由酶活化的致癌物和药物形成共价DNA加合物 体外 及其测定方法 32P-后标记

摘要

评估环境化学物质和药物经酶促生物活化后生成共价DNA加合物中间体的活性，是癌症发生及其治疗研究中的重要领域。本文描述了化合物活化形成DNA加合物的方法，以及检测和定量这些加合物的技术。

摘要

由具有致癌潜力的化学物质或药物形成的共价DNA加合物，被认为是致癌过程起始阶段最重要的因素之一。这种共价结合被认为是肿瘤发生的根源，目前被视为化学致癌作用的核心教条。本文描述了利用细胞色素P450及其他生物转化酶催化的反应，来研究化学物质或药物被活化为可形成此类DNA加合物的代谢产物的能力。文中提供了分离含有生物转化酶的细胞组分的方法（包括含有细胞色素P450或其他生物转化酶的微粒体和胞质组分，i.e.，过氧化物酶、NADPH:细胞色素P450氧化还原酶、NAD(P)H:醌氧化还原酶或黄嘌呤氧化酶）。此外，还详细描述了利用这些酶对目标化学物质进行代谢活化的方法，以及DNA的提取方法。同时，本文详尽展示了可检测并定量化学物/药物来源DNA加合物的适当方法，i.e.，³²P-后标记技术的不同改良方法，以及使用放射性标记的分析化学物的方法。

引言

异源物质（环境化学物或药物）的代谢分为两个阶段¹。I相和II相代谢的目的是将原本疏水（不溶于水）的化合物转化为更具亲水性（溶于水）的形式，从而易于通过尿液、粪便或汗液排出体外。I相（功能化）反应包括由细胞色素P450酶（P450s, CYPs）、过氧化物酶（例如，环氧化酶，COX）、醛酮还原酶（AKRs）以及微粒体含黄素单加氧酶（FMOs）催化的氧化、还原和羟基化反应。I相还包括由多种还原酶介导的还原反应，例如微粒体NADPH:细胞色素P450还原酶（POR）和胞质NAD(P)H:醌氧化还原酶（NQO1）、黄嘌呤氧化酶（XO）以及醛氧化酶（AO）¹。在第二阶段（结合反应）中，利用I相反应中引入的功能基团与小分子极性物质结合，以进一步增强化合物的极性。参与II相结合反应的酶包括磺基转移酶（SULTs）、N,O-乙酰转移酶（NATs）、甲基转移酶（如儿茶酚-O-甲基转移酶，COMT）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）以及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）¹。然而，将酶归类为I相或II相并非绝对严格，某些酶可被合理地归入任一类中。

P450酶（EC 1.14.14.1）是一类存在于多种生物体中的含血红素蛋白，参与多种化学物质的生物转化过程，催化其转化....

方案

所有动物实验均按照捷克共和国农业部发布的《实验动物护理与使用条例》（311/1997）进行，该条例符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1. 肝微粒体和胞质组分的分离

1. 通过简单的差速离心法（105,000 × g）从小鼠肝脏制备亚细胞组分（富含P450酶的微粒体或富含还原酶或可溶性过氧化物酶的胞质溶胶） g).
   注意：沉淀物和上清液分别作为微粒体和胞质溶胶。
   1. 用 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4），含 150 mM KCl 缓冲液（缓冲液 1）洗涤肝组织样本（1-10 g）两次，缓冲液体积为组织重量的 10 倍 即 10–100 mL）并将组织切成小块（大小约为 2 × 2 mm）。
   2. 在该缓冲液存在下匀浆组织（>3 体积/重量 mL/g）在 4 °C 条件下匀浆 5 分钟，通过滤纸过滤去除未匀浆的组织残渣。将匀浆液在 600 x g 在 4 °C 下离心 10 分钟，将上清液转移至另一离心管中。
   3. 将沉淀重悬于缓冲液1中（每1克组织加入1 mL），重复步骤1.1.3，弃去沉淀。将合并的上清液在15,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。将上清液转移至另一离心管中。
   4. 将上清液在 105,000 x g 4 °C下孵育60分钟。收集上清液（胞....

结果

利用本文所述的酶催化激活（即 P450、过氧化物酶、还原酶）研究化学物质（致癌物/药物）代谢为中间产物并共价结合DNA（形成DNA加合物）的活性，我们得以阐明：（i）抗癌药物ellipticine药理作用的一种新机制（综述见^29,30,31）；（ii）由植物生物碱马兜铃酸引起的两种与上尿路移行细胞癌相关的肾病（马兜铃酸肾病和巴尔干地方性肾病）的病因（综述见^{32,33,34,35,36,37<.......}

讨论

本文介绍了一种广泛适用的方法，用于研究化学物质被生物活化为代谢中间产物的能力，从而导致共价DNA加合物的形成。这一问题至关重要，因为评估环境化学物质或药物经酶促活化生成可形成共价DNA加合物的代谢物的潜力，是癌症发生及其治疗研究中的重要领域。目前认为，致癌物对DNA的修饰是致癌物引发肿瘤发生的中心教条。这一观点已得到多种研究结果的支持，例如以下现象：（i）不同致癌物的致癌特性依赖于其被生物活化为能与DNA中亲核位点发生反应的代谢物；（ii）DNA加合物的水平通常与多种致癌效应相对应；（iii）某些抑癌基因的突变以及多个原癌基因的激活，可能是由具有致癌潜力的化学物质对其修饰所导致。此外，已证实抗癌药物对DNA的共价修饰是这些药物最有效的DNA损伤作用之一，也是其在癌症治疗中得以应用的原因。

有两个关键因素决定了化学物质遗传毒性评估的成功与否， 即 其形成共价DNA加合物的能力，具体包括：（i）发现、解析并表征能够将致癌物/药物活化为亲电性物质进而与DNA亲核位点结合的酶系统效率；（ii）开发并应用最适宜的技术，用于检测和结构表征致癌物/药物-DNA加合物。本研究描述.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris	Sigma-Aldrich	252859
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889
苯酚	罗斯	0032.8
苯酚/氯仿/异戊醇	Roth	A156.1
乙醇	五重	70390-11000
小牛胸腺DNA	Sigma-Aldrich	D4522
NADH	Sigma-Aldrich	N7004
NADP+	Sigma-Aldrich	N5755
NADPH	Sigma-Aldrich	N7505
D-葡萄糖-6-磷酸	Sigma-Aldrich	7647001
D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶	Sigma-Aldrich	G6378
超体	康宁 Gentest	456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
人肝微粒体	康宁 Gentest	452172
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
次黄嘌呤	Sigma-Aldrich	77662
2-羟基嘧啶	Sigma-Aldrich	H56800
乙酸乙酯	Sigma-Aldrich	437549
乙醚	Sigma-Aldrich	179272
来自微球菌的微球菌核酸酶 金黄色葡萄球菌	Sigma-Aldrich	N3755
小牛脾脏磷酸二酯酶，II型	Calbiochem	524711
来自核糖核酸酶 P1 Penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630
N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸	Sigma-Aldrich	163791
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
亚精胺	Sigma-Aldrich	S2626
四丁基氯化铵	Sigma-Aldrich	86870
正丁醇	Sigma-Aldrich	437603
T4多核苷酸激酶	USB Corp	70031Y
[γ-32P]ATP	哈特曼分析有限公司	FP-201
PEI-浸渍纤维素薄层色谱板	Macherey-Nagel	801053
Packard Instant Imager A202400	帕卡德	G120337
Ellipticine	Sigma-Aldrich	285730
3-硝基苯并蒽酮	如参考文献40所示制备（合成）