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方法文章

一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组多样性影响的方法

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DOI：

10.3791/57182

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2018年2月28日

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

本文内容

摘要

环境富集（Environmental Enrichment, EE）是一种动物饲养环境，用于揭示生活方式、应激与疾病之间关联的潜在机制。本方案描述了一种利用结肠肿瘤发生小鼠模型和环境富集方法，特异性界定可能影响动物死亡率的微生物群多样性变化的实验流程。

摘要

近期多项研究揭示了生活在丰富环境中的有益作用，可改善人类疾病状况。在小鼠中，环境丰富化（EE）可通过激活小鼠免疫系统来减少肿瘤发生，或通过刺激伤口修复反应（包括提高肿瘤微环境中的微生物组多样性）来影响荷瘤动物的生存。本文提供了一种详细的实验流程，用于评估环境丰富化对小鼠结肠肿瘤模型中微生物组生物多样性的影响。文中描述了有关动物繁育的注意事项，以及动物基因型和小鼠群体整合的考虑因素，这些因素最终均会影响微生物的生物多样性。遵循这些注意事项可能有助于实现更均一的微生物组传播，从而减轻非处理因素带来的干扰效应，避免对研究结果造成混淆。此外，本实验流程通过长期环境丰富化后从小鼠远端结肠采集的粪便样本中提取DNA，并采用16S rDNA测序技术对肠道菌群变化进行表征。肠道微生物群失衡与炎症性肠病和结肠癌的发病机制相关，同时也与肥胖、糖尿病等多种疾病有关。重要的是，该环境丰富化及微生物组分析方案可用于研究微生物组在多种疾病发病机制中的作用，前提是存在能够有效模拟人类疾病的稳健小鼠模型。

引言

环境富集（EE）研究利用复杂的饲养条件来影响社会刺激（大型饲养笼、更大数量的动物群体）、认知刺激（小屋、隧道、筑巢材料、平台）和身体活动（跑轮）。许多实验室已采用环境富集方法，结合多种小鼠模型，研究增加活动量以及改善社会和认知互动对疾病发生和进展的影响，这些模型包括理毛行为诱导的脱发、阿尔茨海默病、Rett综合征，以及多种肿瘤和消化系统疾病模型1,2,3,4,5,6。

已开发出多种小鼠模型用于研究小鼠结肠肿瘤的发生。其中定义最明确的模型可能是ApcMin小鼠。该ApcMin 小鼠由William Dove实验室于1990年建立7，被用作研究APC基因突变的小鼠模型，这类突变通常与人类结直肠癌相关。与携带APC突变的人类不同，ApcMin小鼠主要发生小肠肿瘤，而结肠肿瘤极为罕见。然而，当ApcMin 等位基因与一个在Tcf4基因中具有单次基因敲入-敲除杂合突变的Tcf4Het等位基因联合时，可极大增强结肠肿瘤的发生8。最近，这一结肠肿瘤发生的小鼠模型已被用于确定环境富集（EE）对结肠肿瘤发生的影响6。在Bice等人进行的研究中，明确了环境富集对四种不同小鼠品系（野生型（WT）、Tcf4Het/+ Apc+/+、Tcf4+/+ ApcMin/+和Tcf4Het/+ApcMin/+）的雄性和雌性个体的生理及表型效应。其中最引人注目的发现是，环境富集显著延长了雄性和雌性结肠肿瘤携带动物的寿命。这表明环境富集可能减轻与结肠肿瘤发生相关的部分症状，并改善动物健康状况。值得注意的是，雄性动物寿命的延长并非肿瘤发生减少的直接结果，而是与肿瘤伤口愈合反应的启动有关，包括微生物组生物多样性的改善6。

已发表多项针对环境富集（EE）的特定研究，结果颇具启发性。然而，从技术角度来看，这些重要结果往往难以在其他实验室中重现。在不同实验室之间保持完全相同的EE方法极为复杂，其影响因素不仅包括所使用的富集装置和饲养环境，还涉及垫料、食物、通风、繁殖方式、遗传背景、房间内的活动情况以及动物实验方案要求等9,10,11。其中一个例子是动物的整合问题：为避免非干预因素带来的影响，实验动物必须稳定地融入小鼠种群，从而确保遗传背景和饮食成分的一致性。此外，许多EE研究完成于人们认识到微生物组在疾病中重要性之前，未能考虑常规小鼠饲养操作对肠道微生物组构成的潜在影响10,12。

