荚膜多糖是新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的主要毒力因子，其大小与菌株的毒力相关。荚膜直径的测量可用于表型检测以及评估治疗效果。本文介绍了一种标准的荚膜诱导方法，并比较了两种染色和测量荚膜直径的方法。
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方法文章
大小很重要：Cryptococcus neoformans 荚膜直径的测量
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
多糖荚膜 新型隐球菌 是这种致病性酵母的主要毒力因子，也是被研究最为广泛的因素之一。不同菌株的荚膜大小差异显著，在遭遇应激或营养匮乏条件时能够迅速增大，并且其大小已被证实与菌株的毒力呈正相关。因此，荚膜尺寸备受关注 C. neoformans 研究人员。细胞的生长 C. neoformans 在进行表型检测时，诱导酵母产生荚膜有助于理解不同处理对酵母的影响或菌株间的大小差异。本文介绍一种标准的荚膜诱导方法，并比较两种公认的荚膜染色与直径测量方法：（i）使用印度墨汁（一种负染剂）结合常规光学显微镜观察；（ii）利用荧光染料对细胞壁和荚膜进行共染色，随后采用共聚焦显微镜观察。最后，我们展示如何通过计算机图像分析实现对印度墨汁染色样本的荚膜直径测量自动化。
引言
每年影响约25万人，并导致超过18万人死亡，Cryptococcus neoformans 是一种致病性胞内酵母菌，也是隐球菌病的致病原1,2,3。受该病影响最严重的是经济落后国家中无法及时获得抗逆转录病毒治疗的HIV阳性患者，他们对这种疾病极为易感4,5,6。美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据显示，在撒哈拉以南非洲地区，C. neoformans 每年导致的死亡人数超过结核病，且每月致死人数超过有记录以来任何一次埃博拉疫情的总和1。最常见的感染途径是吸入环境中普遍存在的干燥孢子7。当病原体进入肺部后，多种毒力因子共同作用，促进 C. neoformans 在宿主体内的成功定植与扩散。其中，多糖荚膜被认为是该微生物最主要的毒力因子，因为无荚膜菌株不具备致病性8。
隐球菌荚膜主要由三种成分构成：葡糖醛酸木甘露聚糖（GXM）、半乳糖木甘露聚糖（GalXM）和甘露蛋白（MPs）9尽管膜蛋白（MPs）只是荚膜中与细胞壁相关的一种相对次要的组分，但其具有免疫原性，可主要促进促炎性免疫反应。9,10相比之下，GXM 和 GalXM 构成了荚膜的主要部分（>90%（重量比），并具有免疫抑制作用11除了其免疫调节作用外，囊膜的快速扩大 体内 形成机械屏障，阻止宿主吞噬细胞摄取（即中性粒细胞和巨噬细胞12。该 C. neoformans 荚膜及其合成过程复杂，但总体而言，荚膜直径的增加与毒力增强相关6,13,14鉴于此，有必要 C. neoformans 使研究人员能够快速、准确地量化胶囊的测量值。
C. neoformans 细胞及其多糖荚膜均为动态结构，会随时间发生改变15。荚膜的密度、大小和组装方式会因宿主环境的变化而发生相应改变16,17,18。已知低铁或营养匮乏、血清暴露、人体生理pH以及升高的CO2水平均可诱导荚膜生长16,18,19,20。此外，研究人员已发现感染过程中荚膜发生结构改变，导致免疫反应性出现显著差异，从而赋予C. neoformans 相对于宿主的优势21,22。这些认识源于对C. neoformans 荚膜结构的多种分析手段。例如，电子显微镜揭示荚膜具有异质性基质，其外层为较通透的结构，内层则为电子致密层23。光散射技术及光镊的应用使研究人员得以进一步阐明其大分子特性24。通过对静态和动态光散射测量结果的分析可知，该多糖荚膜具有复杂的分支结构23。光镊还被用于检测荚膜结构的刚性及其对抗体的反应性24。然而，迄今为止对C. neoformans 荚膜最常采用的分析方法仍是对其大小的测量。
为了量化荚膜大小，研究人员通常采用一种看似简单的测量方法：荚膜的线性直径。使用数字显微镜拍摄经印度墨水或荧光染料染色的多个C. neoformans细胞（通常为数百个）的图像，然后测量每个细胞本体及其周围荚膜的尺寸。收集数据后，通过从整个细胞（细胞本体加荚膜）的直径中减去细胞本体的直径，计算出荚膜的平均直径。到目前为止，这些测量均依赖人工完成。尽管该方法通常较为准确，但对研究人员而言存在明显缺点：大规模数据集的手动分析可能耗时数天甚至数周；此外，由于测量过程依赖人工操作，结果可能受到主观判断和人为误差的影响。
