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革兰氏阴性细菌中必需金属的吸收：X射线荧光、放射性同位素与细胞组分分离

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DOI：

10.3791/57169

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2018年2月1日

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1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

本文介绍了一种在天然结合伴侣存在的条件下提取周质过渡金属分子伴侣并利用X射线荧光和放射性金属摄取技术对其底物含量进行生物物理表征的实验方案。

摘要

我们展示了一种可放大的方法，用于分离细菌的周质空间与细胞质。该方法可用于纯化周质蛋白，以进行生物物理表征，并测定底物在周质与细胞质区室之间的转运情况。通过精确控制周质与细胞质分离的时间，实验者能够提取目标蛋白，并对各个区室中的底物进行独立检测，避免区室间交叉污染。经分离提取的蛋白可进一步用于三维结构解析或底物结合特性分析。此外，该方法也可在与放射性示踪剂孵育后进行，以测定总摄取百分比以及示踪剂（从而反映金属转运）在不同细菌区室中的分布情况。使用放射性示踪剂的实验有助于区分生理学底物与人为假象底物，例如由错配金属引起的非特异性结合。

X射线荧光可用于检测样品中是否存在金属掺入，以及测量因生长条件、纯化条件和/或结晶条件变化而引起的金属掺入情况的改变。X射线荧光还可提供每种金属相对丰度的测量结果，可用于确定进行反常X射线散射数据收集时最佳的金属能量吸收峰。放射性金属摄取可作为一种方法，用于验证X射线荧光检测到的底物的生理相关性，并支持新型底物的发现。

引言

在革兰氏阴性细菌中，细胞质内的过渡金属原子库通过内膜ABC（ATP结合盒）转运蛋白的输入作用得以增加和补充，这些转运蛋白可促进金属离子跨内膜的转运。周质空间中的A-1类底物结合蛋白（SBPs）构成一组分子伴侣，可直接结合金属原子，并将其运送通过周质空间，递送至相应的ABC转运蛋白。1其他SBP簇分别负责转运不同底物，例如螯合金属（A-2簇）、碳水化合物（B簇和D-1簇）以及氨基酸（B簇、C簇、F-2簇和F-4簇）；然而，无论底物种类如何，SBP均遵循一种在进化上保守的c型夹状折叠结构2广义上提出的SBP底物转移机制包括c型夹结构经历一系列类似捕蝇草的扭曲构象变化。3通常，A-1类簇SBPs以全型（结合金属）形式被纯化，但由于难以制备无金属的脱辅基（apo）蛋白用于实验，对这类SBPs的研究受到限制4迄今为止，研究apo Cluster A-1 SBPs的策略仅限于定点突变、透析以及使用乙二胺四乙酸（EDTA）螯合剂进行部分变性。5,6,7,8,9,10,11结构数据表明，A-1 类簇SBPs可能并不严格遵循捕蝇草机制。目前文献中尚缺乏制备无配体A-1 类簇SBPs的方法。 体内 使用生理条件下的结合伴侣。

我们首次利用细胞组分分离技术纯化了鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）中属于A-1簇的底物结合蛋白YfeA，该菌是鼠疫的病原体。YfeA在细胞内通过与其生理配对的YfeBCDE ABC转运蛋白相互作用，转化为脱辅基（apo）形式。我们通过能量色散X射线光谱法（EDS，也称为X射线荧光）证实YfeA处于脱辅基状态。此外，我们将细胞组分分离与高灵敏度放射性金属摄取实验相结合，证明了YfeBCDE的功能，从而能够区分金属跨越外膜的摄取与跨越内膜的导入过程。使用放射性示踪剂可检测到皮克/升（pg/L）水平的金属含量，远低于电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）或原子吸收光谱法（AAS）等技术的检测下限，因而可对所研究系统造成最小干扰。此外，上述传统方法通常需要较大的样品体积、额外的后续处理步骤以及更长的分析周期，而放射性示踪实验则无需这些条件。因此，使用放射性示踪剂为监测细胞内金属分布与摄取提供了一种简便且直接的方法。目前尚需确定，采用本方法产生的脱辅基A-1簇SBP是否与当前常用方法制备的脱辅基蛋白在结构观察上具有一致性。

