地中海涡虫 Schmidtea mediterranea 是研究干细胞和组织再生的优良模型。本文介绍了一种通过将动物暴露于叠氮化钠化学试剂中，选择性去除咽部这一器官的方法。本方案还概述了监测咽部再生的方法。
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本文内容
摘要
摘要
涡虫是一类再生能力极强的扁形动物。这种能力源于其体内大量存在的干细胞，这些干细胞能够迅速响应各种类型的损伤。目前常用的损伤模型会移除大量组织，导致多个器官受损。为了克服这种广泛的组织损伤，本文介绍了一种在地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）中选择性去除单一器官——咽部的方法。该方法通过将涡虫浸泡在含有细胞色素氧化酶抑制剂叠氮化钠的溶液中实现。短时间暴露于叠氮化钠可诱导涡虫咽部外翻，我们称之为"化学性截除”。化学性截除可完全去除整个咽部，并在咽部与肠管连接处形成一个小伤口。经过充分冲洗后，所有被截除咽部的涡虫均能在约一周时间内再生出功能完整的咽部。这一再生过程由身体其他部位的干细胞驱动。本文提供了化学性截除的详细实验方案，并描述了用于评估截除和再生是否成功的组织学及行为学检测方法。
引言
再生是动物界普遍存在的一种现象，其再生能力从某些无脊椎动物的全身再生，到脊椎动物较为有限的再生能力不等1。功能性组织的替换是一个复杂的过程，通常需要同时恢复多种细胞类型。例如，要实现蝾螈肢体的再生，需要重新生成成骨细胞、软骨细胞、神经元、肌肉细胞以及上皮细胞2。这些新生成的细胞类型还必须进行适当的组织排列，以实现肢体功能的重建。要理解这些复杂的过程，需要采用专注于特定细胞类型再生及其在器官中整合的技术。
为简化对再生反应的研究，一种常用策略是靶向消融特定细胞类型或较大范围的组织。例如，在斑马鱼中，特定细胞类型表达硝基还原酶后，经甲硝唑处理即可导致这些细胞被破坏3,4。在果蝇（Drosophila）幼虫中，利用组织特异性启动子驱动促凋亡基因的表达，可选择性地消融成虫盘的特定区域5,6。这两种策略均可引发快速但可控的损伤，已被广泛用于解析介导再生的分子与细胞机制。
在本文中，我们描述了一种选择性消融名为咽部的整个器官的方法，该器官位于涡虫Schmidtea mediterr....
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方案
1. 准备
- 涡虫培养用水的制备17
- 将涡虫维持在1X Montjuïc盐溶液中。为制备涡虫用水，分别用超纯水配制1 M CaCl2、1 M MgSO4、1 M MgCl2、1 M KCl和5 M NaCl的储备液。使用0.2 µm瓶顶滤器过滤除菌，以供长期储存。
注意： 配制Montjuïc盐溶液时，仅使用超纯去离子水（25 °C时电阻率为18.2 MΩ）。 - 为配制1 L的5X盐溶液储备液，将5 mL 1 M CaCl2、5 mL 1 M MgSO4、0.5 mL 1 M MgCl2、0.5 mL 1 M KCl和1.6 mL 5 M NaCl溶液加入900 mL超纯水中。向该溶液中加入0.504 g NaHCO3，搅拌至溶解。用盐酸调节pH至7.0。
- 将上述5X储备液用超纯水在无菌容器（如大容量烧瓶，见材料表）中稀释至1X工作浓度。此1X溶液用于维持无性繁殖涡虫。
注意： 作为Montjuïc盐溶液的替代方案，可使用市售的矿泉水或含商业水族盐混合物（见材料表<....
- 将涡虫维持在1X Montjuïc盐溶液中。为制备涡虫用水，分别用超纯水配制1 M CaCl2、1 M MgSO4、1 M MgCl2、1 M KCl和5 M NaCl的储备液。使用0.2 µm瓶顶滤器过滤除菌，以供长期储存。
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结果
叠氮化钠暴露会破坏涡虫的正常运动能力，导致动物伸展并扭曲蠕动。这些运动迫使咽部从动物腹侧伸出，约在叠氮化钠溶液中处理6分钟后，可见咽部顶端呈现白色突起(图1B-左图)。数分钟后，动物主动收缩，并通过强力将咽部完全推出体外而使其充分伸展(图1B-中图)。叠氮化钠暴露约11分钟后，动物和咽部逐渐松弛。在此阶段，咽部特有的钟形结构清晰可见(图1B-右图)。为便于进行截除操作，需等待咽部完全松弛后再实施。
由于咽部是一团较大且无色素的组织，将其移除后会在截肢动物的背侧出现一个深色斑点 (图2A)。该.......
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讨论
本方案描述了一种使用叠氮化钠选择性消融咽部的方法。其他针对涡虫的靶向消融研究曾采用改良手术方法去除感光细胞21，或使用药理学处理消融多巴胺能神经元22。与现有方法相比，化学截除的一个显著优势在于无需进行手术。相较于涡虫身体其他较柔软的部分，咽部具有较为坚硬的结构，这有助于将其从动物体内完全移除。此外，咽部通过一个较小的连接部位（食管）30与肠相连，该连接点使得咽部脱离时产生的伤口比使用较大手术器械造成的伤口更具可重复性。基于其物理特性以及与动物其他部分较小的解剖连接，咽部切除所产生的伤口比其他外科截除手术更为均一。
叠氮化钠的暴露时间对本技术的成功也至关重要。尽管短暂暴露于叠氮化钠不会对涡虫产生不利影响，但长时间暴露则具有毒性，并最终导致动物死亡。已知叠氮化钠通过抑制细胞色素氧化酶来阻断依赖能量的过程23,24。此外，它还能.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Alejandro Sánchez Alvarado对本技术的初步优化与开发所提供的支持。Carolyn Adler实验室的工作由康奈尔大学启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二水合氯化钙 (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc 盐溶液 |
| 无水硫酸镁 (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc 盐溶液 |
| 六水合氯化镁 (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc 盐溶液 |
| 氯化钾 (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc 盐溶液 |
| 氯化钠 (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc 盐溶液 |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc 盐溶液 |
| 带龙头可高压灭菌的Nalgene聚丙烯共聚物矮型容器 | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | 储存涡虫用水 |
| Instant Ocean 海盐 | Spectrum Brands | Amazon | 涡虫用水 |
| 硫酸庆大霉素 | Gemini Bio-products | 400-100P | 涡虫用水 |
| 剃须刀片 | Electron Microscopy Sciences | 71970 | 切碎肝脏 |
| 一次性裱花袋 - 16”，12个装 | Wilton | Amazon | 肝组织分装 |
| 5 mL 注射器 | BD/VWR | 309647 | 肝组织分装 |
| 培养皿 - 35 mm / 60 mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| 塑料容器（不同规格） | Ziploc | Amazon | 用于静态培养中饲养涡虫 |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 移液管 | Globe Scientific | 138030 | |
| 镊子 - Dumont 镊子，5号型 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 488 标记物 | ThermoFisher | S11223 | |
| 甘油 | Fisher BioReagents | BP229-1 |
参考文献
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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重印与许可
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