尺寸事项:新生隐球菌中胶囊直径的测定

Summary

多糖胶囊是新生隐球菌的主要毒力因子, 其大小与菌株的毒力密切相关。胶囊直径测量用于表型检测和测量疗效。本文提出了一种标准的胶囊诱导方法, 并比较了两种染色法和测量直径法。

Abstract

新生隐球菌多糖胶囊是致病性酵母的主要毒力因子和最常见的研究领域之一。囊粒大小在菌株间有很大差异, 在引入压力或低养分条件时, 具有快速生长的能力, 与菌株的毒力呈正相关。由于这些原因, 胶囊的大小对C. 隐球菌研究人员非常感兴趣。在表型测试中诱导了C. 隐球菌胶囊的生长, 以帮助了解不同处理方法对酵母的影响以及菌株之间的大小差异。这里我们描述了胶囊诱导的标准方法之一, 并比较了两种被接受的染色和测量胶囊直径的方法: (i) 印度墨水, 一个负的污点, 使用与常规光镜和 (ii) 共染色与荧光染料的细胞壁和胶囊后, 共聚焦显微镜。最后, 我们展示了如何通过计算图像分析来自动测量来自印度墨水染色样品的胶囊直径。

Introduction

每年影响一季度百万人, 每年造成18万以上死亡,新生隐球菌是致病性, 胞内酵母和球菌^1,2,的致病剂³. 受影响最严重的是贫穷国家的艾滋病毒阳性患者, 他们没有现成的抗逆转录病毒疗法, 使他们敏锐地易患疾病^4,5,6。疾病控制中心的数据表明, 在撒哈拉以南非洲地区, 比起在记录中的 ¹上的任何埃博拉病毒爆发, 每年都有更多的人死于肺结核。最常见的接触途径是吸入在环境中常见的干燥孢子⁷。进入肺部后, 有几种致病因素有助于在受感染的个体中获得C. 隐球菌的成功。多糖胶囊被认为是微生物的主要毒力因子, 因为 acapsular 菌株不是毒性的⁸。

隐球菌胶囊由三个主要成分组成: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) 和 mannoproteins (MP....

Protocol

注意: C. 隐球菌是生物安全级别 2 (BSL-2) 病原体, 研究人员必须采取适当的预防措施。有关如何与 BSL-2 病原体安全工作的详细程序, 可在疾病控制中心网站上找到, 但重要的是要注意, 所有接触到C. 隐球菌的人都应该接受适当的训练来处理致病剂应始终佩戴适当的个人防护用品 (PPE), 一般是乳胶或丁腈橡胶手套。此外, 离心机上的转子应密封, 以防止 aerosolization 的样品和任何泄漏清除立即使用10% 漂白剂解决方案²⁸。

1. 胶囊诱导

注: 除非另行注明, 所有步骤均应在室温下进行。

1. 在酵母蛋白胨葡萄糖 (YPD) 汤 (pH 值 6.5 +/-0.2) 中培养C. 隐球菌, 并在37摄氏度孵育, 直到它们处于对数阶段 (约 18-36 h)。
2. 离心细胞在 870 x g为5分钟在21°c 和洗涤三次与磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
3. 使用 hemocytometer (或自动单元格计数器) 在 Dulbecco 最小的基本介质 (DMEM) 中, 在 2 x 10⁵ cells/2 mL 上计数单元格和并用重悬。
4. 诱导胶囊, 孵育在37°c 和 5% CO₂

Results

为了说明胶囊诱导、细胞染色、影像学和测量技术, 我们使用了三株C. 隐球菌:常见的, 特点很好的实验室菌株, H99S³⁰, 和前两个临床分离菌株未知的胶囊直径, B18 和 B52³¹。

使用印度墨水的胶囊感应、染色和图像采集工作流显示在图 1A中。从所有三种菌株中取出的图像在图 1B中显示为预置和后置。研究人员将知道, 如果胶囊诱导是成功的, 通过比较的细胞, 已经经历了胶囊诱导到那些从相同的文化, 没有。明显的大小增加通常是明显的在大多数菌株后诱导, 虽然一些菌株将展出自然小胶囊, 即使在诱导 (见图像的 B18 在图 1B)。应该指出的是, 如果在感应之前.......

