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方法文章

三维牙龈炎症类人组织等效物

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DOI：

10.3791/57157

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2018年4月3日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

本文内容

摘要

本实验方案的目标是构建一种炎症性人类牙龈模型 体外该组织模型在三维条件下共培养三种人类细胞：HaCaT 角质形成细胞、牙龈成纤维细胞和 THP-1 巨噬细胞。该模型可用于牙周疾病（如牙龈炎和牙周炎）的研究。

摘要

牙周疾病（如牙龈炎和牙周炎）是成年人牙齿缺失的主要原因。牙龈组织的炎症是牙周疾病的基本病理生理基础。目前已有多种动物模型用于牙周疾病的研究。然而，动物模型的病理生理过程与人类存在差异，导致难以深入分析细胞与分子机制，也限制了针对牙周疾病新药的评估。本文介绍一种重建人源性牙龈炎症组织等效物（iGTE）的详细实验方案。 体外我们首先在三维条件下利用两种人类细胞——人牙龈成纤维细胞（HGF）和人皮肤表皮角质形成细胞（HaCaT）——构建人牙龈组织等效物（GTE）。通过使用组织打孔器在GTE上打孔，建立伤口模型。随后将混合于胶原凝胶中的人THP-1单核细胞注入GTE的孔洞中。加入10 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）处理72小时，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，从而在GTE中形成炎症病灶（iGTE）（iGTE也可通过2 µg/mL脂多糖（LPS）处理48小时以诱导炎症）。iGTE是首个 体外 利用三维结构的人源细胞构建的牙龈炎性组织模型。iGTE 模型反映了牙周病中的主要病理变化（免疫细胞活化，成纤维细胞、上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞之间的细胞内相互作用）。GTE、损伤后 GTE 及 iGTE 可作为多功能工具，用于研究伤口愈合、组织再生、炎症反应、细胞间相互作用，以及筛选牙周病潜在治疗药物。

引言

牙周病是成年人牙齿缺失的主要原因。牙龈炎和牙周炎是最常见的牙周疾病，二者均表现为由生物膜介导的牙龈组织急性和慢性炎症反应。牙龈炎以急性炎症为特征，而牙周炎通常表现为慢性炎症。在组织学层面，细菌成分可触发免疫细胞的活化，如巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞。1,2这些免疫细胞，尤其是巨噬细胞，与局部细胞（包括牙龈上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞）相互作用，导致牙周组织发生炎性病变。3,4已建立多种动物的牙周病实验模型，如大鼠、仓鼠、兔子、雪貂、犬类及灵长类动物。然而，动物模型的病理生理过程与人类存在差异，使得牙周病的细胞与分子机制研究以及新药物的评估变得困难。5牙周细菌与单层人源口腔上皮细胞的共培养已被用于研究牙周感染的机制6然而，口腔细胞的单层培养缺乏完整组织的三维（3D）细胞结构，因此无法模拟 体外 情况。

在此建立了牙龈的三维炎症性人体组织等效物（iGTE），以模拟牙周病 体外该牙周疾病三维模型在单层细胞培养与动物模型之间占据中间地位。将HaCaT角质形成细胞、牙龈成纤维细胞和THP-1巨噬细胞三种人类细胞共同培养于胶原凝胶上，并通过炎症启动因子刺激构建炎症性牙龈组织等效物（iGTE）。iGTE可高度模拟牙龈组织的 体内 牙龈细胞分化、细胞间相互作用及巨噬细胞活化的条件。该模型在牙周病药物筛选和新药理学方法测试方面具有广泛的应用前景，同时也可用于研究伤口愈合、炎症及组织再生过程中的细胞与分子机制。

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方案

本方案旨在构建人类牙龈组织等效物、牙龈伤口模型及牙龈炎模型。人皮肤表皮角质形成细胞（HaCaT）由德国海德堡德国癌症研究中心Norbert E. Fusenig教授惠赠7。人牙龈成纤维细胞（HGFs）根据已发表的方案从牙龈组织中分离获得8。研究前已获取受试者知情同意，并经日本东京日本齿科大学生命牙科研究所伦理委员会批准（批准号：NDU-T2012-35）。步骤1–3应在细胞培养生物安全柜中进行。