自动化的计算图像分析已成为分子细胞生物学多个研究领域中不可或缺的工具，能够更快且更可靠地分析生物图像25,26,27。为了从通常复杂而庞大的数据集中挖掘定量信息，必须采用精确的图像分析技术。然而，某些测量，特别是对新生隐球菌（C. neoformans）荚膜的测量，一直难以实现自动化。在相差显微镜下，细胞壁与荚膜之间的界面通常呈现为一条暗环，而准确识别该界面仅通过简单的阈值分割往往难以实现。此外，新生隐球菌（C. neoformans）在培养过程中容易发生聚集，因此，要获得准确的测量结果，必须对细胞进行精确的分割。
本项目旨在：（i）展示一种用于新型隐球菌（C. neoformans）荚膜诱导的标准实验方案；（ii）比较和对比印度墨汁染色与荧光染色在荚膜直径测量中的应用；（iii）开发一种简单、基于计算的方法，利用图像分析软件对印度墨汁染色细胞的图像进行荚膜直径测量；以及（iv）评估手动测量与软件自动化测量荚膜直径各自的优点与局限性。我们发现，在两种染色方法中，虽然对细胞壁和荚膜进行荧光标记的方法耗时更长，但在不同实验间获得的结果最为一致。然而，两种方法均能成功区分具有不同荚膜大小的实验室菌株与临床分离的 C. neoformans 菌株。此外，我们实现了对印度墨汁染色图像中荚膜直径的自动化测量，并发现该方法是手动测量荚膜直径的一种可行替代方案。
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方案
注意：C. neoformans 属于生物安全二级（BSL-2）病原体，研究人员在操作时必须采取适当的防护措施。有关如何安全操作 BSL-2 病原体的详细规程可在疾病控制与预防中心（CDC）网站上查阅，但需特别指出的是，所有接触 C. neoformans 的人员均应接受过病原体操作的正规培训，并始终佩戴适当的一次性个人防护装备（PPE），通常为乳胶或丁腈手套。此外，离心机转子应密封，以防止样本气溶胶化，任何溢出物应立即使用 10% 次氯酸钠溶液进行清理28。
1. 荚膜诱导
注意：除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。
- 在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤（pH 6.5 ± 0.2）中培养 C. neoformans，于 37 °C 振荡培养至对数生长期（约 18 - 36 小时）。
- 在 21 °C 下以 870 × g 离心 5 分钟，收集细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
- 使用血细胞计数板（或自动细胞计数仪）进行细胞计数，并将细胞重悬于杜氏必需最低培养基（DMEM）中，浓度为 2 × 105 个细胞/2 mL。
- 为诱导荚膜形成，于 37 °C 及 5% CO2 条件下孵育 18 小时。
注意：培养基中营养物质的缺乏以及 CO2 的存在可促进 C. neoformans 荚膜的生长。 - 孵育结束后，通过离心（同上法）收集细胞，并弃去上清液，仅保留 5–10 µL。同时，为每种待测菌株收集相应的未诱导细胞样本，作为阴性对照。
注意：细胞沉淀量可能非常少，难以观察。吸取上清液时需格外小心。 - 使用印度墨汁（第 2.1 节）或荧光染料（第 2.2 节）进行染色。
2. 染色
- 仅使用印度墨水染色
- 为用印度墨水对酵母进行染色，将沉淀重悬于残留的上清液中，并取约4μL（约一半）细胞悬液与4μL印度墨水滴加至玻璃显微镜载玻片上，轻轻混匀，避免产生气泡。
- 加盖13 mm玻璃盖玻片（#1.5厚度），并用无毒封片剂（透明指甲油）密封边缘，防止样品干燥。
- 仅使用荧光染料染色
- 为用荧光染料对酵母进行染色，将细胞沉淀重悬于50 µL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。
- 在37 °C下，将培养物与等体积的Calcofluor White（CFW）（1 µg/mL）以及与AlexaFluor488（AF488）偶联的荚膜单克隆抗体18B7（见材料表）（10 µg/mL）共同孵育30分钟。
- 孵育后，在21 °C下以870 × g离心5分钟，并吸除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于10 µL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。