细胞分级分离是一种用于分离细胞区室的成熟方法，其隐含目的是在隔离条件下特异性地检测各组分的内容12。该方法常用于验证分子在细胞周期中的定位，或测定特定区室的活性13。例如，可通过检测不同细胞区室中的金属底物来分析金属转运活性。结合细胞分级分离技术，可区分并比较金属通过外膜的摄取与通过内膜的转移过程，并可对这些过程进行时间序列上的定量测定。在蛋白质纯化过程中，最常见的细胞裂解方法以及可溶性组分与不溶性组分的分离方法包括机械破碎（即研磨、匀浆）、高压均质化（即French高压细胞压碎器、细胞破碎仪）以及超声波频率（i.e., 超声处理）14。使用超声波频率裂解细胞通常适用于小体积样品；然而，超声处理会产生大量热量，可能导致蛋白质变性。为避免产生过多热量，通常采用连续的短脉冲方式进行超声处理，但这种方法耗时较长，且可能意外地将DNA分子降解为较小的片段。此外，制备性和分析性实验可能需要多个昂贵的超声探头，因为每个探头仅适用于一定范围的样品体积。使用高压裂解细胞时，可通过在裂解前冷却French高压细胞压碎器组件，或在低温环境（如冷室）中操作细胞破碎仪，以避免产生过多热量。与超声探头类似，为处理不同体积范围的样品，可能需要购买多套French高压细胞压碎器组件。French高压细胞压碎器组装简便，但操作和清洗不便，设备沉重，且易被高密度样品堵塞。使用超声波频率和高压系统裂解细胞的优点包括高样品回收率、可同时处理多个样品且交叉污染最小化，以及可调节的剪切力，后者可根据不同类型的样品优化裂解条件。通过调节超声频率、脉冲持续时间、活塞压力（磅/平方英寸，psi）以及样品通过压碎器的次数，可实现裂解条件的优化。采用机械破碎法裂解细胞可能是技术上最简单且成本最低的裂解策略。但机械破碎在样品回收方面可能存在挑战，且不适合同时处理多个样品。虽然机械破碎对样品的作用较温和，优于高压或超声波处理，但通量较低，且裂解效率不高。机械破碎、高压均质化和超声波处理的一个重要实验局限性在于，它们会不可控地破坏整个细胞结构，导致裂解后所有水溶性细胞组分混合在一起。此外，不同细胞区室并非同时破裂，因此较早破裂区室的内容物所受破坏作用的时间长于较晚破裂区室的内容物。细胞分级分离则能够在避免使用昂贵设备以及避免样品暴露于剧烈破坏性力的同时，以低成本、技术简便且高效的方式实现基于区室的细胞组分分离。

对于SBP而言，在裂解过程中、下游层析或其他纯化技术之前，导入的底物会被重新引入可能处于脱辅基状态的蛋白质中，从而再生全酶蛋白。在裂解过程中加入EDTA螯合剂会带来额外困难，因为若将金属亲和层析作为蛋白质纯化的第一步，则EDTA会剥离层析树脂上的金属离子，阻碍蛋白质结合15。一种简单且经济的解决方案是通过渗透休克进行细胞分级分离，利用差速离心和常见的实验室试剂，研究者即可精细地提取足量蛋白质用于功能分析。渗透休克分级分离利用两步渗透压变化来分离细胞的不同区室。首先，高渗缓冲液使细胞失水而皱缩；其次，低渗缓冲液使水重新进入细胞，导致细胞膨胀。通过精确控制细胞膨胀的时间，可选择性地裂解外膜（由于进入的水导致渗透压积聚），从而将其内容物释放到缓冲液中。内膜的完整性得以保持，确保胞质内容物保留在球状体中，并可通过离心轻松与周质内容物分离。

YfeA 是一种多特异性结合蛋白（SBP），能够结合铁、锰和锌原子16。所结合金属的相对比例可根据生长过程中添加的金属成分进行调整，并可通过X射线荧光分析进行检测，例如在美国阿贡国家实验室先进光子源（Advanced Photon Source）所提供的此类技术16。X射线荧光技术使研究者能够快速分析多种金属的组成，无需大量样品或适合衍射的晶体，甚至可从蛋白质沉淀物或蛋白质溶液中获取数据。

X射线荧光技术能够快速揭示出意料之外的结果，例如在本案例中，YfeA蛋白的主要底物是锌，而非文献记载的生理底物铁或锰16。在收集X射线散射数据之前使用该技术，可为研究者提供实验设计方面的指导，例如确定应选用哪种金属的能量边（或多个能量边）来进行反常X射线散射数据的采集。X射线荧光不仅可用于确定金属在样品中的相对丰度，还可用于判断某种金属是否缺失，从而提供一种快速区分含脱辅基蛋白（apo蛋白）与全辅基蛋白（holo蛋白）晶体的方法，并能在无需耗时的数据处理的情况下估计金属信号强度。一旦发现具有强金属信号的样品，即可通过多波长反常色散（MAD）扫描确定进行反常X射线散射数据采集时所需使用的精确波长。

本详细实验方案旨在帮助新进实验人员成功进行细胞组分分离，并有效利用同步辐射光束线设备分析总金属含量，从而推进金属结合蛋白的研究。

方案

1. 细菌起始培养（第1天）

  1. 在200 mL斜口烧瓶中，接种含有pYFE3质粒的Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL菌株至30 mL LB（Luria Bertani）培养基中16。
  2. 用移液器和200 µL吸头吸取30 µL浓度为50 mg/mL的氨苄青霉素加入烧瓶中。在37 ˚C、225 rpm条件下振荡培养过夜。

