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由酶活化的致癌物和药物形成共价DNA加合物 体外 及其测定方法 32P-后标记

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DOI：

10.3791/57177

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2018年3月20日

1Department of Biochemistry, Charles University

本文内容

摘要

评估环境化学物质和药物经酶促生物活化后生成共价DNA加合物中间体的活性，是癌症发生及其治疗研究中的重要领域。本文描述了化合物活化形成DNA加合物的方法，以及检测和定量这些加合物的技术。

摘要

由具有致癌潜力的化学物质或药物形成的共价DNA加合物，被认为是致癌过程起始阶段最重要的因素之一。这种共价结合被认为是肿瘤发生的根源，目前被视为化学致癌作用的核心教条。本文描述了利用细胞色素P450及其他生物转化酶催化的反应，来研究化学物质或药物被活化为可形成此类DNA加合物的代谢产物的能力。文中提供了分离含有生物转化酶的细胞组分的方法（包括含有细胞色素P450或其他生物转化酶的微粒体和胞质组分，i.e.，过氧化物酶、NADPH:细胞色素P450氧化还原酶、NAD(P)H:醌氧化还原酶或黄嘌呤氧化酶）。此外，还详细描述了利用这些酶对目标化学物质进行代谢活化的方法，以及DNA的提取方法。同时，本文详尽展示了可检测并定量化学物/药物来源DNA加合物的适当方法，i.e.，32P-后标记技术的不同改良方法，以及使用放射性标记的分析化学物的方法。

引言

异源物质（环境化学物或药物）的代谢分为两个阶段1。I相和II相代谢的目的是将原本疏水（不溶于水）的化合物转化为更具亲水性（溶于水）的形式，从而易于通过尿液、粪便或汗液排出体外。I相（功能化）反应包括由细胞色素P450酶（P450s, CYPs）、过氧化物酶（例如，环氧化酶，COX）、醛酮还原酶（AKRs）以及微粒体含黄素单加氧酶（FMOs）催化的氧化、还原和羟基化反应。I相还包括由多种还原酶介导的还原反应，例如微粒体NADPH:细胞色素P450还原酶（POR）和胞质NAD(P)H:醌氧化还原酶（NQO1）、黄嘌呤氧化酶（XO）以及醛氧化酶（AO）1。在第二阶段（结合反应）中，利用I相反应中引入的功能基团与小分子极性物质结合，以进一步增强化合物的极性。参与II相结合反应的酶包括磺基转移酶（SULTs）、N,O-乙酰转移酶（NATs）、甲基转移酶（如儿茶酚-O-甲基转移酶，COMT）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）以及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）1。然而，将酶归类为I相或II相并非绝对严格，某些酶可被合理地归入任一类中。

P450酶（EC 1.14.14.1）是一类存在于多种生物体中的含血红素蛋白，参与多种化学物质的生物转化过程，催化其转化3,4。P450酶可催化多种底物的羟基化反应，在该反应中，一个双原子氧分子中的一个氧原子被引入异源物质分子中，而另一个氧原子则通过需要两个电子的反应被还原生成水[反应式(1)]3,4：

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

定位于哺乳动物细胞内质网膜上的P450酶（微粒体P450系统）是多酶单加氧酶系统的一部分，该系统还包括NADPH:细胞色素P450还原酶（POR）和细胞色素b5（后者是NADH:细胞色素b5还原酶的作用底物）。普遍接受的理论认为，为P450提供两个必需电子的电子供体是NADPH/POR系统。然而，细胞色素b5也可能作为P450的电子供体，特别是在其反应循环的第二次还原过程中提供电子，此时它与NADH:细胞色素b5还原酶协同发挥作用2,3,4。

哺乳动物利用多种P450酶（例如，属于家族5、8、11、17、19、21、24、26和27的酶）合成有价值的内源性化合物（如类固醇），并用于天然产物的分解代谢2,3。其他哺乳动物CYP酶，如人源CYP1A2、2C9、2C19、2D6和3A4，则负责代谢作为药物使用的外源性化学物质5,6。在药物代谢中最重要的酶是3A亚家族的CYP酶，尤其是CYP3A4。异生物质（如前致癌物和前毒性物质）的转化由人源CYP1A1、1A2、1B1、2A6、2E1和3A4介导2,5。这些CYP酶大多存在于肝脏中（CYP1A1和1B1除外）。然而，CYP酶也在多种肝外器官中表达。当这些酶参与在特定器官中将化学物质（药物）生物活化为反应性中间产物的代谢过程时，其意义可能尤为重大7。多种P450酶可被其底物类化合物诱导表达，但这种情况并非必然发生。