- 用移液器吸取8 µL细胞悬液滴加至玻璃显微镜载玻片上。
- 加盖13 mm玻璃盖玻片（#1.5厚度），并用无毒封片剂（透明指甲油）密封边缘，防止样品干燥。
- 同时使用印度墨水和荧光染料染色
- 为更直接比较印度墨水染色与荧光染料染色的效果，可对同一批细胞群体同时使用两种染料进行共染色。具体操作为：首先按照步骤2.2.1–2.2.3，使用荧光标记的荚膜和细胞壁染料对细胞进行孵育。
- 随后，用移液器将等体积（各4 µL）的荧光染色细胞悬液与印度墨水滴加至玻璃载玻片上，轻轻混匀。
- 加盖13 mm玻璃盖玻片（#1.5厚度），并用无毒封片剂（透明指甲油）密封边缘，防止样品干燥。
3. 图像采集/显微镜检查
- 使用印度墨水染色的细胞成像。
- 使用标准光学显微镜（100倍放大倍数）获取图像。
- 每种实验条件下至少成像50个细胞。
注意：每个视野中的细胞数量会有所不同，这是可接受的。然而，应尽量减少细胞重叠，因为重叠的细胞难以测量（无论是手动还是使用自动化软件）。在这些实验中，图像以16位深度采集，曝光时间经过优化，以在最大程度提高图像对比度的同时，尽量减少因细胞微小移动引起的模糊。
- 使用荧光染料染色的细胞成像
- 进行荧光显微镜成像时，打开显微镜成像软件，并为所用荧光染料选择适当的激发和发射波长（CFW使用405 nm光源激发，AF488使用488 nm光源激发）。使用荧光显微镜采集图像。
- 每种实验条件下至少成像50个细胞。
注意：每个视野中的细胞数量会有所不同，这是可接受的。然而，应尽量减少细胞重叠，因为重叠的细胞难以测量（无论是手动还是使用自动化软件）。 - 采集细胞的z轴层扫（z-stack）图像序列，以确保获得每个视野内各个细胞的最大荚膜直径。
- 在显微镜控制软件中，点击"z-stack"栏以打开"z-stack"控制面板，然后在面板左上角选择"First/Last"选项。
- 使用显微镜的微调焦控制，将焦平面调至当前视野中单个酵母细胞及其荚膜最宽处以下的位置，然后点击“Set First”。
- 使用微调焦控制，将焦平面调至同一细胞体及其荚膜最宽处以上的位置，并对当前视野中所有细胞完成对焦后，点击“Set Last”。
- 然后，在“Acquisition”选项卡中点击“Start Experiment”，以采集当前位置的z轴层扫图像。在多个位置重复此过程，直至获得至少50个细胞的z轴层扫图像。
注意：在这些实验中，共聚焦针孔设置为1.0 AU，并在选定位置采集了每层覆盖0.7 µm、共10-20层且具有重叠的z轴序列。AU = 艾里单位（Airy unit）。
- 接下来，使用适当的图像分析软件将每个z轴层扫序列转换为最大强度投影（MIP）。
注意：MIP将堆叠图像每一层面中强度最大的像素投影出来29。生成MIP图像可获得一个二维表示，对应于所捕获三维图像堆栈中细胞及其荚膜的最大直径。
- 同时使用印度墨水和荧光染料染色的细胞成像
- 使用宽场显微镜（40倍放大倍数）或共聚焦显微镜（63倍或100倍放大倍数）采集图像。对于同时使用印度墨水和荧光染料染色的细胞，应使用配备计算机控制载物台和油浸物镜的宽场显微镜进行成像。
注意：所用显微镜应通过成像软件CFW进行控制。CFW荧光通过340-380 nm激发滤光片激发，发射光通过435-485 nm Barrier滤光片检测，并由400 nm二向色镜反射。AF488荧光可通过465-495 nm激发滤光片激发，发射光通过515-555 nm Barrier滤光片检测，并由505 nm二向色镜反射。 - 每种染色方法在每种实验条件下均需至少成像50个细胞。
- 使用宽场显微镜（40倍放大倍数）或共聚焦显微镜（63倍或100倍放大倍数）采集图像。对于同时使用印度墨水和荧光染料染色的细胞，应使用配备计算机控制载物台和油浸物镜的宽场显微镜进行成像。
4. 荚膜的手动测量
- 对于使用印度墨水或荧光染料染色的细胞，使用细胞测量软件手动测量荚膜和细胞直径（参见 材料表）。具体操作为：进入 "文件" > "打开图像" > "测量"，然后使用光标在细胞最宽处画一条直线，以测量整个细胞的总直径。
- 接着再次点击 "测量"，并在细胞体上画一条直线以测量细胞体直径。
注：测量结果将自动保存到对应细胞上。 - 对所有细胞重复此过程（每组至少50个细胞）。
- 测量完成后如需保存图像，点击 "文件" > "另存为"，并为图像命名。
- 选择新测量的文件，并将数据导出至电子表格软件。
- 使用以下公式计算平均荚膜直径：（[总直径] - [细胞体直径]）。
5. 荚膜的自动测量
