我们提出了一种基于骨外边界的二维和三维图像小梁骨分割与定量分析工作流程，该方法利用ImageJ插件实现。与当前手动勾画轮廓的方法相比，此方法更高效、更准确，并可提供逐层定量结果，而现有商业软件尚不具备此功能。
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摘要
摘要
微型计算机断层扫描（micro-CT）常规用于评估不同骨量流失条件下小动物的骨量及骨小梁微观结构特性。然而，目前对 micro-CT 图像中骨小梁进行分析的标准方法是逐层半自动手动勾画轮廓，该方法劳动强度大且易引入误差。本文介绍一种根据骨组织外边界自动分割骨小梁的高效方法，当设定合适的分割参数时，可准确实现骨小梁的自动识别与分割，减少操作者主观偏差。为优化理想的分割参数，该方法可显示一系列分割结果的图像堆栈，依次逐个改变所有可能的参数组合，便于直观地逐项查看对应参数下的分割结果。作为插件的质量控制功能，系统可对模拟的标准物体进行量化，其测量值可与理论值进行比较。该插件可逐层报告骨小梁结构参数及骨小梁厚度的量化结果，并可便捷地分析这些参数在选定区域内的分布情况。尽管逐层量化能够保留更多关于骨小梁的信息，并有助于对结构变化进行进一步的统计分析，但目前商用软件的输出结果尚无法提供此类数据，仅能为每个样本的每个参数提供单一的量化数值。因此，本文所述的工作流程是更准确、高效分析骨小梁的优选方法。
引言
在不同骨丢失条件下，利用显微CT分析小动物松质骨的形态学变化是目前的标准方法1,2,3，该方法会报告多个与骨结构相关的变量4。然而，这些参数在长骨的干骺端分布并不均匀5，而目前商用的显微CT设备仅能为每个样本的每个结构变量提供一个汇总值或平均值6,7，单一数值无法充分反映分析区域内测量参数的特征。对松质骨进行逐层定量分析不仅能够为每个变量保留更多信息，还能实现这些变量在分析区域内的分布轮廓绘制，有助于在不同条件下对结构变化进行后续统计分析5。因此，本方法的目标是在每一图像切片层面实现对显微CT扫描中松质骨的定量分析，而目前任何 commercially available 的显微CT分析软件包均不具备此功能。
为了高效地逐层分割小梁骨，理想的方案是采用自动分割方法。然而，目前微计算机断层扫描（micro-CT）分析的标准技术仍依赖于手动交互式勾画轮廓，随后通过半自动插值将小梁骨与皮质骨部分分离开来，这种方法劳动强度大、易出错，并且存在显著的操作者偏差8,9,10。已有研究报道了自动分割方法11,12，但这些方法仅在小梁骨与皮质骨之间具有清晰分界区域时效果最佳，而在缺乏明确分界的区域则表现不佳。此外，不同样本需要设置不同的分割参数12，即使在所有相关参数设定后分割过程可自动进行，仍需通过尝试多种参数组合来手动选择适用于一组骨样本的满意参数，这一过程十分繁琐12。由于骨组织外边界与扫描背景之间的对比度最高，且长骨干骺端的皮质壳在选定的分析区域内变化较小，因此基于长骨外边界轮廓的分割方法能够可靠且准确地将小梁骨与皮质壳分离开。该分割方法的优势在于，其分割依据是背景与骨组织外边界之间的差异，而非小梁骨与皮质骨之间的差异6,12,13，因此通常较容易找到一组适用于多个骨样本的满意分割参数组合，从而促进对不同组间小梁骨变化的更可靠分析。
在每个切片层面，二维（2D）分析会报告面积、周长和二维厚度，而三维（3D）定量则报告体积、表面积和三维厚度。此类信息通常未被当前的图像分析工具所提供，表明所报告的方法可应用于需要获取此类信息的常规图像。
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方案
涉及动物受试者的实验程序均依照《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物，第8版，2011年）进行，并已通过武汉大学机构动物护理与使用委员会的审查和批准。
1. 软件安装