许多P450酶参与化学物质（药物）毒性的过程。它们不仅可将外源性物质转化为去毒代谢产物，还可将其活化为反应性中间体，这些中间体可修饰内源性大分子，使其表现出不同的生物学特性，通常导致毒性效应。DNA、脂质和蛋白质可能成为这些由活化化学物质产生的亲电试剂和自由基修饰的靶标。对于DNA而言，目前已知若干重要基因的响应及其作用机制2,3,4,5。

DNA 的改变可能导致细胞生长失控，这一现象被认为是导致癌变过程发生的主要因素。具有致癌活性的化学物质与 DNA 形成共价加合物，被认为是癌变过程起始阶段中最重要的步骤之一8,9,10,11。已有研究表明，DNA 加合物的形成与肿瘤发生之间存在关联，而 DNA 加合物数量的减少则与化学预防作用相关8,9,10,11,12,13,14。致癌物或药物来源的 DNA 加合物的形成依赖于 DNA 的个别碱基，并受到这些碱基在 DNA 中序列排列的影响。DNA 加合物的修复则取决于其所在位置（转录链或非转录链）以及所修饰的核苷酸序列类型8,11,12,15,16。

本文描述了利用酶催化化学物质（药物）转化的方法，以研究这些物质被活化为可修饰DNA的代谢产物（形成DNA加合物）的潜力。对于共价DNA结合，测试化合物通常需要通过氧化或还原反应进行活化，具体取决于不同的药物。待测化学物质的氧化或还原活化由微粒体亚细胞组分中存在的P450依赖性酶系统介导，或通过微粒体（POR、NADH:细胞色素b5还原酶、P450酶）及细胞胞质亚细胞组分（NQO1、XO、AO、过氧化物酶）中存在的还原酶介导的还原反应实现。随后，活性代谢产物与DNA结合形成DNA加合物。由于氧化和还原反应在多种药物转化为这些活性物质过程中均具有重要作用，本文详细描述了采用氧化/还原酶系统的实验方法。此外，还详细介绍了能够检测并定量这些DNA加合物的适当方法。

建议采用两种独立的方法来确定经酶系统活化的受试化学物是否与DNA结合：32P-后标记技术以及使用放射性标记化合物（例如，3H 或 14C）。在初步筛选中，推荐采用32P-后标记检测法。在实施上述两种方法之前，必须准确定量溶液中的DNA含量。

采用32P-后标记技术，首先通过非放射性化学物质（致癌物/药物）对DNA进行修饰，随后利用酶促水解将修饰后的DNA转化为3´-磷酸脱氧核苷，再在5´-OH位点使用放射性磷（32P）进行额外磷酸化，最后通过色谱法将化学-脱氧核苷加合物与正常（未修饰）脱氧核苷分离17（图1）。经化学化合物修饰的DNA由内切酶、微球菌核酸酶和外切酶的混合物（即脾磷酸二酯酶）进行水解。所得水解产物包含正常（未修饰）和修饰的脱氧核糖核苷3´-单磷酸，将其在pH 9.5条件下与[γ-32P]ATP、载体（非放射性）ATP以及T4-多核苷酸激酶反应，生成5´-32P标记的3´,5´-双磷酸脱氧核苷（图1中的“"标准"程序）。该碱性pH条件可最大限度地抑制T4-多核苷酸激酶在3´位点对脱氧核糖核苷3´-单磷酸的去磷酸化活性。随后通过多向阴离子交换薄层色谱法（TLC），在聚乙烯亚胺（PEI）纤维素板上实现32P标记的加合物与未被化学物质修饰的标记脱氧核苷的分离与分辨（图2）。在第一和第二洗脱步骤（D1和D2方向）中，使用电解质的水溶液将标记的正常（未修饰）脱氧核苷以及[32P]磷酸盐从TLC-PEI-纤维素板的起点洗脱，并转移至贴于TLC板顶部的一小段层析纸上；而因结合了具有疏水性质的化学物质（致癌物/药物-加合物）的脱氧核苷则保留在PEI-纤维素板的起点处，随后在D3和D4方向上使用多种不同的溶剂系统进一步分离（图2）。加合物的定位通过增感屏增强的自显影技术完成；分离后的加合物在X光胶片上呈现为清晰可见的深色斑点。将这些斑点区域从板上剪下，用于液体闪烁计数或切伦科夫计数以定量放射性。目前也已采用一种适配于32P-后标记检测中染色图谱上DNA加合物成像与定量的存储磷屏成像方法18。Instant Imager仪器常被用于此类DNA加合物的检测与定量。该方法对32P的检测灵敏度比增感屏增强自显影技术高出10倍以上19。

