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方法文章

一种将胰岛移植至小鼠大网膜的方法

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DOI：

10.3791/57160

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2019年1月7日

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1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, Shenzhen University Health Science Center, 2Institute for Cellular Therapeutics, Allegheny-Singer Research Institute, 3Xenotransplantation Program/Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4College of Life Science and Oceanography, Shenzhen University, 5School of Pharmcy, Wenzhou Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。

摘要

胰岛移植被认为是一种治疗1型糖尿病的潜在方法。近期有力的证据表明，血管内胰岛输注远非理想方案，因此，大网膜正重新成为胰岛移植的一个潜在重要部位。本实验需要分离高质量的胰岛，并将胰岛植入糖尿病受体。将胰岛移植至大网膜的过程涉及多个手术步骤，通过视觉方式展示更为清晰。本文详细介绍了该操作的具体步骤。文中描述了两种在将分离的胰岛植入糖尿病小鼠大网膜囊之前，将其与水凝胶混合的方法。不同实验条件下使用了不同的水凝胶。对接受同基因胰岛移植至大网膜的糖尿病小鼠受体，持续监测其血糖水平达35天。部分动物在术后14天被处死，以进行免疫组织化学分析。这种临床前移植方法可作为初步数据，为后续向临床移植转化提供依据。

引言

根据国际糖尿病联合会（IDF）的数据，目前糖尿病影响着3.82亿人，预计到2035年将增至5.92亿人1。在同种异体和异种胰岛移植中，均需要系统性免疫抑制治疗。若不进行免疫抑制，免疫排斥是移植物丢失的主要原因2。此外，由于即时血液介导的炎症反应（IBMIR），移植胰岛的丢失也是一个严重问题3,4。然而，即使在无免疫反应的情况下（如在同基因型或自体移植模型中），通过门静脉将胰岛细胞移植至肝脏后，仍会因炎症和/或不利的微环境条件（如血供不足导致的氧合水平降低和/或营养缺乏）而发生细胞丢失5,6。因此，为了确保长期的代谢功能，必须移植更多的胰岛以弥补早期细胞丢失所导致的植入率下降7。

为了优化胰岛移植物的植入效果，研究人员已在实验和临床层面探索了多种替代性解剖位点，结果令人鼓舞，但尚无定论8。尽管部分替代位点具有易于安全操作的特点（例如，皮肤、肾包膜、胃黏膜下层和眼前房），或可为较大体积的胰岛组织提供更广阔的植入面积（例如，腹腔），但移植胰岛的存活率及其生理代谢功能仍受限，仍是当前关注的重点问题9。寻找更适宜的胰岛植入位点的研究仍在持续进行中。

在胰岛移植的早期发展中，大网膜是众多被研究的解剖位点之一，并被证明是胰岛存活的有利环境10,11,12,13,14。然而，由于门静脉内胰岛输注操作相对简便，并且在动物模型中早期取得了成功，该方法逐渐成为临床首选6。此外，在胰岛移植研究初期，该移植位点相关的不利因素——尤其是早期大量胰岛丢失问题——尚未被充分认识，限制作用也较小。随着近年来越来越多的有力证据表明血管内胰岛输注远非理想方案，大网膜正重新被视为细胞移植的一个潜在重要位点。

网膜（以网膜囊的形式）相较于肝脏具有相对优势15,16。网膜血供丰富且易于接触，允许必要时取出移植物和/或进行活检。与肝脏相比，胰岛在此处经历的缺血时间更短，且网膜能够接受相对较大的胰岛移植量，而经门静脉移植则无法实现这一点，因为门静脉压力升高可能引发并发症。

本研究中采用的实验方案使用了同系小鼠移植模型，选用6至8周龄、体重为20–25 g的C57BL/6雄性小鼠。通过腹腔注射250 mg/kg剂量的链脲佐菌素（streptozotocin）一次，使胰岛移植受体小鼠诱导为糖尿病状态。若小鼠在注射后48小时的血糖水平超过24 mmol/L，并且该水平持续至少5天，则可认为糖尿病诱导成功。

采用经改进的既往发表方法，从年龄相匹配的供体胰腺中分离同基因型胰岛。简言之，将胶原酶注射至胆囊而非胆管，此项改进旨在提高注射操作的便捷性。胶原酶灌注后，依次进行孵育、组织解离、密度梯度分离及手工挑选，以获得纯净胰岛。胰岛在移植前于T175培养瓶中用CMRL-1066培养基加10%热灭活胎牛血清（FBS）在37 °C、95%空气-5% CO2条件下培养过夜。