2. 补充M9最低培养基的制备（第2天）

注意：本内容改编自 Amresco 手册。

  1. 按以下步骤制备6 L液体培养基。取一个2 L锥形瓶，加入10.5 g M9最小培养基至1 L超纯H2O中。在121 ˚C下高压灭菌20 min，然后冷却至室温。
  2. 无菌条件下加入以下无菌补充液：每升培养基中加入2 mL/L的1 M MgSO4、10 mL/L的20% w/v葡萄糖、0.1 mL/L的1 M CaCl2和1 mL/L的50 mg/mL氨苄青霉素。此步骤需在生物安全柜中进行，以维持无菌环境。将培养基预热至37 ˚C。

3. 细菌亚培养

  1. 用自动移液器和5 mL吸头吸取5 mL/L过夜培养的起始菌液加入M9最小培养基中。将该子培养物在37℃下以225 rpm持续振荡培养。 ˚C，9 小时。
    注意：在此步骤中，YfeABCDE 通过其天然启动子的自动诱导实现过表达 Y. pestis 启动子
  2. 4°C、4,500 × g 离心 30 分钟收集细胞 ˚C. 在50 mL冰冻的磷酸盐缓冲液（20 mM Na2高通量筛选4 pH 7.6，50 mM NaCl）用移液器和1 mL吸头吹打重悬，于-80℃过夜冷冻 ˚C.

4. 细胞分级分离（第3天）

  1. 在 4 ℃ 解冻重悬液 °在 4°C 下以 4,000 × g 离心 20 分钟，收集细胞沉淀 ˚C. 使用自动移液器和25 mL吸头，将细胞重悬于50 mL预冷的高盐缓冲液（200 mM Tris-HCl pH 8.0，400 mM NaCl，2 mM EDTA）中。将悬液置于冰上孵育20分钟，期间偶尔颠倒混匀。
  2. 在 4°C 下以 4,500 × g 离心 20 分钟，收集细胞沉淀 ˚C. 用移液器和25 mL吸头吸取50 mL预冷的低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0），重悬细胞。将悬液置于冰上孵育20分钟，期间偶尔颠倒混匀。
  3. 在 4 ℃ 条件下，以 4,500 × g 离心 20 分钟，使原生质球沉淀 ˚C. 收集含有上清液的 周质用自动移液器和25 mL吸头将沉淀的球状体重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液（步骤3.2）中，并通过法国压榨细胞破碎仪在1500 psi压力下循环处理三次以裂解细胞。
    注意：使用法国压裂细胞破碎仪操作可能较为不便，其利用液压泵驱动细胞裂解。启动液压泵时需格外小心，确保活塞与破碎仪正确对齐，并使双手远离液压泵。
  4. 在 4 °C 条件下，以 50,000 × g 离心 20 分钟，沉淀细胞碎片 ˚C. 收集含有上清液的 细胞质如有必要，可进一步分离外膜和内膜16.

5. 使用FPLC进行蛋白质纯化

  1. 分离后立即使用 0.45 µm 滤膜装置过滤周质组分。为方便快速过滤，建议使用带螺口的注射器滤器。用 20 mM Tris pH 7.6、0.05% w/v NaN3 的上样缓冲液以 5 mL/min 的流速平衡 5 mL Q 阴离子交换柱。
  2. 将周质滤液以 2 mL/min 的流速加载至预先平衡的 5 mL Q 阴离子交换柱中，所用缓冲液为 20 mM Tris pH 7.6、0.05% w/v NaN3 上样缓冲液。继续用 20 mM Tris pH 7.6、0.05% w/v NaN3 上样缓冲液以 5 mL/min 的流速洗涤 5 mL Q 阴离子交换柱，直至 A280 读数达到基线稳定水平。
  3. 采用线性梯度洗脱法，以 20 mM Tris pH 7.6、0.05% w/v NaN3 和 0–1 M NaCl 溶液在 10 倍柱体积范围内进行洗脱，流速为 5 mL/min。合并含有 A280 峰的组分。无辅基 YfeA 在 200 mM NaCl 至 300 mM NaCl 之间洗脱出来。
  4. 使用离心浓缩装置将洗脱液浓缩至体积约为 5 mL。
  5. 以 20 mM Bis-Tris pH 6.3、50 mM NaCl、0.05% w/v NaN3 的凝胶过滤缓冲液以 2.5 mL/min 的流速平衡 Superdex 200 pg 凝胶过滤柱。
  6. 将浓缩后的阴离子交换洗脱液上样至预先平衡的 Superdex 200 pg 凝胶过滤柱，并以第 5.5 步中的凝胶过滤缓冲液以 2.5 mL/min 的流速进行纯化。合并对应于约 30 千道尔顿（kDa）蛋白质的 A280 峰组分。
    注：以下参考文献为一个示例 FPLC 实验，用于演示本方案17。