DNA加合物的含量通过相对加合物标记值（RAL）来确定，计算公式如下（公式2）：

                                    每分钟计数（cpm）在加合物脱氧核苷酸中
RAL = ----------------------------------------------------------------------------------------- (2)
              32P-ATP 的比活性（单位：cpm/pmol）× 脱氧核苷酸的 pmol 数

RAL值是加合物脱氧核苷酸的计数率与总脱氧核苷酸（包括加合物和正常（未修饰）脱氧核苷酸）计数率的比值20,21。然而，该计算基于加合物与正常脱氧核苷酸标记效率相等的假设22。32P-后标记技术的经典（"标准"）方法适用于多种DNA加合物（包括大体积和/或非大体积加合物），但其灵敏度不足以满意地检测DNA中含量较低的加合物。采用此方法，可检测每107个未修饰脱氧核苷酸中存在的一种加合物（0.3 fmol 加合物/µg DNA）。

已采用多种对该经典32P-后标记方法的改进以提高该技术的灵敏度。通过使用限量的[γ-32P]ATP（增强程序），32P-标记法检测加合物的灵敏度已提高达10至100倍23,24。另一种可提高32P-后标记法灵敏度的程序是将含有加合物的消化DNA与核酸酶P1（来自Penicillium citrinum）21进行孵育（图1）。该酶优先去磷酸化未修饰的脱氧核糖核苷3′-单磷酸盐，而与化学物质结合的脱氧核苷酸（加合核苷酸）基本不作为该酶的底物。因此，去磷酸化的脱氧核糖核苷3′-单磷酸盐（即脱氧核糖核苷）不会被T4多核苷酸激酶利用来自γ-32P]ATP的[32P]磷酸进行再磷酸化。然而，部分化学物质结合的核苷酸（如在脱氧鸟苷C8位取代的芳胺加合物），仍可能被该酶去磷酸化。相反，大多数其他加合物（例如在脱氧鸟苷N2位取代的加合物）则不会被核酸酶P1去磷酸化。这种32P-后标记法的改进显著提高了方法的灵敏度，使其灵敏度提升超过三个数量级。此外，该版本的32P-后标记法允许使用更高量的DNA（5–10 µg）以及过量的无载体[γ-32P]ATP。

另一种由Gupta描述的富集加合物的方法25利用了大体积脱氧核苷酸加合物的理化特性：在相转移试剂四丁基氯化铵（TBA）存在下，这些加合物可在[32P]磷酸盐标记前被萃取至n-丁醇中（图1），而未修饰的脱氧核苷酸则难以被该有机溶剂萃取。然而，一些疏水性较弱的加合物（例如被非芳香性大体积基团或小烷基残基修饰的脱氧核苷酸）无法被n-丁醇有效萃取。因此，当采用这种改良的32P-后标记法进行分析时，这些加合物基本上无法被检测到。

上述两种32P-后标记方法极大地提高了DNA加合物检测的灵敏度和定量能力（可达三个数量级），能够检测每109,10个正常核苷酸中仅有一个加合物（0.3 - 3 amol/µg DNA）。这两种方法推荐用于检测化学物质与DNA发生共价结合的能力，因此本文将对其进行详细描述。

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方案

所有动物实验均按照捷克共和国农业部发布的《实验动物护理与使用条例》（311/1997）进行，该条例符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1. 肝微粒体和胞质组分的分离

