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方法文章

化学切除与地中海涡虫 Schmidtea mediterranea 咽部的再生

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DOI：

10.3791/57168

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2018年3月26日

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, College of Veterinary Medicine, Cornell University

本文内容

摘要

地中海涡虫 Schmidtea mediterranea 是研究干细胞和组织再生的优良模型。本文介绍了一种通过将动物暴露于叠氮化钠化学试剂中，选择性去除咽部这一器官的方法。本方案还概述了监测咽部再生的方法。

摘要

涡虫是一类再生能力极强的扁形动物。这种能力源于其体内大量存在的干细胞，这些干细胞能够迅速响应各种类型的损伤。目前常用的损伤模型会移除大量组织，导致多个器官受损。为了克服这种广泛的组织损伤，本文介绍了一种在地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）中选择性去除单一器官——咽部的方法。该方法通过将涡虫浸泡在含有细胞色素氧化酶抑制剂叠氮化钠的溶液中实现。短时间暴露于叠氮化钠可诱导涡虫咽部外翻，我们称之为"化学性截除”。化学性截除可完全去除整个咽部，并在咽部与肠管连接处形成一个小伤口。经过充分冲洗后，所有被截除咽部的涡虫均能在约一周时间内再生出功能完整的咽部。这一再生过程由身体其他部位的干细胞驱动。本文提供了化学性截除的详细实验方案，并描述了用于评估截除和再生是否成功的组织学及行为学检测方法。

引言

再生是动物界普遍存在的一种现象，其再生能力从某些无脊椎动物的全身再生，到脊椎动物较为有限的再生能力不等1。功能性组织的替换是一个复杂的过程，通常需要同时恢复多种细胞类型。例如，要实现蝾螈肢体的再生，需要重新生成成骨细胞、软骨细胞、神经元、肌肉细胞以及上皮细胞2。这些新生成的细胞类型还必须进行适当的组织排列，以实现肢体功能的重建。要理解这些复杂的过程，需要采用专注于特定细胞类型再生及其在器官中整合的技术。

为简化对再生反应的研究，一种常用策略是靶向消融特定细胞类型或较大范围的组织。例如，在斑马鱼中，特定细胞类型表达硝基还原酶后，经甲硝唑处理即可导致这些细胞被破坏3,4。在果蝇（Drosophila）幼虫中，利用组织特异性启动子驱动促凋亡基因的表达，可选择性地消融成虫盘的特定区域5,6。这两种策略均可引发快速但可控的损伤，已被广泛用于解析介导再生的分子与细胞机制。

在本文中，我们描述了一种选择性消融名为咽部的整个器官的方法，该器官位于涡虫Schmidtea mediterranea体内。涡虫是再生研究的经典模型，以其强大的再生能力而著称，即使极微小的组织碎片也能再生出完整的个体7,8。它们拥有大量异质性的干细胞群体，其中包括多能干细胞和谱系受限的前体细胞9,10,11。这些细胞通过增殖和分化来替换所有缺失的组织，包括咽部、神经系统、消化系统、排泄系统以及肌肉和上皮细胞9,10,12。尽管我们已知这些干细胞能够启动再生过程，但尚不完全清楚驱动它们替换各种不同类型细胞的分子机制。采用可引发精确干细胞反应的明确定义的损伤方法，有助于解析这一复杂过程。

咽部是一个用于摄食的大型圆柱形管道，包含神经元、肌肉、上皮和分泌细胞13,29。在动物腹侧的一个囊状结构中通常隐藏着咽部，当感知到食物存在时，它会通过动物唯一的体孔伸出体外。为了选择性地切除咽部，我们将涡虫浸泡在一种名为叠氮化钠的化学物质中，该物质在C. elegans中常用作麻醉剂14,15,16。其在涡虫中的应用最早由Adler et al.于2014年报道12。暴露于叠氮化钠数分钟内，涡虫便会外翻其咽部，通过轻柔振荡，咽部即可从动物体上脱落。我们将这种咽部完全且选择性的缺失称为"化学切除"。切除后一周，一个功能完整的咽部即可恢复12。由于咽部是摄食所必需的，因此可通过监测摄食行为来评估其功能性的再生。下文将描述化学切除的实验方案，以及咽部再生和摄食行为恢复的评估方法。

