需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

11.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57188

⸱

2018年5月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。

摘要

树突状细胞（DC）是一类异质性的细胞群体，其在细胞膜标志物、迁移模式与分布，以及抗原呈递和T细胞活化能力方面均存在差异。由于大多数实验性肿瘤模型的疫苗接种需要数百万的DC，这些细胞通常广泛地从骨髓或脾脏中分离获得。然而，这些来源的DC在对免疫复合物（IC）的反应性上，与血液和肿瘤来源的DC存在显著差异，对其他与Syk偶联的凝集素受体的反应性也可能不同。尤为重要的是，鉴于DC对危险相关分子的高度敏感性，在分离过程中的任一步骤若存在内毒素或可交联活化受体的抗体，均可能导致DC被提前活化，从而影响其后续活化所需的参数，或至少影响所需剂量。因此，本文详细描述了一种从血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）并避免其过早活化的实验方案。此外，还提供了一套使用肿瘤来源免疫复合物活化MoDC及其后续分析的完整流程。

引言

自发现以来，树突状细胞（DC）因其独特调控T细胞分化的潜能而成为广泛研究的焦点1。在过去几十年中，大量研究致力于定义各种DC亚群及其在肿瘤进展与免疫反应中的功能2。DC由异质性细胞群体组成，彼此在模式识别受体、组织分布以及迁移和抗原提呈能力方面存在差异3,4,5。与其他DC亚群相比，单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）在肿瘤中更为丰富，并且可由循环或肿瘤浸润的单核细胞轻松诱导生成6,7。因此，许多旨在利用其相对高丰度的临床试验均基于对自体MoDC进行体内（in vivo）和体外（ex vivo）操控，以激发T细胞免疫应答8,9。

类似地，基于树突状细胞（DC）的实验性肿瘤模型疫苗接种需要每隔5至7天进行2到3次连续注射，每次注射1-2 × 106个经肿瘤抗原刺激活化的DC。因此，为了获得足够数量的DC，大多数小鼠研究主要采用在GM-CSF中培养7至9天由骨髓（BM）前体细胞分化而来的单核细胞来源树突状细胞（MoDC）（在小鼠体系中无需添加IL-4）10,11。然而，由于GM-CSF基因敲除小鼠的DC区室总体正常12,13，且该培养方法获得的细胞群体成分混杂14，这些体外诱导DC的生理相关性已受到质疑。

此外，树突状细胞（DC）也可常规性地从脾细胞中分离获得。然而，DC仅占总脾细胞的约0.3%-0.8%（相当于每只小鼠脾脏中约7 × 105个DC），而在这些细胞中，仅有CD103+ DC和单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够迁移回淋巴器官。由于MoDC约占脾脏DC群体的10%-15%15,16，大多数分离方案每只脾脏仅能获得约1 × 105个MoDC。通过注射可分泌GM-CSF的转染B16细胞可实现MoDC的扩增，从而使脾脏中的MoDC数量增加约100倍17。然而，由于该方法无法应用于人类，且所获得的MoDC已处于高度活化状态，因此MoDC在树突状细胞疫苗开发中的应用受到限制。

除了获得足够数量的DC外，开发针对自体癌细胞的有效DC疫苗面临的另一个挑战是肿瘤微环境中缺乏足够的危险信号来充分激活DC。共刺激信号的诱导通常通过激活模式识别受体（PRR）或C型凝集素信号通路实现18,19,20,21。另一种激活DC的策略是利用其通过表面Fcγ受体（FcγR）与抗原相互作用而摄取抗原的能力。事实上，已有若干重要文献表明，在预防性条件下，将来源于骨髓前体细胞并经肿瘤-IgG免疫复合物激活的MoDC注射入体内，不仅可以抑制肿瘤生长，还可实现对已形成肿瘤的根除22,23。

在最近发表的两篇论文中，Carmi et al. 发现，与骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和脾脏树突状细胞不同，来自血液和肿瘤的单核细胞来源树突状细胞（MoDC）在缺乏额外刺激的情况下无法对IgG免疫复合物（IC）产生应答。该现象被证实是由于细胞内存在高水平的酪氨酸磷酸酶，从而调控FcγR信号通路24,25。该研究通过定义树突状细胞中的一个关键检查点，为基于树突状细胞疫苗的成功接种条件提供了重要见解。需要额外刺激才能启动FcγR信号通路，以及可能依赖类似磷酸化级联反应的其他凝集素受体的信号传导，因此强调了在分离树突状细胞过程中应避免其过早活化的必要性。