  1. 通过简单的差速离心法（105,000 × g）从小鼠肝脏制备亚细胞组分（富含P450酶的微粒体或富含还原酶或可溶性过氧化物酶的胞质溶胶） g).
    注意：沉淀物和上清液分别作为微粒体和胞质溶胶。
    1. 用 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4），含 150 mM KCl 缓冲液（缓冲液 1）洗涤肝组织样本（1-10 g）两次，缓冲液体积为组织重量的 10 倍 即 10–100 mL）并将组织切成小块（大小约为 2 × 2 mm）。
    2. 在该缓冲液存在下匀浆组织（>3 体积/重量 mL/g）在 4 °C 条件下匀浆 5 分钟，通过滤纸过滤去除未匀浆的组织残渣。将匀浆液在 600 x g 在 4 °C 下离心 10 分钟，将上清液转移至另一离心管中。
    3. 将沉淀重悬于缓冲液1中（每1克组织加入1 mL），重复步骤1.1.3，弃去沉淀。将合并的上清液在15,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。将上清液转移至另一离心管中。
    4. 将上清液在 105,000 x g 4 °C下孵育60分钟。收集上清液（胞质溶胶），分装（1–10 mL）后于-80 °C保存。采用Bradford所述方法测定胞质溶胶中的蛋白含量。26.
    5. 将沉淀重悬于100 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中>2 体积/重量 mL/g，于 105,000 × g 离心 g 4 °C下孵育60分钟。弃去上清液。将沉淀物（微粒体）重新悬浮于含150 mM KCl和20%甘油的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中<5 体积/重量 mL/g）在 4 °C 下进行匀浆。将微粒体分装为 0.5–1 mL 等份，于 -80 °C 保存。采用 Bradford 法测定微粒体中的蛋白质含量，对微粒体进行表征。26.
    6. 测定微粒体中细胞色素P450的浓度
      注意：微粒体中P450酶浓度的测定方法参照Omura和Sato所述进行27，测定还原型P450与一氧化碳（CO）复合物的吸收。一氧化碳是一种有毒化合物，必须小心操作，并在通风橱中使用。