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方案

1. 准备

  1. 涡虫培养用水的制备17
    1. 将涡虫维持在1X Montjuïc盐溶液中。为制备涡虫用水，分别用超纯水配制1 M CaCl2、1 M MgSO4、1 M MgCl2、1 M KCl和5 M NaCl的储备液。使用0.2 µm瓶顶滤器过滤除菌，以供长期储存。
      注意： 配制Montjuïc盐溶液时，仅使用超纯去离子水（25 °C时电阻率为18.2 MΩ）。
    2. 为配制1 L的5X盐溶液储备液，将5 mL 1 M CaCl2、5 mL 1 M MgSO4、0.5 mL 1 M MgCl2、0.5 mL 1 M KCl和1.6 mL 5 M NaCl溶液加入900 mL超纯水中。向该溶液中加入0.504 g NaHCO3，搅拌至溶解。用盐酸调节pH至7.0。
    3. 将上述5X储备液用超纯水在无菌容器（如大容量烧瓶，见材料表）中稀释至1X工作浓度。此1X溶液用于维持无性繁殖涡虫。
      注意： 作为Montjuïc盐溶液的替代方案，可使用市售的矿泉水或含商业水族盐混合物（见材料表）的超纯水，浓度为0.5 g/L18。
    4. 为防止静态培养中发生细菌感染19，需在水中添加抗生素维持涡虫。用超纯水配制50 mg/mL的硫酸庆大霉素储备液，并过滤除菌。将硫酸庆大霉素加入动物培养容器中，使其终浓度为50 µg/mL（1:1000稀释）。
  2. 肝脏糊的制备
    1. 涡虫适宜以有机草饲牛肝为食，应购买新鲜肝脏并在24小时内处理。轻轻剥离包裹肝脏的膜性包膜，将肝脏切成约1 cm的立方块，并用刀片刮除并丢弃所有肝静脉和动脉。
    2. 使用绞肉机或食品加工机将肝组织捣碎，然后通过金属网筛过滤。将滤后糊状物装入裱花袋，再分装至注射器或35 mm培养皿中。喂食前轻轻离心以去除气泡。
    3. 将肝脏糊分装后于-80 °C保存，可保存长达一年，使用前解冻。解冻后剩余的肝脏可再冷冻一次，或于4 °C保存不超过24小时。
  3. 动物的维持
    1. 涡虫的体型会根据喂食频率而生长或缩小。每两周（每14天）喂食一次涡虫。对于长期大规模培养，使用不同规格的塑料容器（见材料表）。
    2. 喂食时，使用金属刮勺或塑料移液管将豌豆大小的肝脏糊滴入培养盒中。让动物进食1–2小时。清洁培养盒前移除残余食物。
    3. 若已喂食，每周清洁两次（喂食后立即清洁一次，两天后再清洁一次）；若未喂食，则每周清洁一次。清洁时，小心倾倒出水至塑料烧杯中，同时保留培养盒中的涡虫。用纸巾擦拭培养盒表面，重复擦拭各面直至清洁。
    4. 补充水至培养盒约¾体积，并加入硫酸庆大霉素至终浓度50 µg/mL。将动物存放于暗柜或20 °C培养箱中。
  4. 涡虫的选择
    1. 选择在喂食后5–7天的涡虫。
      注意： 近期喂食（截断前1–2天）的涡虫更难进行咽部截断。喂食后的动物对叠氮化钠也更为敏感。
    2. 选择体长大约为6 mm的涡虫。为估算涡虫大小，使用塑料移液管将其转移至培养皿中。在培养皿下方放置直尺或5 mm × 5 mm方格纸，测量其爬行时的体长。
      注意： 体长小于6 mm的涡虫更难进行截断操作。
  5. 叠氮化钠溶液的制备
    1. 将叠氮化钠粉末溶于涡虫培养用水中，配制成100 mM溶液。
      注意： 叠氮化钠具有毒性，应小心操作。不得将叠氮化钠倒入下水道。使用后应单独收集，作为危险废物处理。