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方案

本研究中使用的所有小鼠均来自广东省医学实验动物中心。动物使用已获得深圳市第二人民医院伦理审查委员会批准，符合动物福利原则。

1. 胰岛移植至大网膜

注意：本方案需要两人协作完成。

  1. 准备表1中列出的手术材料。在手术区域使用无菌布单和一次性无菌材料建立无菌区域，并在整个手术过程中维持无菌条件。对所有手术器械进行灭菌处理，操作人员需穿戴无菌手术衣。
  2. 在体视显微镜下，使用200 µL移液器吸头挑取胰岛。每只小鼠每次移植接受450–500个胰岛当量（IEQ）。为每只动物将足够一次移植使用的胰岛置于含有100 µL CMRL-1066培养基的无菌1.5 mL离心管中。
    注意：胰岛可在移植当天分离，但建议在移植前一天分离，以便胰岛从分离过程中恢复。
  3. 将含有胰岛的离心管置于冰上，直至准备进行移植。
  4. 从-20 °C冰箱中取出基底膜基质水凝胶并置于冰上解冻。该水凝胶在4 °C至10 °C时呈液态，在较高温度下会凝固。
  5. 称重并标记所有糖尿病受体小鼠。按60 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠。通过脚趾夹捏测试麻醉深度；若动物有反应，追加10 mg/kg戊巴比妥钠。若无回缩反射，则表明麻醉深度适合手术。
  6. 使用70%乙醇擦拭腹部手术区域，用剃须刀片剃除手术部位毛发，并用碘伏消毒。麻醉期间在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
  7. 使用眼科剪沿腹中线切开4至5 cm切口，打开腹腔。将肠管移向左侧，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖，以防止手术过程中过度脱水。
  8. 使用棉签充分暴露胃部视野，定位大网膜（位于胃下方）。使用两把精细镊子牵拉并展开大网膜，注意避免撕裂造成损伤。
  9. 此时水凝胶已完全解冻。将含有胰岛的离心管在200 × g条件下离心30秒，弃去上清液。吸取50 µL水凝胶加入含胰岛的离心管中，轻柔重悬混合物，避免产生气泡。操作过程中保持离心管置于冰上。
  10. 使用两把镊子夹住大网膜边缘，轻轻提起，形成位于胃壁与肠管之间的沟槽，用于容纳含胰岛移植物的少量液体。
  11. 由第二位操作者协助，用200 µL移液器吸头吸取重悬后的胰岛-水凝胶混合物（即管内全部内容物），将其注入沟槽中。
  12. 通过轻微抬高或降低大网膜边缘，确保混合物准确置于沟槽内。在水凝胶因体温作用而凝固前的3分钟内完成定位。水凝胶凝固后，将大网膜折叠覆盖移植物。
    注意：随着水凝胶的凝固，大网膜将与周围胃壁粘连固定。
  13. 待水凝胶完全凝固后，使用棉签将肠管复位回腹腔，注意避免触碰移植部位。
  14. 向腹腔内加入20 µL头孢菌素（5~10 mg）以预防感染，随后使用4-0缝线关闭腹腔。
  15. 将小鼠放回笼中，并为每只受体小鼠重复上述所有步骤。保持小鼠体温，并持续观察直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。在完全恢复前，将小鼠与其他动物隔离饲养。
  16. 术后每周每日注射50 µL头孢唑林钠（0.05 mg/mL）作为预防性抗生素。给予布比卡因与布伦诺啡镇痛：即在伤口夹固定前，局部涂抹1-3滴0.25%布比卡因。通过腹腔（IP）途径给予布伦诺啡（0.03 mg/mL溶于无菌0.9%生理盐水，剂量为0.05–0.10 mg/kg）。 
  17. 移植后每日使用血糖仪检测尾静脉血样中的非空腹血糖水平。当移植至大网膜时，胰岛移植物功能可能延迟，完全恢复正常血糖水平可能需要2–3周时间。
  18. 实验结束后，取小鼠大网膜移植物用于组织学分析。根据组织学实验方案固定组织样本，可用于免疫组化或免疫荧光研究。

2. 大网膜移植的替代方法

注意：可使用一种在室温下应用的替代性纤维蛋白-凝血酶水凝胶来取代基底膜基质水凝胶。该水凝胶由两种组分构成：纤维蛋白封闭蛋白溶液（50 U/mL 凝血酶和 10 mg/mL 纤维蛋白原）。当这两种组分混合后，会形成凝块，从而将胰岛固定在原位。