2. 在酶系统存在下测试化学品（致癌物/药物）与DNA的孵育

  1. 在含有细胞色素P450的氧化酶系统存在下，将测试化学品（致癌物/药物）与DNA共同孵育
    1. 在4 °C下，配制终体积为0.75 mL的孵育混合物，其中包含以下化合物和酶系统。
      1. 将 100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4，0.375 mL）与 10 mM NADPH 或 NADPH 再生系统（10 mM MgCl₂，0.05 mL）混合2，10 mM D-葡萄糖-6-磷酸，10 mM NADP+，1 U/mL D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）（75 µL）。
      2. 将微粒体或Supersomes中的纯重组P450酶加入该混合物中，Supersomes是转染了含有重组P450酶cDNA的杆状病毒构建体的昆虫细胞所分离得到的微粒体，每50 µL微粒体或Supersomes制备液中含有50 pmol P450酶——可为实验室自提或商品来源的肝微粒体组分。
      3. 加入1 mg小牛胸腺DNA（0.3 mL储存液，浓度为3.3 mg/mL的蒸馏水溶液），并在涡旋振荡器上振荡5秒。
      4. 最后，加入7.5 µL溶于DMSO的0.1 mM测试用ellipticine药物溶液和42.5 µL蒸馏水，使孵育混合物体积达到0.75 mL。使用标有 3H 或 14C 或未标记的化学品，具体取决于DNA加合物的检测方法。
      5. 在涡旋振荡器上振荡5秒。在37 °C下开管孵育30至60分钟。
      6. 同样地，还需准备两个对照孵育组，分别为：(i) 不加激活系统（微粒体样品）；(ii) 加激活系统，但不加受试化合物。
  2. 在还原性酶系统存在下，测试化学品（致癌物/药物）与DNA的孵育
    1. 在4 °C下，配制终体积为0.75 mL的孵育混合物，其中包含以下化合物和酶系统。
      1. 在 4 °C 下，混合以下组分：含 0.2% Tween 20 的 100 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4，0.375 mL）、10 mM 还原型酶 NQO1 辅因子（NADPH）溶液（75 µL）、胞质组分（肝胞质组分——由实验室自行分离，或使用来自个体人供体的商业来源胞质组分，含 1 mg 蛋白质，50 µL）。
      2. 加入1 mg小牛胸腺DNA（0.2 mL储存液，浓度为3.3 mg/mL蒸馏水），在摇床中振荡5秒。
      3. 最后，加入7.5 µL 0.1 mM的待测化合物（溶于蒸馏水、甲醇、乙醇或DMSO，根据化合物的溶解度选择溶剂）和42.5 µL蒸馏水，使孵育混合物体积达到0.75 mL。使用带有标签的化学品 3H 或 14C 或未标记的化学品，具体取决于DNA加合物的检测方法（见下文）。
      4. 用氩气吹扫反应混合物1分钟。在摇床上震荡5秒。于37 °C下在封闭的试管中孵育30至60分钟。
      5. 同样地，还需准备两个对照孵育组，分别为：(i) 不加激活系统（胞质组分）；(ii) 加激活系统，但不加受试化学品。
  3. 用有机溶剂萃取孵育混合物以去除过量的受试化学品
    1. 在带盖试管中，加入等体积的乙酸乙酯（或乙醚或己烷），与孵育混合物混合。在摇床中振荡试管内容物，直至形成乳状液。
    2. 离心（3 分钟）于 1,600 x g 在室温下离心。如果有机相和水相未充分分离，可再次以更长时间或更高离心速度离心。
    3. 用移液器吸除上层有机相。若体积较小（<使用400 µL时，采用配有合适吸头的自动移液器。弃去此有机相。
    4. 重复步骤 2.3.1、2.3.2 和 2.3.3。用氮气流去除残留的有机溶剂（至少需要 5 - 10 分钟）。
  4. 从孵育样品中提取DNA
    1. 使用酚/氯仿从溶液中提取DNA及其乙醇沉淀
      1. 通过以下步骤，使用苯酚、苯酚/氯仿（1:1）和氯仿从DNA溶液中抽提蛋白质，以去除蛋白质并从孵育混合物中分离DNA。
      2. 将孵育混合物与等体积的苯酚或苯酚/氯仿（1:1）加入带盖的Falcon管或Eppendorf管中。充分振荡混合，直至形成乳状液。
      3. 离心（3 分钟）于 1,600 x g 在室温下离心。如果有机相和水相未充分分离，可再次以更长时间或更高离心速度离心。
      4. 用移液器将上层水相转移至新的聚丙烯管中。若体积较小（<使用400 µL时，采用配有合适吸头的自动移液器。将蛋白质界面与有机相一同移除。
      5. 将上层水相与等体积的苯酚和氯仿混合液（1:1）混合。重复步骤 2.4.1.2 至 2.4.1.4。
      6. 将上层水相与等体积的氯仿混合，重复步骤 2.4.1.2 至 2.4.1.4。用 2 倍体积的冷乙醇（-20 °C）沉淀回收 DNA。测定 DNA 溶液的体积。
