（图1A）。在此步骤中，可通过改变光照周期和/或温度来实现多种调控。务必持续监测温度、湿度和光照条件（图2），以防止技术故障导致实验失败。这是获得可重复结果的关键环节。尽管该系统提供了多种可调参数且具有较高的灵活性，但仍存在一定的局限性。目前可用的LED光源无法百分之百模拟太阳光，而气候室内的气候条件也无法完全还原室外的真实环境¹⁵。

与广泛使用的荧光灯相比，LED灯具有更高的通用性、能耗更低，且几乎不产生热辐射。这些优势促使大型室内农业产业在气候室和温室中配备LED灯¹⁶。鉴于该领域已取得的巨大成功，LED技术必将获得更广泛的应用。

在观察表型尤其是测定叶面积时，需要注意的是，较老的植株叶片会发生重叠（图3），因此对整个莲座状叶丛进行图像分析往往不够准确。在这种情况下，更精确的方法是将所有叶片剪下后再进行测量。

不同条件下生长行为尤其是生长发育差异的评估依赖于足够的样本量。本研究中，至少使用六株植物进行测定 例如 光合产量（图5），鲜重（图7）以及叶面积（图8A但研究开始时播种了30粒独立的种子，以确保：第一，有足够数量的种子萌发；第二，可供选择的植株充足 "典型的" 植物可以被培育出来。即使在同一群体内， 即 相同培养条件下，同一托盘中单盆种植的植株表现出不同的表型。这在统计分析中自然会反映为标准差的存在，但通常情况下，当观察到较小的统计误差时，数据的解释更为可靠。图8B).

通过PAM测量光合性能（图4，图5）可获取多个参数。本实验以PSII的光化学量子产量Y(II)为例进行测定，但也可同时测定e.g.非光化学淬灭、调节性与非调节性能量耗散的量子产量或光反射率等参数。关键是要在每片叶片上均匀选择至少五个感兴趣区域（AOI），并对来自不同植株的至少六片叶片进行测量。该方法的局限性在于无法检测对PSI的影响；若需评估PSI，需使用其他设备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备LED面板的气候室	Rhenac Green Tec AG		这些气候室为定制产品。
光谱仪	OceanOptics	USB-650
成像PAM	Walz	IMAGING-PAM M系列	根据更广泛的应用需求，有多种适用型号可供选择。
显微镜+40倍物镜	Leica	DM1000	其他公司也生产适用的显微镜。
ImageJ软件			可从网站免费下载
植物RNA提取试剂盒	Qiagen	74903
生物分析仪	Agilent	G2939BA	需要额外配备一台计算机