注意：为实现成功的自动化测量，应使用具有高对比度且聚焦良好的16位图像，并配合适当的图像分析软件（参见材料表）。在对新生隐球菌（C. neoformans）进行荚膜测量成像时，关键是要聚焦于细胞壁与荚膜交界处的暗环，这有助于软件准确地划分出细胞和荚膜的边界。
- 使用适当的图像编辑软件（参见材料表）翻转并复制所有印度墨水染色的细胞图像。具体操作为：点击"文件" > "打开"，导入印度墨水染色图像，然后按"Control" + "I"对图像进行反相。点击"文件" > "另存为"保存反相后的图像。
- 要将原始图像和反相图像导入软件，请点击"文件" > "导入序列" > "加载图像" > "定义序列（手动）" > "维度（通道）" > "导入" > "应用"。
注意：C. neoformans 的细胞体和荚膜可通过软件中包含的特定算法（称为“配方”）进行识别和掩膜。 - 在反相图像上使用“菌落分析仪（荧光）”配方检测并掩膜细胞体，然后点击"应用"。在反相图像中，定义C. neoformans细胞边界的暗环将比周围荚膜更亮。
- 在反相图像上使用“菌落分析仪（荧光）”配方将C. neoformans细胞体与其荚膜分割开来，然后点击"应用"。这将生成一个计数掩膜。通过右键单击标签为"count mask"的选项卡，将此计数掩膜重命名为"Cell Body"。
注意：该配方包含多个图像处理步骤：背景去除、目标检测、目标分离和子集筛选。 - 接下来，在原始图像上使用“细胞增殖”配方检测并掩膜荚膜，然后点击"应用"。这将生成一个计数掩膜。通过右键单击标签为"count mask"的选项卡，将此计数掩膜重命名为"Capsule"。
- 使用“Capsule Partition”配方，在原始图像上创建新掩膜，以将相邻的荚膜彼此分隔。操作方法为：从配方下拉菜单中选择“Capsule Partition”。在Capsule Partition对话框中，为Capsule Region选择已重命名的计数掩膜“Capsule”（5.5）；为Crypto Cells选择已重命名的计数掩膜“Cell Body”（5.4）；为输入通道选择“Original”，并选择“Create Mask for Partitioned Capsule”，然后点击“Apply”。
注意：该配方可生成细胞和荚膜直径（定义为穿过细胞和荚膜中心的最长轴与最短轴的平均值）以及基于检测掩膜的面积测量值。结果数据可在该软件的电子表格标签页下找到。对所有图像重复此过程（每组至少50个细胞）。可根据需要调整配方参数，以优化单个图像的检测，或优化多个图像的批量检测。该配方还可计算其他测量参数，用于全面表征细胞和荚膜的形态。 - 将数据导出至所选的电子表格软件中进行进一步分析。
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结果
为了说明荚膜诱导、细胞染色、成像及测量技术，我们使用了三种C. neoformans菌株：常见的、特征明确的实验室菌株H99S30，以及两个此前未知荚膜直径的临床分离菌株B18和B5231。
使用印度墨水进行荚膜诱导、染色及图像采集的工作流程如图1A所示。图1B展示了三种菌株在诱导前和诱导后的图像。研究人员可通过比较同一培养物中经过荚膜诱导与未诱导的细胞来判断荚膜诱导是否成功。大多数菌株在诱导后通常会明显增大，但某些菌株即使经过诱导仍天然具有较小的荚膜（见图1B中B18的图像）。需要注意的是，如果在诱导前未彻底去除残留的富集培养基，或缺乏CO2
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讨论
几十年来，荚膜一直是真菌学家和临床医生研究的重要焦点 C. neoformans 以及因其作为该病原体主要毒力因子的作用而导致的隐球菌病。利用显微镜测量不同菌株之间及不同培养条件下荚膜大小的差异，可为了解该病原体及其对各种刺激的反应提供重要信息（即，不同的环境条件，潜在的药物治疗方案 等等。) 本文概述了一种诱导荚膜生长的方法 C. neoformans，并比较了两种不同的荚膜染色方案。最后，我们展示了如何使用图像分析软件自动测量印度墨汁染色细胞图像中的荚膜直径，所得结果与人工测量方法相当。
在我们的实验中，将两种临床菌株B18和B52与已知荚膜大小的标准实验室菌株H99S进行了比较18。两种染色方法均显示，临床菌株B52在所测试的三种菌株中具有最大的荚膜直径。然而，荧光测量结果能够区分荚膜较小的两种菌株之间的差异，而印度墨水法测量则无法实现这一点。两种染色方法的结果具有一致性，表明这两种方法均有效，但使用荧光染色的C. neoformans图像...