      7. 通过加入5 M氯化钠，将单价阳离子浓度调整至终浓度0.1 M。剧烈搅拌。加入2倍体积的冷乙醇（-20 °C），充分混匀。置于-20 °C冷却°C
      8. -20 °C 保存，直至 DNA 沉淀。当 DNA 在孵育过程中发生片段化时（例如，通过酶促活化反应过程中产生的氧自由基）或在分离过程中导致DNA片段变小（<1 kb）或DNA含量较少时（<0.1 mg/mL）时，需要延长时间并降温至-70 °C。
      9. 离心（10 分钟）于 1,600 x g 在0 °C下离心。如果DNA浓度较低或以小片段形式存在，再延长离心时间一次（30分钟）。弃去上清液。
      10. 为去除沉淀DNA中可能存在的溶质（或测试化学品的残留痕迹），用70%乙醇和乙醚洗涤DNA。用预冷（-20 °C）的70%乙醇洗涤沉淀的DNA。在1,600 x g条件下离心10分钟。 g 在 0 °C 下离心。弃去上清液。
      11. 重复步骤 2.4.1.10。用冷的（-20 °C）70% 乙醇洗涤沉淀的 DNA。在 1,600 x 转速下离心（10 min） g 在 0 °C 下离心。弃去上清液。
      12. 重复步骤 2.4.1.10。将离心管垂直放置于吸水纸上，以去除残留的上清液。加入 1 mL 乙醚洗涤 DNA 沉淀，以去除分离 DNA 中可能残留的受试化学物。在 1,600 x g 条件下离心（10 min） g 在 0 °C 下离心。弃去上清液。
      13. 将DNA沉淀溶解于适当体积的蒸馏水（或0.15 mM柠檬酸钠和1.5 mM氯化钠溶液）中，通常使用100–400 µL以获得0.5–1 µg/µL的DNA浓度。DNA溶液可在4 °C放置过夜，或在37 °C加热10–30分钟以促进溶解。
      14. 储存前，将DNA分成小份（10–20 µL），因为DNA溶液反复冻融可能导致加合物浓度降低。于-80 °C或更低温度下保存。
        注意：DNA 的分光光度法测定：该方法简单且准确，广泛用于测定纯度较高的样品中 DNA 的含量即，不含大量污染物（如蛋白质、苯酚或其他核酸），通过紫外吸收法对碱基吸收的DNA紫外照射量进行分光光度测定（参见前文所述实验步骤）28.
  5. DNA加合物形成的检测方法
    1. 32P-后标记检测
      注意：DNA水解利用此阶段制备的水解产物，用于加合物（2.5.1.）以及正常（未修饰）脱氧核苷酸（2.5.7.）的分析。
      1. 将微球菌核酸酶（MN）溶于水中，配制成浓度约为450单位（U）/mL的溶液。用蒸馏水透析，并调节浓度至300 U/mL。透析脾磷酸二酯酶（SPD）溶液，并调节浓度至4 U/mL。
      2. 将MN和SPD混合，使终浓度分别为150 mU/µL MN和2.5 mU/µL SPD（MN/SPD溶液）。取含12.5 µg的DNA溶液，在真空浓缩仪中干燥至干。用6.5 µL蒸馏水溶解。
      3. 加入5.0 µL MN/SPD溶液（MN的终浓度为60 mU/µL，SPD的终浓度为1 mU/µL）和1.0 µL消化缓冲液（琥珀酸钠的终浓度为20 mM，CaCl₂的终浓度为1 mM）2 为8 mM）。混合物终体积为12.5 µL。混匀后于37 °C反应3小时。
      4. 移取2.5 µL（转移至另一管）用于未修饰脱氧核苷酸的进一步稀释与分析（2.5.7.）
    2. 核酸酶P1富集步骤
      1. 向剩余的10.0 µL水解产物中加入0.65 µL乙酸钠缓冲液（终浓度为40 mM）、0.65 µL ZnCl₂和0.65 µL NADP⁺（终浓度为0.5 mM）2 溶液（终浓度 0.1 mM）、1.25 µL NP1 溶液（终浓度 0.385 µg/µL）和 0.45 µL 蒸馏水。混合物的终体积为 13 µL。
      2. 在37 °C下反应30分钟，然后加入3 µL Tris溶液终止反应。
    3. n- 丁醇富集步骤
      1. 向剩余的10.0 µL DNA水解物中加入215 µL 11.6 mM甲酸铵溶液（pH 3.5）和25 µL 10 mM四丁基氯化铵（TBA chloride）溶液，用250 µL进行萃取 n-丁醇（水饱和）通过剧烈混合。在1,600 x g下离心3分钟。 g 分离各层，并移除上层 n-丁醇层。再用250 µL提取一次 n-丁醇（水饱和），离心，取上层 n-丁醇层，并与先前的提取液合并。
      2. 加入400 µL（饱和于水中的） n-丁醇)加入此提取物中，剧烈混合。离心分离各层后弃去下层水相。使用400 µL水（饱和有 n-丁醇）。向其中加入3 µL 250 mM Tris-HCl溶液（pH 9.5）。 n正丁醇层。蒸发 n在室温下用旋转蒸发仪将正丁醇蒸干。
      3. 将残留物溶于100 µL中 n-丁醇，再次蒸发至干燥，将残余物溶解于16.0 µL水中。
    4. 加合物的标记
