三维牙龈炎症类人组织等效物

摘要

本实验方案的目标是构建一种炎症性人类牙龈模型 体外该组织模型在三维条件下共培养三种人类细胞：HaCaT 角质形成细胞、牙龈成纤维细胞和 THP-1 巨噬细胞。该模型可用于牙周疾病（如牙龈炎和牙周炎）的研究。

摘要

牙周疾病（如牙龈炎和牙周炎）是成年人牙齿缺失的主要原因。牙龈组织的炎症是牙周疾病的基本病理生理基础。目前已有多种动物模型用于牙周疾病的研究。然而，动物模型的病理生理过程与人类存在差异，导致难以深入分析细胞与分子机制，也限制了针对牙周疾病新药的评估。本文介绍一种重建人源性牙龈炎症组织等效物（iGTE）的详细实验方案。 体外我们首先在三维条件下利用两种人类细胞——人牙龈成纤维细胞（HGF）和人皮肤表皮角质形成细胞（HaCaT）——构建人牙龈组织等效物（GTE）。通过使用组织打孔器在GTE上打孔，建立伤口模型。随后将混合于胶原凝胶中的人THP-1单核细胞注入GTE的孔洞中。加入10 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）处理72小时，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，从而在GTE中形成炎症病灶（iGTE）（iGTE也可通过2 µg/mL脂多糖（LPS）处理48小时以诱导炎症）。iGTE是首个 体外 利用三维结构的人源细胞构建的牙龈炎性组织模型。iGTE 模型反映了牙周病中的主要病理变化（免疫细胞活化，成纤维细胞、上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞之间的细胞内相互作用）。GTE、损伤后 GTE 及 iGTE 可作为多功能工具，用于研究伤口愈合、组织再生、炎症反应、细胞间相互作用，以及筛选牙周病潜在治疗药物。

引言

牙周病是成年人牙齿缺失的主要原因。牙龈炎和牙周炎是最常见的牙周疾病，二者均表现为由生物膜介导的牙龈组织急性和慢性炎症反应。牙龈炎以急性炎症为特征，而牙周炎通常表现为慢性炎症。在组织学层面，细菌成分可触发免疫细胞的活化，如巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞。^1,2这些免疫细胞，尤其是巨噬细胞，与局部细胞（包括牙龈上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞）相互作用，导致牙周组织发生炎性病变。^3,4已建立多种动物的牙周病实验模型，如大鼠、仓鼠、兔子、雪貂、犬类及灵长类动物。然而，动物模型的病理生理过程与人类存在差异，使得牙周病的细胞与分子机制研究以及新药物的评估变得困难。⁵牙周细菌与单层人源口腔上皮细胞的共培养已被用于研究牙周感染的机制⁶然而，口腔细胞的单层培养缺乏完整组织的三维（3D）细胞结构，因此无法模拟 体外 情况。

在此建立了牙龈的三维炎症性人体组织等效物（iGTE），以模拟牙周病 体外该牙周疾病三维模型在单层细胞培养与动物模型之间占据中间地位。将HaCaT角质形成细胞、牙龈成纤维细胞和THP-1巨噬细胞三种人....

方案

本方案旨在构建人类牙龈组织等效物、牙龈伤口模型及牙龈炎模型。人皮肤表皮角质形成细胞（HaCaT）由德国海德堡德国癌症研究中心Norbert E. Fusenig教授惠赠⁷。人牙龈成纤维细胞（HGFs）根据已发表的方案从牙龈组织中分离获得⁸。研究前已获取受试者知情同意，并经日本东京日本齿科大学生命牙科研究所伦理委员会批准（批准号：NDU-T2012-35）。步骤1–3应在细胞培养生物安全柜中进行。

1. 三维人牙龈组织等效物（GTE）的制备（图1A）

1. 在15 mL无菌离心管中，用移液器将I型胶原-A凝胶与10%浓缩MEM-α和10%重构缓冲液（每100 mL 0.05 N NaOH中含2.2 g NaHCO₃和4.47 g HEPES）混合。将混合后的胶原溶液置于冰上，待用。
2. 将24孔培养插件（孔径3.0 µm）放入24孔板中。
3. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将HGF从培养表面消化下来。将细胞重悬于10 mL培养基A（MEM-α + 20% FBS + 1% GlutaMAX）中。使用Bürker-Türk血细胞计数板对细胞进行计数。
   1. 取所需数量的细胞（1–5 × 10