6. 蛋白质结晶

  1. 使用离心浓缩器将凝胶过滤洗脱液浓缩至终浓度为 22 mg/mL。
    1. 通过将 A280 读数除以 1.276 mg/mL 来计算蛋白质浓度。该理论消光系数由 ExPASY ProtParam18 预测。
      注意：A280 样品读数为 5.104 AU 时对应 4.000 mg/mL 溶液；5.104 AU ÷ 1.276 mg/mL = 4.00 mg/mL。
  2. 在坐滴或悬滴装置中，用移液器和 10 µL 吸头吸取 1.5 µL 蛋白质与 1.5 µL 30% w/v PEG 4000、50 mM NaCl、20 mM Bis-Tris pH 6.3、0.05% w/v NaN3 混合。
  3. 将结晶液滴在 293 K 条件下孵育 2 至 4 周。
  4. 将晶体在液氮中快速冷冻，以便运送到同步辐射光源设施。

7. X射线荧光（使用GM/CA光束线软件）

  1. 进入 Hutch 选项卡。在 Energy 子标题下将能量设置为 10.0 keV。
  2. 进入 Scan 选项卡。切换至 Interactive 选项卡。安装样品。
  3. 选择 Optimize fluorescence signal。在 Time 子标题下输入 4.00 s。选择 Take fluorescence spectrum。通过 Plot 选项卡查看谱图。

8. 金属能量吸收峰的MAD扫描（使用GM/CA光束线软件）

  1. 将样品移出光束。进入 扫描 选项卡。进入 元素周期表选项卡。选择目标元素的 K-边。
    注意：能量 子标题中的能量值单位为 eV。
  2. 进入 光束线站 选项卡。使用 能量 子标题将能量设置为第 8.1 步中的值（单位为 keV）。
  3. 将样品移入光束。进入 扫描 选项卡。进入 自动 选项卡。在 时间 子标题下输入 2.00 s。
  4. 选择 开始扫描。使用 绘图选项卡查看 MAD 扫描结果。
    注意：峰值 子标题中的能量值单位为 eV，而非 keV。
  5. 选择 荧光测量完成。
  6. 将样品移出光束。进入 光束线站 选项卡。使用能量子标题将能量设置为第 8.4 步中的值，并向上取整至下一个 eV（例如：峰值：9658.3 eV，将 能量 设为 9659 eV）。
  7. 将样品移入光束。采集数据集。对所有目标金属重复执行第 8.1 至 8.6 步。

9. 放射性金属吸收测定的分析方案

  1. 在一支14 mL的培养管中，接种5 mL LB培养基 E. coli 含 pYFE3 质粒的 BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 菌株细胞16加入5 µ50 mg/mL 氨苄青霉素的 L，通过移液器吸取并 10 µL型枪头。在37℃下以225 rpm振荡 ˚7 小时，4 °C
  2. 在室温下，使用台式离心机以15,000 x g离心1分钟，使细胞沉淀。用移液器和1 mL吸头加入1 mL补充M9最低培养基重悬细胞，洗涤一次。重复该步骤一次。
  3. 在50 mL锥形管中，用移液器和1 mL吸头吸取30 mL添加物M9最低培养基，接种细胞进行传代培养。于37℃、225 rpm振荡培养。 ˚9小时，4℃
  4. 确定实现约100,000计数每分钟（cpm）所需的放射性活度。
    注意：具体数值取决于所用放射性同位素及检测仪器。例如，含有 7.4 千贝可（kBq）（0.2 微居里（μCi））的样品µCi)) 的 52Mn在自动γ射线探测器（NaI）上的读数为550,000 cpm。因此，可通过以下公式计算获得100,000 cpm计数所需的放射性活度：(100,000 cpm/550,000 cpm) × 7.4 kBq (0.2 µCi) = 1.35 kBq (0.036 µCi).
    注意：放射性衰变会释放出具有危害性的电离辐射。操作放射性物质时，必须使用适当的屏蔽装置，并遵循合理可行最低限度（ALARA）原则，即通过增加距离和加强屏蔽，同时减少暴露时间，以降低辐射 exposure。仅允许经过培训的人员在专门指定并持有放射性材料使用许可的实验室中操作放射性物质。
  5. 将第9.4步中计算出的所需放射性活度乘以亚培养液的总体积，以确定所需的总放射性活度。加入该量（最好在50 - 100 μL的小体积中） µL）向含有亚培养物的试管中加入，使终浓度为 100,000 cpm/mL，充分涡旋混匀 30 秒。
    注意：对于31 mL的亚培养物，所需的总放射活性为1.35 kBq（0.036 µCi) × 31 mL = 41.3 kBq (1.12 µCi).
  6. 将1 mL的菌种继代培养物（现含有放射性示踪剂）用移液枪和1 mL枪头分装至各1.5 mL离心管中，置于37 ℃˚C 热混仪，以 1 次/秒的频率涡旋振荡 × g. 准备足够数量的试管，以便每项所需检测均有三个重复，并额外准备三个重复作为标准品（将标准品单独放置，不要对标准品进行组分分离检测）。
    注：在1、2和4小时进行检测共需要12支试管。
  7. 孵育后，将离心管在15,000 × g下离心 × g，使用台式离心机离心30秒（最好预冷至4 ˚C）并弃去上清液。
  8. 用移液器和1 mL吸头将细胞重悬于1 mL冰上预冷的高盐缓冲液（步骤4.1）中，并立即置于冰上孵育20分钟。
  9. 再次以15,000离心收集细胞 × g，使用台式离心机离心30秒（最好预冷至4 ˚C）并弃去上清液。
    注意：上清液中含有未结合的游离金属。
  10. 用移液器和1 mL吸头将细胞重悬于冰上预冷的低盐缓冲液（步骤4.2）中，冰浴孵育20分钟。
    注意：此步骤中需通过移液器轻柔地吸取。
  11. 在15,000 × g下离心收集细胞 × g 离心 30 秒，将各上清液收集至新的 1.5 mL 离心管中。每个时间点应有六支离心管。
    注意：上清液含有 周质组分 沉淀物包含膜组分及 细胞质组分我们将沉淀物称为细胞质组分。
  12. 测定各组分（六）中的放射性 每个时间点的试管数），以及第9.6步中预留的标准品。利用标准品中的放射性量来确定最初添加到每个样品中的总放射性量。
  13. 为确定放射性物质在周质中的摄取百分比，使用以下公式：（周质组分的平均每分钟计数 / 标准品的平均每分钟计数）× 100。
  14. 为确定细胞质中放射性物质的摄取百分比，使用以下公式：（细胞质组分的平均每分钟计数 / 标准品的平均每分钟计数）× 100。
  15. 为确定总摄取百分比，使用以下公式：（（周质组分的平均每分钟计数 + 对应胞质组分的平均每分钟计数）/ 标准品的平均每分钟计数）× 100。