1. 三维人牙龈组织等效物（GTE）的制备（图1A）

  1. 在15 mL无菌离心管中，用移液器将I型胶原-A凝胶与10%浓缩MEM-α和10%重构缓冲液（每100 mL 0.05 N NaOH中含2.2 g NaHCO3和4.47 g HEPES）混合。将混合后的胶原溶液置于冰上，待用。
  2. 将24孔培养插件（孔径3.0 µm）放入24孔板中。
  3. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将HGF从培养表面消化下来。将细胞重悬于10 mL培养基A（MEM-α + 20% FBS + 1% GlutaMAX）中。使用Bürker-Türk血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 取所需数量的细胞（1–5 × 105 个细胞/mL），在190 × g条件下离心4分钟。
    2. 将细胞重悬于混合的胶原溶液中。将混合物置于冰上，待下一步使用。
  4. 将0.5 mL细胞-胶原混合液（每孔含0.5–2.5 × 105 个细胞）加入培养插件中，避免产生气泡。在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育10–30分钟，使混合物凝固成胶。
    注意：将胶原混合液加至培养插件中央，以避免胶原凝胶形成不均。
  5. 在孔中加入1 mL培养基，在插件中加入0.5 mL培养基。在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育24小时或过夜。
  6. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将HaCaT细胞从培养表面消化下来。将细胞重悬于10 mL培养基B（DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX）中并进行计数。用移液器取所需数量的细胞（1–5 × 105 个细胞/mL），在190 × g条件下离心4分钟。将细胞重悬于培养基B中。
  7. 通过抽吸去除含有HGF-胶原混合物的培养插件中的培养基。在HGF-胶原混合物上方加入0.5 mL HaCaT细胞悬液（每孔含0.5–2.5 × 105 个细胞）。孵育24小时或过夜。
    注意：此时培养孔中的培养基应为培养基A，而培养插件中的培养基应为培养基B。
  8. 更换为KSR培养基（共培养基）（MEM-α + 15% KnockOut血清替代物 + 1% GlutaMAX）+ 5% FBS。在培养孔中加入1 mL培养基，在培养插件中加入0.5 mL培养基。孵育24–48小时。
  9. 更换为KSR培养基 + 1% FBS。在培养孔中加入1 mL培养基，在培养插件中加入0.5 mL培养基。孵育24小时或过夜。
  10. 将培养孔中的培养基更换为0.7–1 mL KSR培养基。完全吸除培养插件中的培养基（使培养表面暴露于空气中）。孵育1–2周。每周更换两次培养孔中的培养基。
    注意：切勿使培养基液面超过培养表面（即由角质形成细胞构成的顶层）。始终确保培养表面保持干燥。

2. 受损GTE的制备（图1B）

  1. 准备一个直径为 1–3 mm 的组织打孔器，并在 121 °C 条件下使用高压灭菌器灭菌 20 分钟。
  2. 将组织打孔器垂直插入 GTE 约 300 µm 深度，在组织上打孔以模拟伤口。
  3. 在此步骤中，可使用造模后的 GTE 研究伤口愈合和组织再生。或者，使用 10% 中性缓冲福尔马林溶液固定 GTE，以进行组织学分析。

3. 炎症性牙龈组织等效物（iGTE）的制备（图1B）

  1. 根据先前的报道培养 THP-1 细胞9。
  2. 将 I 型胶原-A 凝胶与 10% 浓缩 RPMI 1640、10% 重建缓冲液（100 mL 0.05 N NaOH 中含 2.2 g NaHCO3 和 4.47 g HEPES）以及 10 ng/mL PMA 混合。将混合后的胶原溶液置于冰上，待用。
  3. 计数 1–2 × 106 个 THP-1 细胞，以 190 × g 离心 4 分钟。将细胞重悬于 1 mL 混合胶原溶液中。将混合物置于冰上，直至进行下一步操作。
  4. 将 10–30 µL THP-1-胶原混合物加入 GTE 的损伤区域。更换培养基为含 10 ng/mL PMA 的 0.7–1 mL KSR 培养基。
  5. 在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 72 小时。
  6. 利用该模型研究牙龈炎或牙周病（例如，向 iGTE 中添加潜在的抗炎药物，观察其对细胞因子释放的影响10）。或者，省略 72 小时 PMA 处理，向培养基中加入 2 µg/mL LPS，并在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 48 小时11,12。

4. GTE 与 iGTE 培养物的固定及全组织免疫染色

  1. 培养物的固定
    1. 从24孔板中移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织2次。
    2. 向插入物中加入 1 mL 10% 中性缓冲福尔马林溶液，向培养孔中也加入 1 mL。将 24 孔板置于 4 °C 冰箱中 °C 过夜。
    3. 次日移除10%中性缓冲福尔马林溶液。
    4. 对于整体免疫染色，在固定后用 PBS 清洗组织 3 至 4 次。
    5. 苏木精和伊红（H&E) 染色和常规免疫染色后，进行脱水、石蜡包埋和切片。
      注意：对于整体免疫染色，此步骤可以省略。
  2. 全组织免疫染色
    注意：本实验方案修改自参考文献13中的方案。
    1. 用 PBS 加 0.5–1% Triton 洗涤组织 3 次，每次 10–30 分钟。
    2. 在室温下，用封闭液（PBS 1% Triton + 10% BSA）孵育组织，每次30分钟，共孵育两次。
    3. 洗涤组织 2 次× 在封闭缓冲液中，每次5–10分钟。
    4. 加入50 µ将适量稀释/浓度的初级抗体溶液加入插入物中。使用薄塑料保鲜膜包裹插入物，以防止组织干燥。
    5. 在 4℃ 下孵育组织 1 至 2 天 °C.
    6. 用含1% Triton和10% BSA的PBS洗涤组织3次，每次30分钟；再用含1% Triton的PBS洗涤3次，每次5分钟。
    7. 加入50 µL 的二抗加入封闭缓冲液（PBS 1% Triton + 10% BSA）中，并加入5 µ向每个插入物中加入 Hoechst 33342 溶液（NucBlue Live Cell 染色剂）。使用薄塑料保鲜膜包裹插入物，以防止组织干燥。
    8. 在 4 ℃ 孵育 1 至 2 天 °C. 用湿润的纸巾包裹24孔板，然后将其放入塑料袋中，在整个孵育过程中使用。
    9. 用含1%吐温的PBS洗涤组织3次，每次10分钟
    10. 使用锋利的针头切割培养插件的膜以获取组织。将膜置于载玻片上。
      注意：组织应置于膜上。
    11. 加入 2–3 滴荧光封片剂，用盖玻片覆盖组织，并于 4 ℃ 保存 °避光保存至分析前。
    12. 使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM）观察组织。