如果操作不当，富集环境（EE）中的繁殖策略和动物安置可能会增加动物的应激反应。由于富集环境研究需要使用大量雄性和雌性动物以及多种基因型，且实验设计要求将来自多个窝的动物合并饲养，因此实验设置较为复杂。为此，我们制定了一种繁殖和断奶策略，以便将不同窝中具有正确基因型的断奶后动物进行合并。该策略的主要目的是在不同窝之间标准化微生物群，并在动物转移至实验环境时减少应激。微生物群由母鼠传递10。为了向种群提供微生物多样性，实验前一个月从杰克逊实验室（Jackson Labs）购入雌鼠并将其整合入种群中9,10,12。为进一步使动物间的微生物组多样性趋于一致，雌鼠在繁殖前进行合笼饲养。繁殖后，在幼鼠培育期间采用群体饲养方式，并允许母鼠在哺乳期间暂时离开幼崽，这有助于改善母性照料过程中的应激水平13,14，可能进一步促进微生物组的标准化。为避免非富集环境因素对微生物组产生影响，所有实验动物均采用群体饲养，从而防止将来自不同窝的多只雄性动物合并在同一实验笼中时可能引发的争斗及其他附加应激。最后，每个笼中均包含相同数量的不同基因型动物。这一安排有助于提升跨基因型的微生物群多样性，并消除了食粪行为（动物摄食粪便的倾向）或可能存在的基因型特异性行为差异对整体研究结果的干扰。

本方案提供了一种策略，可将以往的丰富环境（EE）研究加以拓展，纳入微生物组研究中已知的关键因素，包括微生物群的传播以及动物种群的整合以实现微生物群的标准化，从而在实验动物之间建立更为均一的微生物组群体。由于非处理因素导致的微生物群差异可能干扰研究结果，因此遵循这些注意事项至关重要。消除与丰富环境无关的微生物群变化，将使研究人员能够明确界定丰富环境在疾病发生和发展过程中对微生物群组成所起的特定作用。

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方案

此处描述的所有方法均依照犹他大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 实验设计及环境丰富化组与对照组笼具设置