结果

SDS-PAGE 凝胶及凝胶过滤层析图谱用于评估从制备型周质组分分离中获得的蛋白质纯化质量。全酶 YfeA 的纯化方法此前已有描述16；然而，尚未有报道关于脱辅基YfeA的纯化。本方法所描述的脱辅基YfeA纯化策略采用一种重组野生型构建体，该构建体不含任何亲和标签，尤其是可用于蛋白质免疫印迹的标签。即， His标签），且目前尚未有报道针对YfeA的单克隆抗体。因此，采用质谱分析来验证YfeA的纯化结果。为通过分级分离纯化YfeA，建议在阴离子交换色谱中使用线性洗脱梯度图1）。线性洗脱梯度显著提高了YfeA的富集效果，根据密度测定法计算，其在周质组分中所占比例约为8%，而在阴离子交换产物中达到49%图1C）。通过凝胶过滤后，纯度提高至61%，且脱辅基蛋白的洗脱体积与全酶蛋白的洗脱体积相同（图2）。质谱分析通过检测到YfeA氨基酸序列的92.5%、总共246个YfeA多肽谱图、24个独特肽段以及50个独特的多肽谱图，验证了YfeA的纯化效果。为对比线性梯度洗脱产物与阶梯梯度洗脱产物的差异，采用阴离子交换法纯化YfeA，先用50 mM NaCl进行洗涤，再用250 mM NaCl进行洗脱（图1D）。根据密度测定法计算，阶梯梯度洗脱使YfeA在周质部分所占比例从17%略微富集至阴离子交换产物中的18%。阶梯梯度洗脱同时也富集了一个蛋白质污染条带，质谱鉴定该条带含有多种组分 E. coli 分子量相近的SBPs。由于HiLoad 26/600 Superdex 200 pg的分辨率有限，且污染性SBPs在分子量和结构上与目标蛋白相似，凝胶过滤仅将YfeA的富集度略微提高至凝胶过滤产物中的20%。若阴离子交换层析无法实现线性洗脱梯度，建议尝试以25–50 mM NaCl为增量进行多步洗涤，以确定去除这些污染物所需的NaCl浓度。