- 安装 ImageJ 软件。从 https://imagej.nih.gov/ij/ 下载包含 64 位 Java 的 ImageJ（版本 1.51p）Windows 版本软件。将下载的软件解压到一个文件夹中，该文件夹后续将被称为 "ImageJ Directory"。
注意：小梁分析插件需要 64 位 Java 运行环境（版本 1.8）和 64 位 Windows 操作系统，建议使用 64 位 Windows 7 操作系统。 - 安装小梁分析插件。从 http://www.bomomics.com 申请小梁分析插件，并将解压后的内容复制到 ImageJ 的插件目录中，即 "ImageJ Directory/plugins"。
注意：该插件可获取免费版本，其中仅报告 5 个指定相邻切片的测量结果；也可获取商业版本，允许指定并测量一系列切片。
2. 为小梁分析准备3D数据集
- 按照标准扫描方案，使用微型CT仪器扫描大鼠股骨5 然后将数据保存为可导入 ImageJ 的格式， 例如，tiff 格式。若多个骨样本在单个样本管中同时扫描，首先将数据导入 ImageJ，然后使用 ImageJ 的图像处理工具通过裁剪去除其他样本，从而分离各个骨样本。随后，将处理后的图像保存为可再次导入 ImageJ 的格式。
注意：分析中使用的代表性样本图像文件已包含在内（补充文件 1). - 模拟标准的二维和三维物体。
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，单击 圆 按钮，在弹出窗口中输入直径为 200，然后单击 好的 生成直径为200像素的模拟圆（图3B将生成的圆形图像以 TIFF 格式保存。
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，点击 方形 按钮，并在弹出窗口中输入 200 作为边长，然后单击 好的 生成边长为200像素的模拟正方形（图3B）。将生成的方块图以 TIFF 格式保存。
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，点击 矩形 按钮，在弹出窗口中将宽度设为 200，高度设为 100，然后单击 好的 生成一个宽度为200像素、高度为100像素的模拟矩形（图3B）。将生成的矩形以 TIFF 格式保存。
注意：一个圆形（直径：200 像素）、一个正方形（边长：200 像素）和一个矩形（宽度：200 像素；高度：100 像素）将被保存用于后续分析。 - 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，点击 立方体 按钮，并在弹出窗口中输入 30 作为边长，然后单击 好的 生成模拟立方体。最后，单击 插件 | 3D | 体数据查看器 查看生成的立方体并以 TIFF 格式保存（图3C).
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，点击 立方体 按钮，在弹出窗口中输入长度为80，宽度为40，高度为30，然后单击 好的 以生成模拟的长方体。最后，单击 插件 | 3D | 体数据查看器 以查看生成的长方体并将其保存为 tiff 格式（图3C).
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，点击 球体 按钮，并在弹出窗口中输入直径为30，然后单击 好的 以生成模拟球体。最后，单击 插件 | 3D | 体数据查看器 以查看生成的球体并将其保存为 TIFF 格式（图3C).
- 打开 ImageJ 软件。在 插件 | BoMomics | 模拟对象 菜单，单击 圆柱体 按钮，在弹出窗口中输入直径为30、高度为100，然后单击 好的 以生成模拟圆柱体。最后，单击 插件 | 3D | 体数据查看器 查看生成的圆柱体并以 TIFF 格式保存（图3C).