结果

在相差显微镜观察下，HaCaT细胞呈现出典型的角质形成细胞形态（图2A）。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，HaCaT细胞表面分布着大量微绒毛。HaCaT细胞之间的细胞间连接由细胞膜突起结构介导（图2B）。HaCaT细胞表达牙龈上皮标志物K8/18¹⁴，表明其适用于牙龈组织重建（图2C）。

图3A 展示了GTE成功的一个实例，以及 图 3B 显示了GTE的一个失败示例。该次不成功的试验（图3B) 是由于胶原凝胶混合物未添加至培养插件的中央所致。

讨论

本实验方案基于先前报道中所述的牙龈组织等效物及皮下脂肪组织等效物的构建方法^8,21,22。尽管该方法简单易行，但某些步骤需特别注意。例如，胶原混合物在使用前应始终保持在冰上，以防止溶液中提前形成凝胶。将胶原混合物加入培养插入物时，应确保将溶液注射至插入物的中央位置，以避免形成偏心凝胶（如图3B所示）。对GTE打孔也需要技巧。若组织过湿，打孔器有时无法拾取组织。此时可使用组织活检系统或一对镊子辅助；但如此操作会显著改变损伤部位的尺寸。此外，也可使用带锐利针头的注射器直接将THP-1细胞-胶原混合物注入GTE中而不必预先打孔（需确保凝胶不会堵塞针头）。

该方法的局限性在于无法完全模拟牙龈炎和牙周炎复杂的生物学现象，因为iGTE缺乏血管、神经细胞及其他免疫细胞，且其炎症并非由宿主-生物膜相互作用引起。然而，这是目前唯一一种由人源细胞构建的部分再.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ⅰ型胶原-A	Nitta Gelatin Inc		用于构建GTE的真皮层
MEM-α	Thermo Fisher Scientific	11900073	细胞培养基
细胞培养小室（适用于24孔板），孔径3.0 μm	Corning, Inc.	353096	用于组织培养
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	细胞培养试剂
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	细胞培养基
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher Scientific	10828028	细胞培养试剂
组织打孔器	Shibata system service co., LTD	SP-703	用于在GTE上打孔
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	细胞培养基
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	用于免疫染色
Hoechst 33342（NucBlue 活细胞染色剂）	Thermo Fisher Scientific	R37605	用于细胞核标记
荧光封片介质	Dako		免疫染色后样本的封片
抗细胞角蛋白8+18抗体 [5D3]	abcam	ab17139	用于鉴定上皮组织
扫描电子显微镜	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	用于观察样本表面形貌与成分
共聚焦激光扫描显微镜	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	用于观察样本的免疫荧光染色
抗细胞角蛋白19抗体	abcam	ab52625	用于鉴定上皮组织
抗波形蛋白抗体	abcam	ab92547	用于鉴定成纤维细胞和活化巨噬细胞
抗TE-7抗体	Millipore	CBL271	用于鉴定真皮层中的成纤维细胞
抗CD68抗体	Sigma-Aldrich	SAB2700244	用于鉴定巨噬细胞
人CD14抗体	R&D Systems	MAB3832-SP	用于鉴定巨噬细胞
Alexa Fluor 594标记的二抗（山羊抗兔IgG）	Thermo Fisher Scientific	A11012	用于免疫荧光染色
Alexa Fluor 488标记的二抗（山羊抗小鼠IgG）	Thermo Fisher Scientific	A11001	用于免疫荧光染色
EVOS FL 细胞成像系统	Thermo Fisher Scientific		用于观察样本的免疫荧光染色
THP-1细胞	Riken BRC细胞库	RCB1189	用于构建iGTE
PMA（佛波酯，Phorbol 12-myristate 13-acetate）	Sigma-Aldrich	P8139	用于诱导THP-1细胞分化