Discussion

数十年来, 该胶囊一直是研究的主要焦点, 对 mycologists 和临床医生感兴趣的C. 隐球菌和球菌由于其作用的主要致病因素的病原体。用显微显微镜测量不同生长条件下的胶囊大小差异, 可以提供有关病原体及其对各种刺激的反应的重要信息 (即, 不同的环境条件,潜在的药物治疗,等) 在这里, 我们概述了一种方法, 以诱导生长的胶囊在C. 隐球菌, 并比较了两种不同的胶囊染色协议。最后, 我们展示了如何使用图像分析软件自动测量从印度墨水染色细胞的图像的胶囊直径, 产生的结果, 可比手工测量方法。

在我们的实验中, 我们比较了两个临床菌株, B18 和 B52, 与 H99S, 标准实验室应变的已知胶囊大小¹⁸。两种染色方法均表明, 临床菌株, B52, 有三株最大胶囊直径的检测。然而, 荧光测量的结果能够辨别出两株小胶囊大小的差异, 而印度的墨量测量则不同。这两种染色方法的结果是一致的, 这表明两者都是有效的, 但使用荧光染色的C. 隐球菌的图像可.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胶囊诱导
新型隐球菌细胞			临床实验室菌株 H99S 是杜克大学 John Perfect 博士的一份好意礼物。临床菌株 B18 和 B52 是宾夕法尼亚大学 Greg Bisson 博士的好意礼物。
酵母蛋白胨葡萄糖肉汤 （YPD）	Fisher Scientific	DF0428-17-5
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）			这是在实验室中使用标准配方（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4O、2 mM Kh2PO4O）
DMEM/含 L-谷氨酰胺的高葡萄糖，不含丙酮酸钠	生命科学	SH30022.01
6 孔板	Falcon	CL5335-5EA
振荡培养箱	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 培养箱	Fisher Scientific		Isotemp
离心机	Thermo Scientific		Legend
XTR染色
微量离心机	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
印度墨水	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor 白色	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 小鼠抗 GXM 抗体与 Alexafluor 488			来自 Arturo Casadevall 博士（约翰霍普金斯大学）的善意礼物
含 1% 牛血清白蛋白 （BSA）			的 PBS 与上面列出的配方相同（第 4 行），添加了 1% BSA 并进行了过滤灭菌。
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-143
玻璃盖玻片	康宁	2855-18	#1.5 厚度
透明指甲油或其他无毒密封剂
图像采集
浸油	Cargille	16484
带浸油物镜的光学显微镜	蔡		蔡司Axio A1带平面图 - NEOFLUAR 100x油浸NA 1.30物镜
光学显微镜相机	蔡司		蔡司Axiocam ErCD相机
带油浸物镜的共聚焦显微镜	蔡司		LSM 700激光扫描共聚焦，配备Plan-Apochromat 63X NA 1.4油浸DIC M27物镜。nbsp;
共聚焦显微镜软件	Zen 2009
共聚焦显微镜相机	尼		Nikon Ti-Eclipse，配备 Intensilight 落射荧光照明器（尼康）、CoolSNAP MYO 显微镜相机（光度学）、Plan Apo 60x NA 1.40 油浸物镜（尼康）和 1.5 倍放大倍率转换器。
宽场成像软件	尼康元件 （尼康）
胶囊测量
图像编辑软件	Photoshop（Adobe）
用于手动测量的显微镜软件	Axiovision （Carl Zeiss）
用于自动测量的图像分析软件	Aivia （DRVision技术）
电子表格软件	Excel （Microsoft）