  1. 在室温下使用纤维蛋白-凝血酶水凝胶复合物。与步骤1.2相同，每只小鼠每次移植将接受450–500个胰岛当量（IEQ）。将胰岛置于含有100 µL CMRL-1066培养基的无菌1.5 mL离心管中。在移植前立即用无菌PE50导管吸取胰岛，导管长度为10 cm，并轻轻离心（200 × g，30秒），形成疏松的沉淀。
  2. 按照上述方法准备动物（步骤1.5–1.8），并将大网膜展开。混合水凝胶组分（每种10 µL），并将其置于大网膜上。（图3D）
  3. 立即将胰岛从导管中排出至水凝胶上。水凝胶会在胰岛周围形成凝块。（图3E）
  4. 将大网膜折叠覆盖在水凝胶和胰岛上，形成一个囊袋。（图3F）随后继续进行步骤1.13至1.18。

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结果

胰腺消化后的状态如图1A所示。纯化的胰岛如图1B所示。胰岛的二苯硫腙（Dithizone）染色及活力检测结果如图2所示。胰岛移植至大网膜的主要操作步骤如图3所示。大网膜移植后受体的血糖水平如图4所示。移植物的组织学分析结果如图5所示。

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讨论

通过门静脉将胰岛移植至肝脏是目前人类胰岛移植最常用的方法，但仍存在移植效率与安全性方面的担忧，例如门静脉血栓形成和肝脂肪变性17。近期研究表明，大网膜可能成为肝脏之外的一个合适替代移植部位，但在进入临床转化之前，仍需开展更多研究12,14,18,19。

小鼠是测试网膜作为胰岛移植位点的合适模型。在小鼠体内，网膜位于胃壁下方，通常呈折叠状态。然而，小鼠网膜尺寸较小，且难以操作。为了将其用于移植，需要先轻柔地将其完全展开，待胰岛/水凝胶混合物接种后再将其折叠覆盖。在较大的动物中，网膜组织更为宽大，可通过缝合构建一个或多个 pouch 结构以容纳胰岛。小鼠的网膜较为脆弱，不易承受缝合而不破裂。因此，需使用水凝胶在不缝合的情况下构建 pouch。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作的部分作者获得了国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学重点学科建设项目基金（2016031638）、深圳市科技计划项目（JCJY20160229204849975，GJHZ20170314171357556，JCYJ20160425110110658）、深圳市卫生和计划生育委员会科研基金（SZXJ2017021）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
5 英寸（12–13 cm）剪刀RWD Life Science S12030-11
精细镊子RWD Life ScienceF11010-13
小型伤口夹RWD Life ScienceR33003-01
AcutenaculumRWD Life ScienceF31044-13
两把组织镊RWD Life Science F13023-10
4-0 带针缝线Chenghe，中国17094
200 μL 移液器及吸头GilsonPN11
One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统  Johnson & Johnson33391713
刀片PhilipsHC1099/15
材料与动物
戊巴比妥钠Sigmaaldrich.comP3761用于麻醉 
水凝胶 bdbiosciences.com356234基底膜基质
纤维蛋白-凝血酶水凝胶 Baxter.com1501250混合后形成凝块
70% 乙醇Yingniu 医疗，安徽，中国23170608
碘伏利尔康医疗科技，山东，中国170521
生理盐水Baxter.com2B1324
头孢菌素鲁康医疗，山东，中国150303
头孢唑林Baxter.com2G3508
润滑性眼膏Major Pharmaceuticals203964
链脲佐菌素Sigmaaldrich.comS0130
V 型胶原酶Sigmaaldrich.comC9262
CMRL-1066 培养基celltrans，温州，中国X018D1
HistopaqueSigmaaldrich.com10771密度梯度介质
PE50 导管Braintreesci.comPE50 100 FT聚乙烯 0.023" × 0.038
Calcein AMSigmaaldrich.comC1359
碘化丙啶Sigmaaldrich.comP4864
最佳切割温度化合物（OCT）Tissue-Tek；Miles，Naperville，IL4583包埋介质
胰岛素抗体Cell Signaling Technology，Danvers，MA 019238138S
苏木精染色液Cell Signaling Technology，Danvers，MA 0192314166S
伊红染色液碧云天生物技术，中国C0109
DAPIThermo Fisher Scientific Inc. D1306
C57Bl/6 小鼠广东省医学实验动物中心/
胎牛血清GE Healthcare Life SciencesSH30084
T175 培养瓶Falcon353112
1.5 mL 扣盖管AxygenMCT-150-C

参考文献

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
  2. Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
  3. Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
  4. Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
  5. Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
  6. Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).
  7. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
  8. Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).
  9. Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
  10. Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
  11. Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
  12. Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).
  13. Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
  14. Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
  15. Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
  16. Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
  17. Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
  18. Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
  19. Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).

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