注意： 作为参考，实验设计的概要已作图示说明（图1）。

  1. 设置对照（NE）和环境丰富化（EE）笼具（图2).
    1. 设置正常环境（NE）笼具时，使用经高压灭菌的常规对照笼具（表1）且不包含丰富环境装置。
    2. 对于大型笼具，每个笼具钻一个足够大的孔，以容纳一个衬套和隧道材料表).
    3. 为建立幼鼠饲养和环境丰富化（EE）笼具，将两个大型高压灭菌笼通过一个经灭菌处理的垫圈固定连接管及两个灭菌平台连接，以增加笼内地面空间（表1在环境丰富化（EE）实验中，于EE笼内提供经过灭菌的跑轮、隧道、圆顶屋、小屋、爬行球和筑巢材料。
    4. 将 EE 和 NE 笼具置于通风柜中，以提供相同的通风条件。
      注意： 两个大型笼子，各含两个平台（表 1允许每窝幼崽饲养设置最多容纳 12 只怀孕雌鼠15 （参见 材料清单，文档中的步骤 3.2，以及 表2).
    5. 喂养小鼠 随意摄取 辐照标准饲料和高压灭菌的反渗透水。
    6. 为小鼠提供无菌垫料。
      注意： 所有空笼及带动物笼具的操作均须在生物安全柜中进行，以防止污染。对于大型笼具的操作，需用粘性膜覆盖笼具上的孔洞。
  2. 准备用于繁殖的动物。将15只两个月大的雌性小鼠共同饲养于一个大型笼具中（表1在交配前 2 周内，将动物单独饲养。另将 2 月龄的同窝雄性小鼠在交配前单独饲养 2 周。
    注意： 用于繁殖的雌性数量取决于实验需求及所需动物数量。本研究中使用了15只雌性以获得12只阴栓阳性雌性，这是1.1.2节所述仔鼠饲养设置中允许的最大数量。表 2).
  3. 用于繁殖，将种鼠按1只雄性与2只雌性组合配对。早晨首次检查应观察阴道栓，其可能存在可视迹象，表明动物在夜间已交配。
    注意： 将雄性和雌性小鼠共同饲养，直至每只雌性小鼠出现阴栓。若阴栓位于外部，可通过肉眼观察识别。
    1. 为检测已插入的栓塞，将探针插入阴道开口；若阴道栓存在，则探针不易插入16；参见第4.3.6节。
      注意： 记录发现阴栓的当天上午 ½ 天，因为交配发生在夜间。
    2. 一旦雌鼠出现阴道栓，即将其转移到大型幼崽哺育笼中，与其他已交配的雌鼠进行群养（步骤1.1.2中设置，不包含富集装置）。
    3. 将已交配的雌鼠更换为新的未交配的群养雌鼠进行交配，并持续交配以在7天内获得最多数量的窝仔。
      注意： 所有动物的交付日期必须在彼此之间的7天内。
  4. 让怀孕的雌性小鼠在群体饲养环境中分娩，使所有幼崽均在同一较大的幼鼠培育笼中饲养（设置见步骤1.1.2，不添加丰富化装置）。
    1. 记录仔鼠数量和出生日期，并在仔鼠7日龄时开始进行基因分型。
      1. 在7日龄时，使用数字编码在幼鼠脚趾上进行纹身标记以识别个体13,17.
      2. 用70%乙醇清洁脚趾，然后将含有墨水的微型纹身装置平行于脚趾皮肤表面轻轻插入17 （参见 材料表).
      3. 使用剪刀从7日龄幼鼠尾尖切取少量组织用于基因分型。
    2. 从组织中提取基因组DNA，并采用常规HotSHOT方法进行PCR扩增，具体步骤如下所述 18.
    3. 在14至21日龄时按性别将动物与母鼠一同分笼饲养于大鼠笼中。
      注意： 确保较大的幼崽能够自主进食，而较小的幼崽则继续哺乳，直至足够大时能够自主进食。
    4. 在21至28天时，按基因型将雄性和雌性动物分别分配至标准环境（NE）或富集环境（EE）中，确保每笼内各基因型的比例相等（图2A).
      注意： 确保每个NE或EE笼具中允许的动物总数基于IACUC规定的最大数量表 2）。NE笼中最多饲养5只动物（表 2在环境丰富化笼具中，为提供社交刺激，每笼饲养动物数量不得少于20只，同时因空间限制，最多不得超过41只动物表 2).

2. 16周龄时的粪便采集

  1. 在处死前1至2天开始收集粪便，并在处死当天解剖过程中使用无菌工具单独收集粪便。
    注意： 在采集前1至2天的同一时间收集粪便，有助于避免因采集时无粪便排出而导致样本丢失。
    1. 对活体动物进行粪便采集时，将动物轻轻抓起并置于干净的笼子上方，用无菌镊子夹取粪便放入无菌微量离心管中。
      注意： 动物在被固定时通常会排便，此时可直接将粪便快速收集到无菌的微量离心管中。若动物被固定后未立即排便，将其放入清洁的笼具中，等待其排便（通常不超过1小时）。
    2. 在处死当天收集粪便。
      1. 处死动物时，将动物置于含有小容器的钟形罩内，容器中放置浸有异氟烷的棉球。观察到呼吸停止（通常约2分钟后），将动物仰卧放置，以便进行结肠解剖。
      2. 用70%乙醇擦拭小鼠腹部。
      3. 用镊子提起尿道口前方的皮肤，用剪刀沿腹侧正中线剪开，直至到达肋骨区域，然后从第一条切口的基部向每条后肢方向剪开。将皮肤向后折叠，用剪刀以相同方式剪开腹膜壁。
      4. 用镊子夹住肛门处的远端结肠，解剖并分离远端结肠与直肠。在用镊子垂直牵拉结肠的同时，使用剪刀剪开肠系膜，以游离结肠。
      5. 在盲肠下方剪断结肠，并将其平铺于滤纸上。用镊子提起结肠管的上端，打开管腔，以便将剪刀的一侧刀刃插入。沿纵轴从远端向近端剪开，将结肠纵向展开。
      6. 使用无菌镊子将远端结肠的粪便收集至无菌微量离心管中。
  2. 将粪便样本置于微型离心管中，于 -80 ℃ 保存 ˚直至进行细菌DNA提取时为止。
    注意： 在处死当天，除粪便外，还需采集其他样本，如全血、血清、血浆、结肠和小肠的正常及肿瘤组织、微粒体、脂肪组织 等等以解决研究中设定的问题。