纯化的脱辅基（apo）和全辅基（holo）YfeA 在相同的结晶条件下结晶，但脱辅基与全辅基 YfeA 晶体形态的图像显示两者在晶体生长上存在差异（图3）。除了质谱验证外，通过本方法纯化蛋白所获得的晶体收集的X射线衍射数据（未显示）也证实了 YfeA 的成功纯化与结晶。区室污染程度（细胞质中的锌使周质部分中的脱辅基蛋白转化为全辅基蛋白）可通过采集X射线荧光光谱进行评估（图4）。鉴于锌是重组YfeA结合的主要底物16，X射线荧光光谱可快速区分YfeA样品中是否存在与全辅基YfeA相符的强锌信号（图4A），提示存在交叉污染；或仅存在弱锌信号，提示为脱辅基YfeA且交叉污染极少（图4B）。对M9最低培养基进行ICP-MS分析确认其中过渡金属浓度处于亚微摩尔范围（未显示）；因此，在成功完成组分分离后，仅应检测到极少量的过渡金属。分析性组分分离（图5）可用于测量放射性金属的转运速率并获取功能数据。一项为期60分钟的检测比较了仅表达YfeA、完整YfeABCDE转运系统或不表达任何YfeABCDE组分的E. coli细胞的周质与细胞质组分，揭示了单独表达一种重组蛋白或一个蛋白复合物对金属摄取的影响（图6）。不表达任何重组蛋白的E. coli细胞将约一半添加至培养基中的52Mn转运至细胞质，周质中残留极少。该阴性对照代表内源性锰转运。表达重组YfeA的E. coli细胞将约四分之一的52Mn转运至细胞质，另有约四分之一保留在周质中。锰在周质中的滞留及向细胞质的有限转运表明，在缺乏Yfe转运系统的情况下仅表达YfeA所造成的代谢需求与转运瓶颈。表达重组YfeABCDE转运系统的E. coli细胞则将近100%添加至培养基中的52Mn转运至细胞质，周质中残留极少。细胞质中增强的锰转运能力说明了Yfe转运系统在锰转运过程中的重要作用。

YfeA 富集过程；蛋白质凝胶电泳、纯化步骤及分析图谱
图1. 通过分级分离纯化YfeA。 AYfe 转运蛋白的假想模型。 B. 采用阴离子交换柱线性梯度洗脱法从周质组分中纯化YfeA的SDS-PAGE凝胶图。SDS-PAGE凝胶显示了YfeA（30 kDa）在各纯化步骤中的富集情况。黑色箭头指示YfeA在电泳迁移中的位置。右侧为分子量标准。 (1) 周质组分；(2) Q阴离子交换柱穿流组分；(3) Q阴离子交换柱洗脱峰组分；(4) Superdex 200 pg凝胶过滤柱洗脱峰组分 CYfeA 富集——良好示例。SDS-PAGE 凝胶的图像处理来自 B 通过密度测定法计算 YfeA 的总体富集度，结果显示其在周质组分中占 8%，而在凝胶过滤产物中增至 61%。蓝色框表示用于密度测定计算的 YfeA/总信号。对第 4 泳道中框选条带进行质谱分析，检测到 259/280 个 YfeA 氨基酸，以绿色高亮显示。成熟多肽链中存在的氨基酸以粗体大写黑色文字表示，信号肽被切割部分的氨基酸以斜体小写灰色文字表示。 DYfeA 富集——错误示例。通过阴离子交换层析的阶梯梯度洗脱，从周质组分中纯化 YfeA 的 SDS-PAGE 凝胶图谱。SDS-PAGE 凝胶显示在纯化各步骤中 YfeA 的富集情况。黑色箭头指示在阴离子交换色谱过程中含量增加的主要蛋白污染物的电泳迁移位置。右侧显示分子量标准。（1）Superdex 200 pg 凝胶过滤柱峰组分。（2）Q 阴离子交换柱 250 mM NaCl 阶梯梯度洗脱组分。（3）周质组分。SDS-PAGE 凝胶图像处理自 D 通过密度测定法计算 YfeA 在凝胶过滤产物中的边际总富集量，最高达 20%。蓝色框表示用于密度测定计算的 YfeA/总信号。对第 1 泳道中黑色箭头所指条带进行质谱分析，检测到 LivJ（39 kDa）的 26 个独特肽段、EfeO（41 kDa）的 25 个独特肽段以及 LivK（39 kDa）的 17 个独特肽段。这三种污染物均为周质蛋白 E. coli SBPs 请点击此处以查看此图的放大版本。

凝胶过滤层析图谱；A280 对 Ve；蛋白质分离；全蛋白与脱辅基蛋白对比。
图 2. 脱辅基 YfeA 与全蛋白 YfeA 的凝胶过滤层析图谱。 黑色箭头表示空体积位置。脱辅基 YfeA（黑色曲线）和全蛋白 YfeA（蓝色曲线）的凝胶过滤峰显示两种蛋白状态的洗脱体积相同，表明从周质组分中纯化的脱辅基 YfeA 与经法国压滤机处理后从全细胞组分中纯化的全蛋白 YfeA 具有相似的流体动力学半径。

蛋白质晶体学显微镜图像；全结合型YfeA和脱辅基YfeA晶体，30 µm比例尺。
图3. 脱辅基YfeA与全结合型YfeA的晶体形态。 全结合型YfeA在相同的结晶条件下形成单一晶体，而脱辅基YfeA通常产生孪晶。 请点击此处查看该图的高清版本。

荧光光谱图；发射能量 vs. 计数，显示 Zn、Mn、Fe 峰。
图4. 脱辅基YfeA与全辅基YfeA的X射线荧光光谱。 A. 从M9基本培养基（未额外添加过渡金属）中纯化的全辅基YfeA的X射线荧光光谱，绿色曲线。标注了锰、铁和锌的特征峰。 B. 在YfeBCDE背景下制备的YfeA样品的X射线荧光光谱。标注了锰、铁和锌的特征峰。 蓝色曲线. 在YfeBCDE背景下纯化的YfeA的X射线荧光光谱，成功分离周质组分，胞内过渡金属和/或全辅基YfeA蛋白的污染极少。 红曲线. 在YfeBCDE背景下纯化的YfeA的X射线荧光光谱，因裂解过度导致分离失败，存在大量胞内过渡金属和/或全辅基YfeA蛋白的污染。 请点击此处查看此图的放大版本。