注意：一个球体（直径：30像素）、一个立方体（边长：30像素）、一个长方体（长：80像素；宽：40像素；高：30像素）和一个圆柱体（直径：30像素；高：100像素）将被保存用于后续分析。
3. 分析参数的表征
- 打开 ImageJ 软件，并打开或导入一张扫描图像。
- 滑动底部滚动条选择一个切片，然后点击 图像 | 调整 | 阈值 按钮。在弹出的“阈值”窗口中，通过目视检查手动调整最小和最大阈值，确保骨骼与背景充分分离，并将最小阈值记录为皮质骨阈值。
注意：由于不同的微型CT设备在存储X射线衰减系数时使用不同的缩放因子，实际阈值应通过目视检查或遵循特定制造商的建议经验性地确定。在我们的实践中，将微型CT设备生成的ISQ文件的最小阈值设为6,000–7,000，可可靠地将骨骼与扫描背景分离。 - 点击 插件 | BoMomics | Trab Param Profiling 按钮。在弹出的窗口中，将 切片索引 设置为代表性切片的位置，并设置用于计算一组皮质骨阈值以进行参数分析的皮质骨（"Cort Bone"）、范围（"Range"）和步长（"Step"）值，其中皮质骨阈值由步骤3.2获得（图1）。对于大多数微型CT图像，默认的范围和步长值（2,000和400）均可适用。对于示例数据集，将 切片索引 设为5，其余设置保持默认值。
注意："Cort Bone" 是皮质骨的阈值，用于参数分析的阈值从最低阈值到最高阈值以“步长”值递增变化，其中最低阈值为 Cort Bone - Range，最高阈值为 Cort Bone + Range。如果 Cort Bone、Range 和 Step 的设定值分别为6,000、1,000和500，则皮质骨的最低阈值为6,000-1,000=5,000，最高阈值为6,000+1,000=7,000，分析中使用的阈值为5,000、5,500、6,000、6,500和7,000。 - 设置噪声直径（"Noise Dia."）、步长（"Step"）和范围（"Range"）值，以指定分析中使用的一组噪声值；同时设置孔洞直径（"Hole Dia."）、步长（"Step"）和范围（"Range"）值，以计算一组孔洞值。通常情况下，默认设置适用于大多数微型CT骨样本，其中噪声直径、步长和范围分别为5、5、2，孔洞直径、步长和范围分别为15、5、2。对于示例数据集，请保持默认设置。
注意："Noise Dia." 是噪声抑制滤波器的直径，"Hole Dia." 是皮质骨内部孔洞的直径。用于参数分析的噪声和孔洞值可参照上述皮质骨阈值的计算方法，使用指定的噪声/孔洞、范围和步长值进行计算。由于图像采集时扫描参数存在差异，噪声和孔洞参数应根据图像质量经验性地确定，因为并不存在适用于所有扫描的通用噪声和孔洞参数范围。阈值、噪声或孔洞的最低值必须大于或等于0；若根据所给参数计算出的最低值为负数，则将该最低值设为0。 - 点击 确定 以执行参数分析。在 参数分析结果 窗口中目视检查分割结果，并选择一个切片层，使骨外边界被较为准确地勾勒出来（图1B）。随后，从 参数分析结果 表格中对应所选切片层的条目中提取分析参数（表1）。
4. 小梁分析
- 小梁骨分割
- 打开 ImageJ 软件，然后打开或导入一幅扫描图像。
- 点击 Plugins | BoMomics | Trab Segmentation 按钮，并填写适当的分析参数。将 "Start"、"Outline Boundary"、"Trab. Bones"、"Noise Reduction Dia."、"Hole Filling Dia." 和 "Cortical Thickness Dia." 分别设置为 5、7,200、7,000、6、12 和 25。
注："Start" 和 "End" 指定用于小梁骨分割的切片范围，"Outline Boundary" 对应于轮廓化的 "Cort Bone" 参数，"Noise Reduction Dia." 对应于 "Noise Dia." 参数，"Hole Filling Dia." 对应于 "Hole Dia." 参数。"Cortical Thickness Dia." 是用于排除外层皮质骨的指定厚度。"Trab. Bones" 是提取小梁骨的阈值（图 2），其设置值通过步骤 3.5 中所述的轮廓分析参数命令确定。 - 点击 OK 执行小梁骨分割。在 Trab Segmentation Results 窗口中目视检查分割结果（图 2B）。将 Segmented Trabecular Bones 窗口中显示的已提取小梁骨以 tiff 格式保存（图 2B），该图像可被其他软件进一步分析。