3. 从粪便中分离基因组DNA

注意：按照粪便病原体检测方案，使用商业试剂盒从粪便中分离微生物DNA。将样品直接从-80 ˚C冰箱中取出，并在称重时置于干冰上保存。

  1. 将最多 220 mg 的粪便转移至含有 1.4 mL 室温（RT）粪便裂解缓冲液的洁净微量离心管中（参见材料表）。
  2. 涡旋震荡样本 1 分钟，充分均质化固体物质（图 2B）。将悬浮液在 95 ˚C 加热 5 分钟，以裂解所有细菌（包括革兰氏阳性菌）。
  3. 涡旋震荡样本 15 秒，然后在 20,000 x g 离心 1 分钟，使粪便固体沉淀。将上清液转移至 2 mL 微量离心管中。向每个样本中加入一片去除 PCR 抑制剂的试剂片，涡旋至完全溶解，并在室温下孵育 1 分钟。
  4. 在 20,000 x g 离心 3 分钟，将上清液转移至新的微量离心管中，再次在 20,000 x g 离心 3 分钟。取 15 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL 储存液）加入新的 1.5 mL 微量离心管中。用移液器将 200 μL 样本加入含蛋白酶 K 的管中。
  5. 向管中加入 200 μL 脀盐酸胍裂解缓冲液，充分涡旋震荡 15 秒（参见材料表），并在 70 ˚C 孵育 10 分钟。向管中加入 200 μL 乙醇（96–100%），充分涡旋混匀。
  6. 将基于硅胶的离心柱放入 2 mL 收集管中，将样本加入柱中。盖紧盖子，在 20,000 x g 离心 1 分钟。
  7. 将柱转移至新的 2 mL 收集管中，向柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 1，盖上盖子，在 20,000 x g 离心 1 分钟。再将柱转移至另一新的 2 mL 收集管中，加入 500 μL 洗涤缓冲液 2，盖紧盖子，在 20,000 x g 离心 3 分钟。
  8. 盖紧盖子，将柱转移至新的 2 mL 收集管中，在 20,000 x g 额外离心 1 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。将柱转移至标记好的 1.5 mL 微量离心管中，通过向膜上加入 200 μL 含 EDTA 的洗脱缓冲液进行洗脱（参见材料表）。
  9. 盖紧盖子，在室温下孵育 1 分钟。在 20,000 x g 离心 1 分钟。弃去离心柱。

4. DNA 浓度测定及 PCR 样本制备

注意：使用荧光计和市售的双链DNA荧光检测试剂来测定每个样本中的基因组DNA浓度（参见材料表）。荧光染料必须特异性结合双链DNA。

  1. 将每个样品稀释200倍（每个样品1 µL加入199 µL dsDNA主混合液中），并将标准品稀释50倍。使用荧光计在dsDNA模式下进行分析。
    注意： PCR中过高的DNA量可能产生抑制作用，因此所用DNA体积不得超过PCR终体积的10%。荧光计可准确测定样品中的DNA含量，因为只有与荧光染料结合的DNA才会发出荧光，从而排除了污染物对最终计算DNA浓度的可能干扰。这种精确的定量对于后续的测序应用至关重要。
  2. 用适量的10 mM Tris（pH 8.5）将PCR模板稀释至5 ng/μL，制备各样品的工作模板储备液。
  3. 将样品储存在-20 °C。

5. 设计针对16S目标V区的引物

  1. 设计引物以选择性扩增目标 V 区 16S rRNA 区域。
  2. 使用核糖体数据库项目（Ribosomal Database Project）中的 Probe Match 工具19分析引物，以确定对不同门类的大致匹配率。
    注意：针对 V1-V3 区域，本研究采用已发表的引物 Bosshard 正向引物20（结合于 V1 区域第 8 位）和 533 反向引物21（结合于 V3 区域第 533 位）。引物必须包含用于加标签的接头适配序列。
  3. 设计引物时，应在每个引物的 5' 端添加接头序列，以符合 16S 宏基因组测序文库制备的推荐要求22（表 3）。
  4. 使用柱纯化法合成这些较长的引物。将干燥引物重悬，并稀释为 PCR 工作液，浓度为 1 μM，溶剂为 10 mM Tris，pH 8.5。