2. 咽部切除术

  1. 将涡虫放入一个直径为35 mm的培养皿中。使用塑料移液管小心地将培养皿中的涡虫培养液全部移除。
    注意： 此规格的培养皿最多可舒适容纳20条长度为6 mm的涡虫。
  2. 将培养皿置于显微镜下，调节放大倍数，以便同时观察多条涡虫（例如 10倍放大）。用100 mM叠氮化钠溶液替换涡虫培养液。
    注意： 对于35 mm的培养皿，约需5 mL叠氮化钠溶液即可。溶液应完全浸没涡虫。根据培养皿大小，必要时调整溶液体积。
  3. 在显微镜下持续观察动物 ，在最初3–4分钟内避免移动培养皿。
  4. 通过显微镜观察咽部外翻过程；咽部将从咽囊中伸出并完全展开（长度约1 mm），如图1B所示。
    注意： 必须等待咽部完全伸展后再进行后续操作。一旦咽部从虫体中伸出，完全伸展过程大约需要1分钟。
  5. 使用塑料移液管向培养皿中各方向喷射液体以搅动涡虫。将涡虫吸入移液管中，并用力将其反复吹打数次。若咽部已完全伸展，这种剧烈的吹打操作将导致咽部脱落。
  6. 或者，使用一对精细镊子（见材料表）沿咽部纵向或横向夹住咽部（如图1C所示）。用镊子夹住咽部后，将涡虫向上提起至液面弯月面处。随着虫体上提，表面张力将使咽部与虫体分离。
    注意： 此方法适用于去除体型较小的涡虫（长度为1–3 mm）的咽部，这些个体在剧烈吹打下难以脱咽。操作时应避免刺伤或损伤虫体其他部位。
  7. 使用移液管将切除咽部的涡虫转移至含有新鲜涡虫培养液的新培养皿中。
  8. 转移后，用涡虫培养液对切除咽部的涡虫进行充分冲洗，彻底更换液体三次。随后将其转移至含有含50 µg/mL庆大霉素的涡虫培养液的新培养皿中。
    注意： 在这三次洗涤过程中，必须完成缓冲液的彻底更换，以确保完全去除叠氮化钠。
  9. 次日，将培养皿中的液体更换为含50 µg/mL庆大霉素的新鲜涡虫培养液。此后每隔一天重复更换一次。

3. 截断后咽部去除的评估

  1. 在显微镜下（10-20倍放大）检查动物，以确定咽部成功移除后是否出现黑色斑点，如图2A所示。
  2. 或者，按照Pearson et al.20描述的方案固定并漂白动物。将动物在4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或荧光标记的链霉亲和素（1 mg/mL，用含0.3% Triton-X的1×磷酸盐缓冲液按1:500稀释）中浸泡过夜。将动物置于载玻片上，封片剂为80%甘油/20% 1×磷酸盐缓冲液，并在荧光体视显微镜下成像（图2B）。
    注意：本文中所有图像均使用配备1.0倍物镜的荧光体视显微镜拍摄。

4. 通过测量摄食行为评估咽部再生

  1. 肝脏的制备
    1. 将所需量的肝脏糊转移至微量离心管或锥形管中。短暂离心以去除气泡。估计肝脏的体积，然后加入相当于其体积1/5的涡虫水，以及相当于总体积2%的红色食用色素。例如，对于1000 µL的肝脏糊，加入200 µL涡虫水和24 µL食用色素。
    2. 使用塑料研杵、移液枪头或金属刮勺充分混匀，直至食用色素在肝组织匀浆中分布均匀。再次短暂离心。肝组织匀浆可在4 °C保存24小时，或分装后于-80 °C冷冻以长期保存。
    3. 若检测不超过25只动物，每皿准备25 µL肝组织匀浆（每只动物约需1 µL肝组织匀浆）。
  2. 喂养动物
    1. 化学切除后第7天，将动物转移至新的培养皿中。若测试10–15只动物，使用直径35 mm的培养皿；若动物数量超过15只，则应使用直径60 mm的培养皿。喂食前约1小时，将动物置于黑暗环境中，避免扰动。
    2. 使用剪刀将P200移液枪枪头的窄端剪去约½ cm，以增大其开口宽度。吸取25 µL红色肝脏糊样物加入培养皿中。
      注意： 修剪末端可使移液粘稠的肝脏组织糊更方便。为防止肝脏组织漂浮在液面，加样时应将枪头接触培养皿底部。
    3. 让动物自由进食30分钟。
    4. 将动物置于白色背景下，或在10-20倍显微镜下观察，记录摄食动物的数量。
    5. 喂食后，从培养皿中取出肝脏并清洗。