- 小梁骨分析
- 打开 ImageJ 软件，然后打开或导入一幅扫描图像。
- 点击 Plugins | BoMomics | Trab Analysis 按钮，并填写适当的分析参数，例如 "Start"、"Outline Boundary"、"Trab. Bones"、"Noise Reduction Dia."、"Hole Filling Dia." 和 "Cortical Thickness Dia."（图 3A），其设置值通过步骤 3.5 中所述的轮廓分析参数命令确定。将 "Start"、"Outline Boundary"、"Trab. Bones"、"Noise Reduction Dia."、"Hole Filling Dia." 和 "Cortical Thickness Dia." 分别设置为 5、7,200、7,000、6、12 和 25。
注：在插件的免费版本中，从指定的 "Start" 切片索引开始选择五个相邻切片进行测量；而在商业版本中，用户可指定任意数量的切片。 - 在 Results Reporting 部分选择一个或多个待测参数，其中可选择的参数包括小梁骨体积（BV）、选定区域的总体积（TV），以及以二维（2D）或三维（3D）方式测量的厚度，通过三个复选框 "BV TV Only"、"2D" 和 "3D" 进行选择。选中 "2D" 和 "3D" 复选框，然后点击 "OK" 执行小梁骨分析 （图 3A，表 2）。
注：当勾选 "BV TV Only" 时，无论 "2D" 和 "3D" 是否被选中，均报告 BV、TV 和强度的原始测量值，同时提取并显示分割后的小梁骨于新窗口中，该图像可被保存并由其他软件进一步分析。当勾选 "2D" 时，报告使用板状模型在每个切片层面以二维方式测量的 BV、TV、强度及厚度的原始测量值。若勾选 "3D"，则直接计算每个体素的三维厚度（无需任何模型假设），并报告在每个切片层面采样的 BV、TV、强度及三维厚度的原始测量值。然而，若未选择任何复选框，则使用上述参数集对小梁骨进行分割，但不报告任何测量结果。
5. 量化模拟物体
- 打开 ImageJ 软件，然后打开一幅模拟图像。此处以直径为 30 像素的模拟球体为例。
- 选择 Plugins | BoMomics | Trab Analysis 按钮，并根据前述说明填写适当的分析参数。将 "Start"、"End"、"Outline Boundary"、"Trab. Bones" 保留默认值，并将 "Noise Reduction Dia."、"Noise Reduction Dia."、"Hole Filling Dia." 和 "Cortical Thickness Dia." 设置为 0（图 3）。
注意： 对于模拟对象，不存在非预期的信号噪声，且可能没有对应的皮质壳层。因此，此类参数应适当设置（默认值为零）。对于三维定量分析，插件的免费版本会处理指定 "Start" 切片前后各 30 层切片，而商业版本仅分析 "Start" 与 "End" 切片范围内包含的切片。 - 在 Results Reporting 区域中，选择 "2D" 和 "3D" 作为待测量参数，点击 OK 对模拟对象执行小梁分析（表 3）。
6. 小梁测量参数的校准与数据展示：分析选定区域中小梁测量参数的分布情况
- 根据微计算机断层扫描（micro-CT）设备供应商的说明，从扫描数据集中获取校准信息。
注意：插件仅报告骨体积（BV）、总体积（TV）、灰度强度（Intensity）和厚度的原始测量值。为了获得与其他软件生成报告具有可比性的结果，建议进行结果校准。 - 打开 Microsoft Excel，载入插件输出的结果表格。利用报告中的原始 BV、TV 和 Intensity 值，在 Excel 新列中根据以下公式计算校准后的骨体积（BV）、总体积（TV）、骨矿物含量（BMC）、骨体积分数（BV/TV）和骨矿物密度（BMD）。
- 注意：扫描分辨率（resolution，µm）、灰度缩放系数（scaling）、密度单位（mg HA/cm3）、密度斜率（slope）和密度截距（intercept）可从扫描获得的 micro-CT 图像或元数据文件（如 Scanco ISQ 文件）中提取。因此，校准后参数的计算方法如下：