6. 加入接头序列的扩增子 PCR 扩增 V 区域22

  1. 按照表4所述配制扩增子PCR反应体系。
  2. 在PCR板上覆盖一层透明粘性PCR板封膜，并按照表5中的参数运行扩增子PCR程序。
  3. （可选）将扩增子PCR产物在琼脂糖凝胶或高灵敏度DNA检测中进行电泳分析，以实现对扩增子大小的定量测定（参见材料表）。
    注意：本研究中扩增子的大小为550 bp（图3A）。

7. 使用磁珠进行 PCR 纯化 22

  1. 将扩增PCR板在1,000 × g下短暂离心1分钟，以收集冷凝液。
    注意：可使用PCR管条代替PCR板，以尽量减少污染。弃去管盖，切勿重复使用。
  2. 涡旋振荡磁珠使其均匀分散，向每个扩增PCR孔中加入20 μL磁珠，然后缓慢吹打混合10次，确保整个液体体积充分混匀。
  3. 在室温下孵育5分钟。将PCR板置于磁力架上2分钟，直至磁珠完全聚集且上清液澄清。移除并弃去上清液。
  4. 当PCR板仍置于磁力架上时，用200 μL新鲜的80%乙醇洗涤磁珠，并在室温下于磁力架上孵育30秒。小心移除上清液。
  5. 重复洗涤一次。然后使用细尖移液枪头小心吸除各孔中残留的乙醇，并在空气中干燥10分钟。
  6. 将PCR板从磁力架上取下，向每孔中加入52.5 μL 10 mM Tris（pH 8.5）。上下吹打10次以充分重悬磁珠，室温孵育2分钟。
  7. 将PCR板转移至磁力架上使磁珠聚集，将50 μL上清液转移至新的洁净PCR板中。在板上覆盖透明粘性PCR密封膜，于-20 ˚C保存，最多可保存一周。

8. 准备用于Index PCR的孔板方案

注意：为了构建 V1-V3 文库，使用索引试剂盒（见材料表）进行了第二次 PCR 扩增。采用默认的索引策略，为每个样本分配唯一的双端索引组合（图 3B 和 23）。

  1. 确保每个样本都具有两种索引引物（即，双重索引）的独特组合。

9. 按照文献22所述方法进行加接头PCR，将条形码连接至接头序列。

  1. 将2.5 μL的PCR扩增产物（纯化后的扩增产物）转移至新的96孔板中，并放入索引板固定装置中以辅助索引操作。
  2. 按照已准备好的板图示例（图3B）排列index 1和index 2引物。
    注意： 提供了视觉提示以避免引物混淆：index 2引物管应为白色盖子并含有无色溶液，而index 1引物管应为橙色盖子并含有黄色溶液。
  3. 按照表6所述配制索引PCR混合液。通过移液器上下吹打10次混匀。用透明粘性PCR板封膜密封，然后在室温下以1,000 × g离心1分钟，使液体沉降至管底。
  4. 使用表7中的参数运行索引PCR程序。

