介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。
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本文内容
摘要
摘要
胰岛移植被认为是一种治疗1型糖尿病的潜在方法。近期有力的证据表明，血管内胰岛输注远非理想方案，因此，大网膜正重新成为胰岛移植的一个潜在重要部位。本实验需要分离高质量的胰岛，并将胰岛植入糖尿病受体。将胰岛移植至大网膜的过程涉及多个手术步骤，通过视觉方式展示更为清晰。本文详细介绍了该操作的具体步骤。文中描述了两种在将分离的胰岛植入糖尿病小鼠大网膜囊之前，将其与水凝胶混合的方法。不同实验条件下使用了不同的水凝胶。对接受同基因胰岛移植至大网膜的糖尿病小鼠受体，持续监测其血糖水平达35天。部分动物在术后14天被处死，以进行免疫组织化学分析。这种临床前移植方法可作为初步数据，为后续向临床移植转化提供依据。
引言
根据国际糖尿病联合会（IDF）的数据，目前糖尿病影响着3.82亿人，预计到2035年将增至5.92亿人1。在同种异体和异种胰岛移植中，均需要系统性免疫抑制治疗。若不进行免疫抑制，免疫排斥是移植物丢失的主要原因2。此外，由于即时血液介导的炎症反应（IBMIR），移植胰岛的丢失也是一个严重问题3,4。然而，即使在无免疫反应的情况下（如在同基因型或自体移植模型中），通过门静脉将胰岛细胞移植至肝脏后，仍会因炎症和/或不利的微环境条件（如血供不足导致的氧合水平降低和/或营养缺乏）而发生细胞丢失5,6。因此，为了确保长期的代谢功能，必须移植更多的胰岛以弥补早期细胞丢失所导致的植入率下降7。
为了优化胰岛移植物的植入效果，研究人员已在实验和临床层面探索了多种替代性解剖位点，结果令人鼓舞，但尚无定论8。尽管部分替代位点具有易于安全操作的特点（例如，皮肤、肾包膜、胃黏膜下层和眼前房），或可为较大体积的胰岛组织提供更广阔的植入面积（例如，腹....
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方案
本研究中使用的所有小鼠均来自广东省医学实验动物中心。动物使用已获得深圳市第二人民医院伦理审查委员会批准，符合动物福利原则。
1. 胰岛移植至大网膜
注意：本方案需要两人协作完成。
- 准备表1中列出的手术材料。在手术区域使用无菌布单和一次性无菌材料建立无菌区域，并在整个手术过程中维持无菌条件。对所有手术器械进行灭菌处理，操作人员需穿戴无菌手术衣。
- 在体视显微镜下，使用200 µL移液器吸头挑取胰岛。每只小鼠每次移植接受450–500个胰岛当量（IEQ）。为每只动物将足够一次移植使用的胰岛置于含有100 µL CMRL-1066培养基的无菌1.5 mL离心管中。
注意：胰岛可在移植当天分离，但建议在移植前一天分离，以便胰岛从分离过程中恢复。 - 将含有胰岛的离心管置于冰上，直至准备进行移植。
- 从-20 °C冰箱中取出基底膜基质水凝胶并置于冰上解冻。该水凝胶在4 °C至10 °C时呈液态，在较高温度下会凝固。
- 称重并标记所有糖尿病受体小鼠。按60 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠。通过脚趾夹捏测试麻醉深度；若动物有反应，追加10 mg/kg戊巴比妥钠。若无回缩反射，则表明麻醉深度适合手术。
- 使用70%乙醇擦拭腹部手术区域，用剃须刀片剃除手术部位毛发，并用碘伏消毒。....
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结果
胰腺消化后的状态如图1A所示。纯化的胰岛如图1B所示。胰岛的二苯硫腙（Dithizone）染色及活力检测结果如图2所示。胰岛移植至大网膜的主要操作步骤如图3所示。大网膜移植后受体的血糖水平如图4所示。移植物的组织学分析结果如图5所示。
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讨论
通过门静脉将胰岛移植至肝脏是目前人类胰岛移植最常用的方法，但仍存在移植效率与安全性方面的担忧，例如门静脉血栓形成和肝脂肪变性17。近期研究表明，大网膜可能成为肝脏之外的一个合适替代移植部位，但在进入临床转化之前，仍需开展更多研究12,14,18,19。
小鼠是测试网膜作为胰岛移植位点的合适模型。在小鼠体内，网膜位于胃壁下方，通常呈折叠状态。然而，小鼠网膜尺寸较小，且难以操作。为了将其用于移植，需要先轻柔地将其完全展开，待胰岛/水凝胶混合物接种后再将其折叠覆盖。在较大的动物中，网膜组织更为宽大，可通过缝合构建一个或多个 pouch 结构以容纳胰岛。小鼠的网膜较为脆弱，不易承受缝合而不破裂。因此，需使用水凝胶在不缝合的情况下构建 pouch。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作的部分作者获得了国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学重点学科建设项目基金（2016031638）、深圳市科技计划项目（JCJY20160229204849975，GJHZ20170314171357556，JCYJ20160425110110658）、深圳市卫生和计划生育委员会科研基金（SZXJ2017021）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 5 英寸（12–13 cm）剪刀 | RWD Life Science | S12030-11 | |
| 精细镊子 | RWD Life Science | F11010-13 | |
| 小型伤口夹 | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 两把组织镊 | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 带针缝线 | Chenghe，中国 | 17094 | |
| 200 μL 移液器及吸头 | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统 | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| 刀片 | Philips | HC1099/15 | |
| 材料与动物 | |||
| 戊巴比妥钠 | Sigmaaldrich.com | P3761 | 用于麻醉 |
| 水凝胶 | bdbiosciences.com | 356234 | 基底膜基质 |
| 纤维蛋白-凝血酶水凝胶 | Baxter.com | 1501250 | 混合后形成凝块 |
| 70% 乙醇 | Yingniu 医疗，安徽，中国 | 23170608 | |
| 碘伏 | 利尔康医疗科技，山东，中国 | 170521 | |
| 生理盐水 | Baxter.com | 2B1324 | |
| 头孢菌素 | 鲁康医疗，山东，中国 | 150303 | |
| 头孢唑林 | Baxter.com | 2G3508 | |
| 润滑性眼膏 | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| 链脲佐菌素 | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| V 型胶原酶 | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 培养基 | celltrans，温州，中国 | X018D1 | |
| Histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | 密度梯度介质 |
| PE50 导管 | Braintreesci.com | PE50 100 FT | 聚乙烯 0.023" × 0.038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| 碘化丙啶 | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| 最佳切割温度化合物（OCT） | Tissue-Tek；Miles，Naperville，IL | 4583 | 包埋介质 |
| 胰岛素抗体 | Cell Signaling Technology，Danvers，MA 01923 | 8138S | |
| 苏木精染色液 | Cell Signaling Technology，Danvers，MA 01923 | 14166S | |
| 伊红染色液 | 碧云天生物技术，中国 | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 小鼠 | 广东省医学实验动物中心 | / | |
| 胎牛血清 | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 培养瓶 | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL 扣盖管 | Axygen | MCT-150-C |
参考文献
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al.
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重印与许可