      1. 加入1 µL双(2-羟乙基)亚氨基三乙酸（bicine）缓冲液（标记缓冲液）和4.5 µL含有100 µCi [γ-32P]ATP、45 pmol 冷 ATP 和 10.0 U T4-PNK（T4 多核苷酸激酶）加入至来自 NP1 或丁醇富集混合物的 16.0 µL 溶液中。试剂的最终浓度如下：20 mM bicine、10 mM MgCl₂2，10 mM 二硫苏糖醇，0.5 mM 亚精胺，0.5 U/µL T4 多核苷酸激酶，3 µM ATP。混合物总体积为 20 µL。
      2. 室温下反应30分钟。将整个样品（即. 20 µL）点样于PEI-纤维素TLC板上（2.5.6.).
    5. NP1 或其疗效的评估 n 正丁醇增强程序
      1. 用50 µL水清洗管底，剧烈混匀30秒，然后在1,600 x g下离心1分钟 g 在离心机中离心以确认盖子无污染。取5 µL点样于PEI-纤维素薄层层析板（20 x 20 cm）上。使用含280 mM (NH₄)₂SO₄的溶液进行层析4)2SO4 和 50 mM NaH2PO4，pH 6.8。
    6. 加合脱氧核苷酸的薄层色谱分离
      1. 用蒸馏水预清洗薄层色谱板。此步骤尤其推荐用于自制板。
        注意：此洗涤步骤旨在去除平板上的黄色，该颜色可能导致背景升高，尤其是在溶剂前沿处。
      2. 将整个样品点样至PEI-纤维素TLC板上，开始层析2.5.4.）；通过在D1和D2方向展开薄层板来完成加合物的纯化（图2).
      3. 在 D1 方向上展开平板（图2）。使用1.7 M磷酸钠缓冲液（pH 6.8），以确保DNA加合物位于薄层色谱板的起始位置。同样地，使用该缓冲液在D2方向展开色谱板。有关该步骤可能使用的缓冲液信息，请参见用于分离多种类型加合物的溶液说明20,28.
        注意：可以省略在 D2 方向上展开平板的步骤。
      4. 层析后，将板在两个连续的去离子水浴中各洗涤约5分钟。随后，将板干燥。
      5. 使用含 8.5 M 尿素的 3.5 M 甲酸锂缓冲液（pH 3.5）沿 D3 方向展开平板，使用含 0.8 M LiCl 和 8.5 M 尿素的 0.5 M Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）沿 D4 方向展开平板（图2）。必须调整溶剂以使加合物斑点在薄层色谱板上得到良好展开。有关D3和D4展开步骤中可能使用的缓冲液信息，请参见针对多种类型加合物分离所描述的溶液。23,24,25,28.
      6. 为避免D4方向上出现任何问题，在D4方向展层并用水洗涤后，将板沿D4方向在1.7 M磷酸钠（pH 6.0）中继续展层（通常称为D5方向展层），直至展层至滤纸条（12 × 11.5 cm）顶端。
        注意：D5 步骤也可省略。在此情况下，当溶剂前沿到达薄层色谱板顶端时，需打开薄层色谱展开槽，并继续展开最多 60 分钟。该方法比添加灯芯（许多实验室常用于消除 D4 步骤中各类问题的方法）更为有效。
    7. 水解后正常（未修饰）脱氧核苷酸的定量
      1. 稀释一份水解产物（来自 2.5.1. 描述DNA水解）用蒸馏水，（即，取消化混合液 2.5 µL 来自 2.5.1. 调整至250 µL，取10 µL该溶液再调整至150 µL。
      2. 取 5 µL 该消化产物（含 10 pmol 正常脱氧核苷酸），加入 2.5 µL 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 9.0），并按如下方法进行标记 2.5.4. （混合物的终体积为10 µL）。室温下反应30分钟。
      3. 取4 µL混合物，用10 mM Tris-HCl（pH 9.0）稀释至750 µL。混匀后离心，确认管盖无污染。取5 µL点样于PEI-纤维素薄层色谱板上。将薄层色谱板置于含280 mM (NH₄)₂SO₄的溶液中展开4)2SO4 和 50 mM NaH2PO4，pH 6.5。薄层色谱后晾干。
      4. 使用在室温下进行约45分钟的放射自显影技术来定位四种未修饰的脱氧核苷二磷酸。切割相应斑点，通过液体闪烁或切伦科夫计数进行定量。
    8. 相对加合物标记率（RAL）的计算
      1. 测定加合物斑点中的计数值以及标记的未修饰（正常）脱氧核苷酸等分试样中的计数值。
        注意：后者需在比前者少180,000计数的材料上确定，该数值是用于评估加合物水平相对加合物水平（RAL）时，对未修饰（正常）脱氧核苷酸计数所应用的转换系数。DNA加合物的RAL根据上述公式（2）计算。
    9. 使用放射性标记药物检测受试致癌物或药物与DNA的结合
      1. 评估 3H 或 14通过液体闪烁计数法测定化学修饰DNA的C放射性。
      2. 向闪烁瓶中的3 mL闪烁液中加入10–50 µL DNA溶液，充分混匀。使用闪烁计数器测定放射活性。