10. 纯化最终的 PCR 文库

注意：此PCR纯化步骤与上述步骤7相同，使用磁珠对index PCR22进行PCR纯化。

  1. 将第10步的PCR板在1,000 × g下短暂离心1分钟，以收集冷凝液。
  2. 涡旋振荡磁珠使其均匀分散，然后向每个扩增PCR孔中加入20 μL磁珠，缓慢吹打混合10次，确保充分混匀。
  3. 在室温下孵育5分钟。
  4. 将PCR板置于磁力架上2分钟，直至磁珠完全聚集且上清液澄清，移除并弃去上清液。
  5. 当PCR板仍置于磁力架上时，用200 μL新鲜的80%乙醇洗涤磁珠，并在室温下于磁力架上孵育30秒，小心移除上清液。
  6. 重复洗涤步骤第二次。
  7. 第二次洗涤后，使用细尖移液枪头去除各孔中残留的乙醇，室温下空气干燥10分钟。
  8. 将PCR板从磁力架上取下，向每孔中加入52.5 μL的10 mM Tris（pH 8.5），吹打10次以重悬磁珠，室温孵育2分钟。
  9. 将PCR板转移至磁力架上使磁珠聚集，将50 μL上清液转移至新的洁净PCR板中。在板上覆盖透明粘性PCR密封膜，于-20 ˚C保存，最长可保存一周。
  10. （可选）在琼脂糖凝胶或高灵敏度DNA检测系统上运行加索引的PCR产物，以定量测定扩增片段大小（参见材料表）。
    注意：本研究最终的加索引文库大小为668 bp（图3C-D）。

11. 对加索引的文库进行定量、归一化和混合以用于测序

  1. 使用荧光计和双链DNA荧光检测试剂盒测定每个样本的DNA浓度（参见材料表）。
    1. 对每个带索引的样本和标准品制备1:200稀释液（每个样本取1 µL加入199 µL双链DNA主混合液中，主混合液包含缓冲液和试剂；标准品则取10 µL加入190 µL双链DNA主混合液中）。使用荧光计在双链DNA模式下进行分析。
  2. 在计算DNA浓度后，通过计算平均文库大小对文库进行归一化处理。该计算方法为将接头长度、索引长度以及引物扩增的V区片段大小相加，并通过琼脂糖凝胶电泳观察产物，以确认实际大小与计算大小相近（图3C，参见22）。
    1. 或者，可使用高灵敏度DNA检测试剂，用于定量测定DNA完整性、扩增片段大小和浓度（材料表， 图3D）。
      注意：本研究中，平均文库大小是基于接头长度、索引长度以及引物扩增的V1-V3区片段大小之和计算得出，平均大小为668 bp。
    2. 使用表8中的公式对样本浓度进行归一化处理。
  3. 将各样本稀释至4 nM，并从每个4 nM样本中取5 μL混入同一管中用于测序。

12. 使用下一代测序系统对文库进行测序并解析数据

  1. 对文库进行测序。
    注意： 本研究中，犹他大学高通量基因组学核心设施完成了文库变性及样本测序（如文献6,22所述）。
  2. 解析数据。
    注意： 为区分混合样本的数据，需识别并分离索引序列（如文献22所述）。
  3. 生成FASTQ文件，并用于后续数据分析。

13. 分析16S扩增子文库的测序数据

注意：此步骤按 Bice et al., 20176 中所述进行。

  1. 安装可免费获取的数据分析工具（参见 材料表；24）。
  2. 从测序数据中组装去多重化的 fastq 文件（如 25,26 所述）。丢弃所有未组装的序列。
  3. 按照 de novo 开放分类单元（OTU）聚类分析流程进行分析（如 27 所述）。
    1. 按样本编号（sampleID）将序列归入单一的 fastq 文件，并将相似度 ≥97% 的序列聚类为同一 OTU（如 28 所述）。使用最小长度为 150 且序列一致性达 75% 的核心序列集进行比对 29,30。按所述方法进行分类学注释 28。
      注意： 可先对样本进行归类和分析 31，再进行分类学注释和 OTU 表构建 32。
    2. 创建一个映射文件，用于标识样本的描述性名称和特征，以关联样本编号，并验证该映射文件的有效性 33,34。
    3. 利用映射文件构建 OTU 网络，将 OTU 与样本描述信息关联起来 35。
    4. 通过图表汇总方式，以相对丰度为基础计算分类学总结信息 36。
    5. 在适用于样本的统一测序深度下评估样本的 alpha 多样性。为确定 alpha 多样性分析的合适测序深度，可使用 biome summarize-table 命令汇总各样本中观察到的总序列数（如 37 所述）。

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结果

多项研究表明，身心医学的实践可改善健康结局。类似地，在小鼠中，环境富集可改善包括寿命延长和肿瘤伤口修复在内的多种结局6。因此，本研究建立了一种环境富集（EE）实验流程，旨在明确微生物群在此表型中的作用，同时在实验开始前首先对微生物组进行标准化处理（图1）。重要的是，所有用于繁殖的动物在开始繁殖前至少需整合进入小鼠群体中一个月，新生幼崽则与母鼠共同饲养于一个大笼中，以在实验前标准化微生物群的传播。当动物年龄处于21至28天之间时，将每种基因型数量相等的小鼠断奶后分别转入相应的饲养环境，即EE或标准环境（NE）（图2A）。在16周时，收集所有动物的粪便样本并进行均质化处理（图2B），随后提取细菌DNA。最后，从粪便微生物组DNA中扩增16S扩增子，并通过条形码索引，以实现所有微生物组文...