假设 BV、TV 和 Intensity 为原始测量值，BVc 和 TVc 为校准后的值，resolution、scaling、slope、intercept 来自 micro-CT 图像的校准文件。
BVc = BV × resolution3 [μm3]
TVc = TV × resolution3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (Intensity ÷ scaling × slope - BV × intercept) × resolution3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - 使用 Microsoft Excel 软件，以校准后的测量值（Y 轴）对切片层数（X 轴）绘制 XY（散点）图（图 4）。
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结果
小梁骨分析插件旨在准确地自动分割并量化小梁骨。首先检测并勾画出骨的外边界，随后进行填补空洞操作，填充骨外皮质壳内的任何空洞。然后执行腐蚀操作，以排除外层皮质骨，获得分割后的小梁骨。最后，对分割区域内小梁骨的各项指标进行量化。
由于显微CT图像本身具有固有的噪声，使用预设的任意参数进行分割通常难以准确识别骨组织的外边界。尝试大量参数组合以选择满意的分割参数既繁琐又耗费人力。因此，提供了一种参数分析插件，可自动在设定范围内逐个改变参数，以辅助选择满意的参数组合，同时也便于为一组骨样本选择统一的参数集。图1A展示了用于分析良好分割参数的设置。当指定皮质骨阈值（Cort Bone）、待分析的阈值范围（Range）以及每步阈值的增量（Step）后，系统将生成一系列待分析的阈值。随后，通过设置相应参数，类似地生成一系列噪声和孔洞参数值。最后，通过依次改变所有可能的参数组合...
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讨论
本研究介绍了一种用于分析骨小梁的ImageJ插件，该插件具有自动化、高效且用户友好的特点。该插件还可用于对任意二维或三维物体进行逐层的面积、体积和厚度量化分析。目前，标准的显微CT分析对每个样本仅报告每个骨小梁参数的单一测量值，无法充分反映所选分析区域内被测实体的特征。而本研究所描述的插件可对每个样本的各个参数提供逐层的量化数据，完整保留了所选分析区域内测量参数的分布信息，因此可应用更先进且更敏感的统计方法对这类数据进行分析。
采用标准的半自动手动勾画分割方法时，不同操作者在勾画切片之间存在显著差异，并伴有操作者偏差8,9,10，因此需要一种更均匀且自动化的骨小梁分割方法。由于扫描背景与骨外边界之间的对比度最大，该插件通过外边界辅助的骨小梁分割方法进行处理，当提供适当的阈值、去噪和去孔参数时，可准确自动检测骨的外边界。为便于确定分割参数，使用分析区域内的代表性切片逐一测试一系列参数组合，并通过视觉...
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披露
已针对量化物体厚度的基础算法申请了专利。作者与其他人合作注册了bomomics.com网站，该网站提供免费版本的插件，并可根据请求提供图像分析的咨询服务和量化服务。
致谢
本工作部分得到了国家自然科学基金（项目编号：NFSC 81170806）的支持。作者感谢武汉大学口腔医学院显微CT核心设施在大鼠股骨扫描与分析过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ImageJ | NIH | imagej | 任何具有 Java 1.8 运行环境的版本 |
| 小梁结构分析插件 | Bomomics | bomomics | 免费或商业版本 |
| 显微CT扫描仪 | Scanco | μ-50 | 任何厂商的显微CT设备 |
| 计算机系统 | Lenovo | 任何品牌 | |
| Windows 操作系统 | Microsoft | Windows 7 x64 | 任何 64 位 Windows 操作系统 |
| 办公软件 | Microsoft | Office 2010 | 任何具备 XY 图表功能的电子表格软件 |
参考文献
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重印与许可