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结果

在相差显微镜观察下，HaCaT细胞呈现出典型的角质形成细胞形态（图2A）。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，HaCaT细胞表面分布着大量微绒毛。HaCaT细胞之间的细胞间连接由细胞膜突起结构介导（图2B）。HaCaT细胞表达牙龈上皮标志物K8/1814，表明其适用于牙龈组织重建（图2C）。

图3A 展示了GTE成功的一个实例，以及 图 3B 显示了GTE的一个失败示例。该次不成功的试验（图3B) 是由于胶原凝胶混合物未添加至培养插件的中央所致。

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讨论

本实验方案基于先前报道中所述的牙龈组织等效物及皮下脂肪组织等效物的构建方法8,21,22。尽管该方法简单易行，但某些步骤需特别注意。例如，胶原混合物在使用前应始终保持在冰上，以防止溶液中提前形成凝胶。将胶原混合物加入培养插入物时，应确保将溶液注射至插入物的中央位置，以避免形成偏心凝胶（如图3B所示）。对GTE打孔也需要技巧。若组织过湿，打孔器有时无法拾取组织。此时可使用组织活检系统或一对镊子辅助；但如此操作会显著改变损伤部位的尺寸。此外，也可使用带锐利针头的注射器直接将THP-1细胞-胶原混合物注入GTE中而不必预先打孔（需确保凝胶不会堵塞针头）。

该方法的局限性在于无法完全模拟牙龈炎和牙周炎复杂的生物学现象，因为iGTE缺乏血管、神经细胞及其他免疫细胞，且其炎症并非由宿主-生物膜相互作用引起。然而，这是目前唯一一种由人源细胞构建的部分再...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分由日本促进科学振兴会（JSPS）科学研究费助成项目（26861689 和 17K11813）资助。作者感谢 Nathaniel Green 先生在校对方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ⅰ型胶原-ANitta Gelatin Inc用于构建GTE的真皮层
MEM-αThermo Fisher Scientific11900073细胞培养基
细胞培养小室（适用于24孔板），孔径3.0 μmCorning, Inc.353096用于组织培养
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061细胞培养试剂
DMEMThermo Fisher Scientific31600034细胞培养基
KnockOut 血清替代物Thermo Fisher Scientific10828028细胞培养试剂
组织打孔器Shibata system service co., LTDSP-703用于在GTE上打孔
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022细胞培养基
BSASigma-AldrichA3294用于免疫染色
Hoechst 33342（NucBlue 活细胞染色剂）Thermo Fisher ScientificR37605用于细胞核标记
荧光封片介质Dako免疫染色后样本的封片
抗细胞角蛋白8+18抗体 [5D3]abcamab17139用于鉴定上皮组织
扫描电子显微镜Hitachi, Ltd.HITACHI S-4000用于观察样本表面形貌与成分
共聚焦激光扫描显微镜LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.LSM 700用于观察样本的免疫荧光染色
抗细胞角蛋白19抗体abcamab52625用于鉴定上皮组织
抗波形蛋白抗体abcamab92547用于鉴定成纤维细胞和活化巨噬细胞
抗TE-7抗体MilliporeCBL271用于鉴定真皮层中的成纤维细胞
抗CD68抗体Sigma-AldrichSAB2700244用于鉴定巨噬细胞
人CD14抗体R&D SystemsMAB3832-SP用于鉴定巨噬细胞
Alexa Fluor 594标记的二抗（山羊抗兔IgG）Thermo Fisher ScientificA11012用于免疫荧光染色
Alexa Fluor 488标记的二抗（山羊抗小鼠IgG）Thermo Fisher ScientificA11001用于免疫荧光染色
EVOS FL 细胞成像系统Thermo Fisher Scientific用于观察样本的免疫荧光染色
THP-1细胞Riken BRC细胞库RCB1189用于构建iGTE
PMA（佛波酯，Phorbol 12-myristate 13-acetate）Sigma-AldrichP8139用于诱导THP-1细胞分化

参考文献

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