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结果

利用本文所述的酶催化激活（即 P450、过氧化物酶、还原酶）研究化学物质（致癌物/药物）代谢为中间产物并共价结合DNA（形成DNA加合物）的活性，我们得以阐明：（i）抗癌药物ellipticine药理作用的一种新机制（综述见29,30,31）；（ii）由植物生物碱马兜铃酸引起的两种与上尿路移行细胞癌相关的肾病（马兜铃酸肾病和巴尔干地方性肾病）的病因（综述见32,33,34,35,36,37<...

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讨论

本文介绍了一种广泛适用的方法，用于研究化学物质被生物活化为代谢中间产物的能力，从而导致共价DNA加合物的形成。这一问题至关重要，因为评估环境化学物质或药物经酶促活化生成可形成共价DNA加合物的代谢物的潜力，是癌症发生及其治疗研究中的重要领域。目前认为，致癌物对DNA的修饰是致癌物引发肿瘤发生的中心教条。这一观点已得到多种研究结果的支持，例如以下现象：（i）不同致癌物的致癌特性依赖于其被生物活化为能与DNA中亲核位点发生反应的代谢物；（ii）DNA加合物的水平通常与多种致癌效应相对应；（iii）某些抑癌基因的突变以及多个原癌基因的激活，可能是由具有致癌潜力的化学物质对其修饰所导致。此外，已证实抗癌药物对DNA的共价修饰是这些药物最有效的DNA损伤作用之一，也是其在癌症治疗中得以应用的原因。

有两个关键因素决定了化学物质遗传毒性评估的成功与否， 即 其形成共价DNA加合物的能力，具体包括：（i）发现、解析并表征能够将致癌物/药物活化为亲电性物质进而与DNA亲核位点结合的酶系统效率；（ii）开发并应用最适宜的技术，用于检测和结构表征致癌物/药物-DNA加合物。本研究描述...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由捷克科学基金会（GACR，资助号 17-12816S）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TrisSigma-Aldrich252859
氯化钾Sigma-AldrichP9541
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
苯酚罗斯0032.8
苯酚/氯仿/异戊醇RothA156.1
乙醇五重70390-11000
小牛胸腺DNASigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-葡萄糖-6-磷酸Sigma-Aldrich7647001
D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Sigma-AldrichG6378
超体康宁 Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
人肝微粒体康宁 Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
次黄嘌呤Sigma-Aldrich77662
2-羟基嘧啶Sigma-AldrichH56800
乙酸乙酯Sigma-Aldrich437549
乙醚Sigma-Aldrich179272
来自微球菌的微球菌核酸酶 金黄色葡萄球菌Sigma-AldrichN3755
小牛脾脏磷酸二酯酶，II型Calbiochem524711
来自核糖核酸酶 P1 Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸Sigma-Aldrich163791
DL-二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
亚精胺Sigma-AldrichS2626
四丁基氯化铵Sigma-Aldrich86870
正丁醇Sigma-Aldrich437603
T4多核苷酸激酶USB Corp70031Y
[γ-32P]ATP哈特曼分析有限公司FP-201
PEI-浸渍纤维素薄层色谱板Macherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400帕卡德G120337
EllipticineSigma-Aldrich285730
3-硝基苯并蒽酮如参考文献40所示制备（合成）

参考文献

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P450 32P DNA DNA

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