离心分离示意图：缓冲液重悬步骤；上清液收集，周质组分。
图 5. 组分分离的通用工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示 Mn-52 在周质和细胞质中分布的柱状图；条件：无 YfeA、YfeABCDE、YfeA。
图6. 放射性金属摄取60分钟后的组分分析数据。 每个实验重复三次，误差线表示标准偏差。红色柱。不含 Yfe 转运系统的 E. coli 细胞在60分钟后约有 ~50% 的 52Mn 进入细胞质，且周质中 52Mn 水平较低。蓝色柱。含有 Yfe 转运系统的 E. coli 细胞在60分钟后将 >90% 的 52Mn 转运至细胞质，且周质中 52Mn 水平保持较低。绿色柱。仅含有 YfeA 的 E. coli 细胞在60分钟后约有 ~25% 的 52Mn 进入细胞质，同时在周质中保留约 ~25% 的 52Mn。

本研究所用的放射性金属52Mn（半衰期 t1/2 = 5.59 d）由中国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）回旋加速器设施通过质子轰击天然铬（Cr）靶材制备，并按先前报道的方法进行纯化19。注意：52Mn 是一种正电子发射体（β+avg = 242 keV，丰度 29.4%），同时会发射多种高强度的高能γ射线（Eγ = 744.2、935.5、1434.0 keV；强度 I = 90.0%、94.5%、100%）。因此，实验操作必须遵循上述 ALARA 辐射防护原则。所有被标记为放射性废物的物品均应妥善封装、明确标识，并按照既定规程进行处理。

讨论

细胞分级分离是一种用于特异性分析细胞区室内容物的有用工具，也可用于提取金属原子等小分子以及蛋白质等大分子。需要注意的是，细胞分级分离并非一种绝对精确的技术，若在混合/重悬、孵育温度和孵育时间等方面操作不当，容易产生误差。混合不充分可能导致膜裂解程度极低，从而造成可忽略的分级分离效果；在室温下进行分级分离可导致内外膜快速裂解，使胞质成分污染周质空间组分；而过长的孵育时间也可能导致过度裂解，进而引起组分间的交叉污染。为实现高效且相对完全的外膜裂解（同时保持内膜完整性），建议在低渗分级缓冲液中于冰上孵育20分钟。另一个需要考虑的因素是提取方法，剧烈振荡或涡旋混匀可能会影响提取物质量，例如引起蛋白质聚集。建议采用温和的混匀方式，如使用刮勺、倒置混匀或移液器吹打，以保证后续分析所用材料的高质量。通过制备型细胞分级分离进行纯化的效率可能存在差异，如图1所示。在一次实验中，YfeA起始占提取周质蛋白含量的8%（图1C），而在另一次实验中，YfeA起始占比为17%（图1D）。这些差异可能源于多种因素，例如表达条件不同（在培养基中添加EDTA可增强受饥饿调控机制（如Yfe启动子的Fur调控）控制的基因表达）、反复使用冻存的永久菌种以及人为操作误差。与其调整孵育时间，更建议通过放大样品制备规模来提高产量。建议在从周质组分中进行纯化时，采用阴离子交换层析步骤中的线性梯度洗脱方式。阶跃梯度洗脱是一种通过流动相组成离散且突变的方式进行洗脱的策略（即，0 mM NaCl、50 mM NaCl、150 mM NaCl，等等）；而线性梯度洗脱则是通过流动相组成逐步变化的方式进行洗脱（即，0 mM NaCl、5 mM NaCl、10 mM NaCl，等等）。阶跃梯度适用于分离对固定相具有不同亲和力的分子，而线性梯度洗脱则适用于分离对固定相具有相似亲和力的分子。在从富含独特蛋白质种类的细胞区室中纯化无外源亲和标签（用于增强与固定相的结合能力）的目标蛋白时，推荐使用线性梯度洗脱，以分离那些与目标蛋白对固定相亲和力相近的非目标蛋白。通常情况下，每升由内源性Y. pestis启动子驱动YfeA表达的培养物中，可获得1–2 mg纯化的无金属辅基YfeA蛋白。