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讨论

该实验方法可用于分析经环境富集处理的正常动物或荷瘤动物粪便中分离出的微生物群。由于此类实验规模较大，需通过繁育获得多种性别和基因型的大量动物，因此在实验开始前对动物间的微生物组进行标准化处理至关重要，以避免非环境富集因素对微生物组生物多样性产生影响。

为了确保新环境（NE）与丰富环境（EE）条件之间的一致性，通过繁育过程确保所有小鼠最初均暴露于相同的微生物，因此预期其微生物组构成相似。小鼠基因型可能影响微生物组的组成，且这种影响很可能存在。因此，在新环境与丰富环境条件下，各基因型的小鼠数量均保持一致，以确保任何摄食粪便的小鼠所接触到的微生物组多样性相似。

设计环境富集（EE）实验时会遇到若干困难。首先，实验所需的动物总数取决于具体的实验细节，但也受限于笼内允许饲养的动物数量。例如，以往关于小鼠在初步环境富集实验中存活情况的历史数据被用于计算所需动物数量，以明确先前实验中观察到的存活率改善背后的机制。根据这些数据，在双侧t检验（alpha=0.05）中若要以80%的检验效能检测存活率差异，对照组总共需要17只动物。因此，在实验组...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢犹他大学基因组学核心的 B. Dalley 提供文库测序服务，以及犹他大学生物统计学核心的 K. Boucher 提供统计学建议；这些技术核心由美国国家癌症研究所资助项目 P30 CA042014 支持。本项目得到了美国国家癌症研究所基金 P01 CA073992 和 K01 CA128891 以及亨茨曼癌症基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Teklad 饲料/Harlan 实验室饲料Harlan Labs3980X由 Mario Capecchi 博士与 Harlan 实验室合作配制的标准辐照饲料。
Cell-Sorb Plus 垫料Fangman Specialties82010使用前需高压灭菌。
AIMS 新生动物纹身系统AIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32。其他动物级纹身系统和墨水也可使用，效果类似，包括 Aramis 微型纹身套件。
Zyfone One Cage 2100 AllerZone 小鼠微隔离系统，包含笼具、AllerZone 滤膜盖和模块化饲料输送系统Lab Products82120ZF每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。
Zyfone One Cage 2100 寿命延长富集装置Lab Products82109ZF每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。
Zyfone One Cage 2100 笼具，13-7/8" 长 × 19-1/16" 宽 × 7-3/4" 深Lab Products82100ZF每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。
Zyfone One Cage 2100 AllerZone 微隔离滤膜盖Lab Products82101ZF每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。
连接隧道Bio-ServK3323 或 K3332用于连接笼具并提供环境富集
用于连接隧道与笼具的衬套由犹他大学机械车间制造n/a确保材料耐啃咬且可高压灭菌
快速跑轮Bio-ServK3250 或 K3251与小鼠 igloo 和底板配合使用
小鼠 iglooBio-ServK3328、K3570 或 K3327与快速跑轮和底板配合使用
小鼠 igloo 底板Bio-ServK3244与小鼠 igloo 和快速跑轮配合使用
小鼠小屋Bio-ServK3272、K3102 或 K3271
爬行球Bio-ServK3330 或 K3329
Bio-hutBio-ServK3352由木浆制成的小屋，用于遮蔽和筑巢
粘性薄膜 VWR60941-072用于临时覆盖大笼具上钻出的孔，防止小鼠逃逸
层流通风笼架TechniplastBio-C36本研究中使用的柜体目前不再供应。Bio-C36 型号非常相似。
1.5 mL 微离心管（无 RNA 酶和 DNA 酶）任意供应商
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504该试剂盒提供 50 次 DNA 提取所需的试剂。粪便裂解缓冲液 = ASL；氯化胍裂解缓冲液 = AL；含氯化胍的洗涤缓冲液 1 = AW1；洗涤缓冲液 2 = AW2；含 EDTA 的洗脱缓冲液 = AE
水浴锅（可加热至 95°C）任意供应商用于将粪便样本在 94°C 下孵育以裂解细胞。
水浴锅（可加热至 70°C）任意供应商用于将粪便样本在 70°C 下孵育 
乙醇（200 证明）Sigma AldrichE7023
荧光计：QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA 宽范围检测试剂盒ThermoFisher ScientificQ32850
EB 缓冲液或 10 mM Tris pH 8.5Qiagen19086
实验特异性引物任意供应商
PCR 级水任意供应商
2X KAPA HiFi HotStart 即用型预混液 Kapa BiosystemsKK2601用于扩增子扩增（1.25 mL 可进行 100 次反应）。
用于运行诊断凝胶的琼脂糖任意供应商