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结果

叠氮化钠暴露会破坏涡虫的正常运动能力，导致动物伸展并扭曲蠕动。这些运动迫使咽部从动物腹侧伸出，约在叠氮化钠溶液中处理6分钟后，可见咽部顶端呈现白色突起(图1B-左图)。数分钟后，动物主动收缩，并通过强力将咽部完全推出体外而使其充分伸展(图1B-中图)。叠氮化钠暴露约11分钟后，动物和咽部逐渐松弛。在此阶段，咽部特有的钟形结构清晰可见(图1B-右图)。为便于进行截除操作，需等待咽部完全松弛后再实施。

由于咽部是一团较大且无色素的组织，将其移除后会在截肢动物的背侧出现一个深色斑点 (图2A)。该...

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讨论

本方案描述了一种使用叠氮化钠选择性消融咽部的方法。其他针对涡虫的靶向消融研究曾采用改良手术方法去除感光细胞21，或使用药理学处理消融多巴胺能神经元22。与现有方法相比，化学截除的一个显著优势在于无需进行手术。相较于涡虫身体其他较柔软的部分，咽部具有较为坚硬的结构，这有助于将其从动物体内完全移除。此外，咽部通过一个较小的连接部位（食管）30与肠相连，该连接点使得咽部脱离时产生的伤口比使用较大手术器械造成的伤口更具可重复性。基于其物理特性以及与动物其他部分较小的解剖连接，咽部切除所产生的伤口比其他外科截除手术更为均一。

叠氮化钠的暴露时间对本技术的成功也至关重要。尽管短暂暴露于叠氮化钠不会对涡虫产生不利影响，但长时间暴露则具有毒性，并最终导致动物死亡。已知叠氮化钠通过抑制细胞色素氧化酶来阻断依赖能量的过程23,24。此外，它还能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Alejandro Sánchez Alvarado对本技术的初步优化与开发所提供的支持。Carolyn Adler实验室的工作由康奈尔大学启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二水合氯化钙 (CaCl2)Fisher ChemicalC79-3Montjuïc 盐溶液
无水硫酸镁 (MgSO4)Fisher ChemicalM65-3Montjuïc 盐溶液
六水合氯化镁 (MgCl2)Acros/VWR41341-5000Montjuïc 盐溶液
氯化钾 (KCl)Acros Organics/VWR196770010Montjuïc 盐溶液
氯化钠 (NaCl)Acros Organics/VWR207790050Montjuïc 盐溶液
碳酸氢钠 (NaHCO3)Acros Organics/VWR123360010Montjuïc 盐溶液
带龙头可高压灭菌的Nalgene聚丙烯共聚物矮型容器ThermoFisher Scientific/VWR2324-0015储存涡虫用水
Instant Ocean 海盐Spectrum BrandsAmazon涡虫用水
硫酸庆大霉素Gemini Bio-products400-100P涡虫用水
剃须刀片Electron Microscopy Sciences71970切碎肝脏 
一次性裱花袋 - 16”，12个装WiltonAmazon肝组织分装
5 mL 注射器BD/VWR309647肝组织分装
培养皿 - 35 mm / 60 mmGreiner Bio-One/VWR82050-536/82050-544
塑料容器（不同规格）ZiplocAmazon用于静态培养中饲养涡虫
叠氮化钠SigmaS2002
移液管Globe Scientific138030
镊子 - Dumont 镊子，5号型Electron Microscopy Sciences 72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100SigmaT8787
DAPI ThermoFisher62247
链霉亲和素-Alexa Fluor 488 标记物ThermoFisherS11223
甘油Fisher BioReagentsBP229-1

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