X射线荧光是一种使研究者能够快速测定样品中金属含量的技术，并揭示可能未被察觉的意外金属掺入情况。尽管在高渗分级缓冲液中加入了EDTA以去除松散结合或游离的金属，但来自周质组分的YfeA仍可能含有部分全蛋白（holo protein）。鉴于金属转运是一个动态过程，全蛋白的存在可能源于尚未将其携带的金属传递给YfeBCDE的YfeA。需要注意的是，X射线荧光仅能测量总金属含量，无法判断金属是否有序排列在晶体晶格中，或是否特异性结合于蛋白质。要确定金属是否有序排列在晶体晶格中和/或特异性结合于蛋白质分子，必须进行X射线散射数据的收集与处理。然而，X射线荧光可用于快速评估样品中的金属污染和/或残留全蛋白的整合情况。同步辐射机时有限，并非总有机会为每个样品制定X射线散射数据收集策略，因此X射线荧光是一种有价值的筛选工具，可用于评估大量晶体并确定应优先进行X射线散射数据收集的样品。此外，X射线荧光还允许对可能无法产生X射线衍射的样品进行数据采集。在采集X射线荧光数据时，有时信号可能非常微弱，导致所得谱图信息不足。为了增强信号强度，无论是用于X射线荧光还是MAD扫描，可考虑延长曝光时间和/或降低X射线束的衰减程度。当确定某个样品需进行X射线散射数据采集时，建议在与X射线荧光及MAD扫描所用区域不同的样品部位进行数据采集，以尽量减少辐射损伤，提高数据采集质量，并最大限度降低反常信号减弱的可能性。

检测放射性示踪剂仅需纳摩尔浓度或更低的物质含量，使用这些示踪剂作为分子追踪工具，为研究细胞过程提供了一种简单且高度敏感的方法。上述放射性金属检测方法可用于测定总金属摄取量、金属在细胞不同区室间的分布以及摄取速率。实际上，每个时间点的数据采集都需要40分钟的细胞分馏；然而，每当达到一个时间点时，细胞会立即被离心沉淀，并在高盐缓冲液中孵育（图5，步骤1）。对培养基、弃去的高盐缓冲液（图5，步骤1）以及周质和胞质组分（图5，步骤3之后）的放射性金属测定结果表明，高盐缓冲液孵育步骤能有效去除在达到时间点并初次离心后仍残留的未结合游离金属。初次离心可去除大部分（高达80%）未结合的游离金属，而高盐缓冲液孵育后的离心步骤则进一步去除了残余的未结合游离金属。预计任何残留的未结合游离金属不会对40分钟分馏期间的金属转运产生显著影响。40分钟分馏过程对细胞内金属转运的影响是数据合理解读时需考虑的另一个因素。整个分馏流程几乎全程在冰上进行，仅在各步骤之间的30秒离心时短暂离开冰浴。金属转运的时间进程实验表明，将细胞维持在4 °C条件下可完全抑制金属转运20,21,22；因此，由于实验全程在冰上操作，预计40分钟的分馏过程不会显著改变周质或胞质中的金属水平，所测得的金属含量应能真实反映细胞在初始离心时对应时间点的状态。

确定不同细胞区室中的相对摄取量有助于解读XFS数据，验证底物的生理特性，并使研究人员能够进一步探究机制的分子细节。例如，在放射性金属摄取实验中引入基因诱变，可直接强化参与底物转运的关键功能残基或分子的作用。放射性金属摄取实验及其分析的优势包括实验周期短、通量高、重复性好，以及能够并行比较不同生长条件和基因构建体的实验。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

数据还在GM/CA@APS处收集，该设施的部分或全部资金来自美国国家癌症研究所（ACB-12002）和美国国家普通医学科学研究所（AGM-12006）的联邦拨款。本研究使用了先进光子源（APS）的资源，先进光子源是美国能源部（DOE）科学办公室下属的用户设施，由阿贡国家实验室根据合同号DE-AC02-06CH11357为能源部科学办公室运行。对先进光子源的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室根据合同号W-31-109-Eng-38提供的支持。

我们感谢阿拉巴马大学伯明翰分校综合癌症中心质谱/蛋白质组学共享平台（P30CA13148-38）在质谱分析方面提供的协助。

C.D.R. 获得阿拉巴马大学伯明翰分校多元、公平与包容办公室资助项目的资助。L.L.R. 获得阿拉巴马大学伯明翰分校放射学系的支持。美国能源部科学办公室同位素项目通过资助编号 DESC0015773 支持了 52Mn 的生产以及 A.V.F.M. 的研究工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
Polyethylene glycol 4000, EMD MilliporeFisherM1097270100
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)FisherBP1760-5
AMRESCO M9 Medium BrothFisherNC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReagentsFisherBP301-100
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)FisherC79-500
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)FisherD16-500
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)FisherS311-100
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)FisherM63-500
Sodium Azide, White PowderFisherBP922I-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)FisherS271-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)FisherS374-500
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)FisherBP153-500
名称公司货号备注
设备
Cryschem PlateHamptonHR3-158
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsFisherUFC903024
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD MembraneFisherSLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pgFisher28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked ColumnsFisher17-1154-01
名称公司货号备注
细胞
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLSFisher230280

参考文献

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革兰氏阴性细菌中必需金属的吸收：X射线荧光、放射性同位素与细胞组分分离
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