大小很重要：Cryptococcus neoformans 荚膜直径的测量

摘要

荚膜多糖是新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的主要毒力因子，其大小与菌株的毒力相关。荚膜直径的测量可用于表型检测以及评估治疗效果。本文介绍了一种标准的荚膜诱导方法，并比较了两种染色和测量荚膜直径的方法。

摘要

多糖荚膜 新型隐球菌 是这种致病性酵母的主要毒力因子，也是被研究最为广泛的因素之一。不同菌株的荚膜大小差异显著，在遭遇应激或营养匮乏条件时能够迅速增大，并且其大小已被证实与菌株的毒力呈正相关。因此，荚膜尺寸备受关注 C. neoformans 研究人员。细胞的生长 C. neoformans 在进行表型检测时，诱导酵母产生荚膜有助于理解不同处理对酵母的影响或菌株间的大小差异。本文介绍一种标准的荚膜诱导方法，并比较两种公认的荚膜染色与直径测量方法：（i）使用印度墨汁（一种负染剂）结合常规光学显微镜观察；（ii）利用荧光染料对细胞壁和荚膜进行共染色，随后采用共聚焦显微镜观察。最后，我们展示如何通过计算机图像分析实现对印度墨汁染色样本的荚膜直径测量自动化。

引言

每年影响约25万人，并导致超过18万人死亡，Cryptococcus neoformans 是一种致病性胞内酵母菌，也是隐球菌病的致病原^1,2,3。受该病影响最严重的是经济落后国家中无法及时获得抗逆转录病毒治疗的HIV阳性患者，他们对这种疾病极为易感^4,5,6。美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据显示，在撒哈拉以南非洲地区，C. neoformans 每年导致的死亡人数超过结核病，且每月致死人数超过有记录以来任何一次埃博拉疫情的总和¹。最常见的感染途径是吸入环境中普遍存在的干燥孢子⁷。当病原体进入肺部后，多种毒力因子共同作用，促进 C. neoformans 在宿主体内的成功定植与扩散。其中，多糖荚膜被认为是该微生物最主要的毒力因子，因为无荚膜菌株不具备致病性⁸。

隐球菌荚膜主要由三种成分构成：葡糖醛酸木甘露聚....

方案

注意：C. neoformans 属于生物安全二级（BSL-2）病原体，研究人员在操作时必须采取适当的防护措施。有关如何安全操作 BSL-2 病原体的详细规程可在疾病控制与预防中心（CDC）网站上查阅，但需特别指出的是，所有接触 C. neoformans 的人员均应接受过病原体操作的正规培训，并始终佩戴适当的一次性个人防护装备（PPE），通常为乳胶或丁腈手套。此外，离心机转子应密封，以防止样本气溶胶化，任何溢出物应立即使用 10% 次氯酸钠溶液进行清理²⁸。

1. 荚膜诱导

注意：除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。

1. 在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤（pH 6.5 ± 0.2）中培养 C. neoformans，于 37 °C 振荡培养至对数生长期（约 18 - 36 小时）。
2. 在 21 °C 下以 870 × g 离心 5 分钟，收集细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
3. 使用血细胞计数板（或自动细胞计数仪）进行细胞计数，并将细胞重悬于杜氏必需最低培养基（DMEM）中，浓度为 2 × 10⁵ 个细胞/2 mL。
4. 为诱导荚膜形成，于 37 °C 及 5% CO₂....

结果

为了说明荚膜诱导、细胞染色、成像及测量技术，我们使用了三种C. neoformans菌株：常见的、特征明确的实验室菌株H99S³⁰，以及两个此前未知荚膜直径的临床分离菌株B18和B52³¹。

使用印度墨水进行荚膜诱导、染色及图像采集的工作流程如图1A所示。图1B展示了三种菌株在诱导前和诱导后的图像。研究人员可通过比较同一培养物中经过荚膜诱导与未诱导的细胞来判断荚膜诱导是否成功。大多数菌株在诱导后通常会明显增大，但某些菌株即使经过诱导仍天然具有较小的荚膜（见图1B中B18的图像）。需要注意的是，如果在诱导前未彻底去除残留的富集培养基，或缺乏CO₂

讨论

几十年来，荚膜一直是真菌学家和临床医生研究的重要焦点 C. neoformans 以及因其作为该病原体主要毒力因子的作用而导致的隐球菌病。利用显微镜测量不同菌株之间及不同培养条件下荚膜大小的差异，可为了解该病原体及其对各种刺激的反应提供重要信息（即，不同的环境条件，潜在的药物治疗方案 等等。) 本文概述了一种诱导荚膜生长的方法 C. neoformans，并比较了两种不同的荚膜染色方案。最后，我们展示了如何使用图像分析软件自动测量印度墨汁染色细胞图像中的荚膜直径，所得结果与人工测量方法相当。

在我们的实验中，将两种临床菌株B18和B52与已知荚膜大小的标准实验室菌株H99S进行了比较¹⁸。两种染色方法均显示，临床菌株B52在所测试的三种菌株中具有最大的荚膜直径。然而，荧光测量结果能够区分荚膜较小的两种菌株之间的差异，而印度墨水法测量则无法实现这一点。两种染色方法的结果具有一致性，表明这两种方法均有效，但使用荧光染色的C. neoformans图像.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>胶囊诱导
C. neoformans 细胞			临床实验室菌株H99S由杜克大学John Perfect博士惠赠。  临床菌株 B18 和 B52 由宾夕法尼亚大学 Greg Bisson 博士惠赠。
酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖肉汤（YPD）	Fisher Scientific	DF0428-17-5
磷酸盐缓冲液（PBS）			在实验室中使用标准配方制备（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄）
含L-谷氨酰胺、不含丙酮酸钠的高糖DMEM	GE生命科学	SH30022.01
6孔板	Falcon	CL5335-5EA
摇床培养箱	赛默飞世尔科技		MaxQ6000
CO2培养箱	Fisher Scientific		Isotemp
离心	赛默飞世尔科技		图例 XTR
<强>染色
微型离心机	赛默飞世尔科技		Legend Micro 21R
印度墨水	Fisher Scientific	14-910-56
荧光增白剂 Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7小鼠抗GXM抗体与Alexa Fluor 488偶联			约翰斯·霍普金斯大学 Arturo Casadevall 博士惠赠
含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS			PBS 为上述（第4行）所列配方，添加1% BSA并过滤除菌。
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-143
玻璃盖玻片	康宁	2855-18	#1.5 厚度
透明指甲油或其他无毒密封剂
<强>图像采集
浸油	Cargille	16484
配备浸油物镜的光学显微镜	Zeiss		蔡司 Axio A1 显微镜，配备 Plan - NEOFLUAR 100 倍油镜物镜（NA 1.30）
光学显微镜相机	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD 相机
配备油浸物镜的共聚焦显微镜	Zeiss		配备 Plan-Apochromat 63X NA 1.4 油浸 DIC M27 物镜的 LSM 700 激光扫描共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜软件	Zen 2009
共聚焦显微镜相机	尼康		尼康Ti-Eclipse倒置显微镜，配备Intensilight落射荧光照明器（Nikon）、CoolSNAP MYO显微成像相机（Photometrics）、尼康Plan Apo 60倍数值孔径1.40油浸物镜及1.5倍放大转换器。
宽场成像软件	尼康 Elements（尼康）
<强>胶囊测量
图像编辑软件	Photoshop（Adobe）
用于手动测量的显微镜软件	Axiovision（卡尔·蔡司）
用于自动测量的图像分析软件	Aivia（DRVision Technologies）
电子表格软件	Excel（Microsoft）