TapeStation 高灵敏度 D1000 屏幕胶带检测Agilent5067-5583TapeStation 或 Bioanalyzer 仪器在机构基因组核心设施中常用于分析文库质量。也可使用 Bioanalyzer DNA1000 芯片（Agilent，5067-1504）。
Agencourt AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63880用于 PCR 产物纯化的磁珠，5 mL 可纯化 250 次 PCR 反应
磁力架Life TechnologiesAM10027
文库制备指南IlluminaIllumina. 16S 宏基因组测序文库制备：为 Illumina MiSeq 系统制备 16S 核糖体 RNA 基因扩增子。https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf。
双端唯一索引IlluminaIllumina Experiment Manager 软件免费获取地址：https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 索引试剂盒IlluminaFC-131-1002用于为扩增子添加条形码
MicroAmp 光学 96 孔反应板Applied Biosystems/ThermoFisherN8010560
TruSeq 索引板固定装置IlluminaFC-130-1005
透明粘性板封Applied Biosystems /ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 粘性膜
使用 MiSeq v3 试剂进行双端 300 bp 测序IlluminaMS-102-3003
PhiX 控制试剂盒IlluminaFC-110-3001
蛋白酶 K（600 mAU/ml）Qiagen19131相当于 20 mg/ml 的蛋白酶 K。随 QiaAmp 试剂盒提供
数据分析工具QiimeQIIME 软件工具安装方式可能因系统而异，QIIME 网站描述了多种选项（http://qiime.org/install/install.html）。本研究使用了 MacQIIME 软件包 1.9.1（由 SUNY Werner 实验室编译，http://www.wernerlab.org/software/macqiime）
步骤 13.2。QiimeFastQ Join 方法 （http://code.google.com/p/ea-utils  ）。  本研究中使用了多重连接成对末端方法 http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html。Aronesty, E. ea-utils: 用于处理生物测序数据的命令行工具。Expression Analysis, Durham, NC. (2011)。
步骤 13.3。Qiime从头聚类 OTU 挑选流程http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html。
步骤 13.3.1。使用 Uclust 的操作分类单元（OTUs）Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010)。
步骤 13.3.1。PynastPynastCaporaso, J.G. 等。PyNAST：一种灵活的序列比对工具，可将序列比对至模板。Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010)。 
步骤 13.3.1。PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. 等。Greengenes：一个经嵌合体检查的 16S rRNA 基因数据库及与 ARB 兼容的工作平台。Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006)。本研究使用了 Greengenes 版本 13_8
13.3.1. 注： Qiime多重拆分文库http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html。
13.3.1. 注： Qiime从头聚类 OTU 挑选脚本http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
步骤 13.2.2。Qiime创建映射文件http://qiime.org/documentation/file_formats.html。
步骤 13.2.2。Qiime验证映射文件http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html。
步骤 13.3.3。Qiime将 OTU 与样本描述链接至映射文件http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html。
步骤 13.3.4。Qiime通过图表汇总分类信息http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html。
步骤 13.3.5。QiimeBiome 汇总表http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  本研究中，所有样本均稀疏化至 20,000 个 OTU，随后使用 QIIME 中的 alpha 稀疏化脚本进行分析。

参考文献

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