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披露
作者赖浩贤（Hoyin Lai）是DRVision公司的产品经理，该公司发布了自动化图像分析软件Aivia。
致谢
感谢中田纳西州立大学（MTSU）分子生物科学（MOBI）博士项目和生物系为本研究提供资金支持。该项目还部分获得了MTSU基金会授予D.E.N.的特别项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>胶囊诱导 | |||
| C. neoformans 细胞 | 临床实验室菌株H99S由杜克大学John Perfect博士惠赠。 临床菌株 B18 和 B52 由宾夕法尼亚大学 Greg Bisson 博士惠赠。 | ||
| 酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖肉汤（YPD） | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 在实验室中使用标准配方制备（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄） | ||
| 含L-谷氨酰胺、不含丙酮酸钠的高糖DMEM | GE生命科学 | SH30022.01 | |
| 6孔板 | Falcon | CL5335-5EA | |
| 摇床培养箱 | 赛默飞世尔科技 | MaxQ6000 | |
| CO2培养箱 | Fisher Scientific | Isotemp | |
| 离心 | 赛默飞世尔科技 | 图例 XTR | |
| <强>染色 | |||
| 微型离心机 | 赛默飞世尔科技 | Legend Micro 21R | |
| 印度墨水 | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| 荧光增白剂 Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7小鼠抗GXM抗体与Alexa Fluor 488偶联 | 约翰斯·霍普金斯大学 Arturo Casadevall 博士惠赠 | ||
| 含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS | PBS 为上述（第4行）所列配方，添加1% BSA并过滤除菌。 | ||
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 玻璃盖玻片 | 康宁 | 2855-18 | #1.5 厚度 |
| 透明指甲油或其他无毒密封剂 | |||
| <强>图像采集 | |||
| 浸油 | Cargille | 16484 | |
| 配备浸油物镜的光学显微镜 | Zeiss | 蔡司 Axio A1 显微镜，配备 Plan - NEOFLUAR 100 倍油镜物镜（NA 1.30） | |
| 光学显微镜相机 | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD 相机 | |
| 配备油浸物镜的共聚焦显微镜 | Zeiss | 配备 Plan-Apochromat 63X NA 1.4 油浸 DIC M27 物镜的 LSM 700 激光扫描共聚焦显微镜。 | |
| 共聚焦显微镜软件 | Zen 2009 | ||
| 共聚焦显微镜相机 | 尼康 | 尼康Ti-Eclipse倒置显微镜，配备Intensilight落射荧光照明器（Nikon）、CoolSNAP MYO显微成像相机（Photometrics）、尼康Plan Apo 60倍数值孔径1.40油浸物镜及1.5倍放大转换器。 | |
| 宽场成像软件 | 尼康 Elements（尼康） | ||
| <强>胶囊测量 | |||
| 图像编辑软件 | Photoshop（Adobe） | ||
| 用于手动测量的显微镜软件 | Axiovision（卡尔·蔡司） | ||
| 用于自动测量的图像分析软件 | Aivia（DRVision Technologies） | ||
| 电子表格软件 | Excel（Microsoft） |
参考文献
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