因此，本方案描述了从血液和肿瘤中分离单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的方法，这些细胞与骨髓和脾脏来源的树突状细胞存在显著差异，并强调了操作过程中值得重视的注意事项。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

以下方案涉及小鼠 MoDC 的分离，但其总体原则也可能适用于其他 DC 亚群细胞。12 至 16 周龄的 C57Bl/6j 小鼠饲养于经美国实验动物照护与使用认证协会（American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care）认证的动物实验设施中。所有实验方案均经斯坦福大学和特拉维夫大学机构动物照护与使用委员会批准。

1. 肿瘤相关单核细胞来源树突状细胞的分离

  1. 在超净工作台中，将肿瘤从 CO 中取出2 处死小鼠并将肿瘤置于不含胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。
    注意：建议在取肿瘤前将小鼠剃毛并用70%乙醇喷洒，以尽量减少毛发可能带来的污染。务必确保肿瘤直径不超过25 - 40 mm2 由于较大的肿瘤中树突状细胞（DC）数量较少，且这些细胞往往较为脆弱，容易发生细胞死亡。如果需要获得更多的DC，可将肿瘤细胞接种于每只小鼠的多个位点。
  2. 在无菌超净工作台中，使用手术剪将肿瘤组织剪切成小块（约 1 x 1 mm）2).
    1. 将一只小鼠的全部肿瘤碎片加入含有磁力搅拌子的30 mL无菌平底管中，管内含5 mL Hank平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL胶原酶IV和0.01 mg/mL DNase I。
      注意：髓系细胞即使在稳态下也通过糖酵解产生能量。因此，只能使用含葡萄糖的培养基（如 HBSS、RPMI 和 DMEM），因为葡萄糖剥夺仅 10–15 分钟即可导致细胞在 24 小时内发生死亡和凋亡。务必使用低内毒素的胶原酶 IV，因为胶原酶由革兰氏阳性菌产生艰难梭菌（Clostridium histolyticum）.
  3. 在37℃下以约200 - 400 rpm搅拌 o在含磁力搅拌器的C培养箱中孵育20-30分钟。
  4. 加入5 mL完全培养基，充分重悬。
  5. 通过70 µm细胞筛过滤细胞，4 ℃下离心 o400 rcf 离心 5 - 10 分钟，使细胞沉淀。
    注意：酶消化后请勿直接尝试分离细胞，因为某些肿瘤存在坏死，含有相对大量的细胞碎片或细胞外基质。应将细胞置于15%密度梯度介质中，以获得纯净的细胞。
  6. 将9 mL密度梯度介质与1 mL 10×PBS混合以调节渗透压，制备100% Percoll储存液。取1.5 mL密度梯度介质储存液与8.5 mL HBSS混合，并与肿瘤来源的细胞沉淀充分混匀。在15%密度梯度介质上方轻柔铺加2 mL DMEM，于室温下以400 rcf离心20分钟。弃去上清液，细胞将形成沉淀位于离心管底部。
    1. 将沉淀的细胞用含有2% FBS、1%青霉素/链霉素和10 mM EDTA的10 mL HBSS（分离缓冲液）重悬，洗涤两次，每次在4℃下离心 o400 × g 离心 5–10 分钟以沉淀细胞。
    2. 使用血细胞计数板在光学显微镜下利用台盼蓝对细胞进行计数。
  7. 重悬 1 × 108 1 mL 分离缓冲液中重悬细胞，并在 4 ℃ 下孵育 oC，加入30 μL CD11b+ 结合磁珠15分钟。
    注意：避免使用CD11c偶联磁珠，因其会激活树突状细胞并诱导细胞死亡。切勿尝试用抗CD16/32抗体阻断FcγRII和FcγRIII。阻断性抗体会与FcγR结合，引发MAP激酶的强烈磷酸化，并使树突状细胞致敏。
    1. 加入 9 mL 分离缓冲液，去除未结合的磁珠，于 4 ℃ 以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟oC.
  8. 吸弃上清液，将细胞重悬于1 mL分离缓冲液中。将细胞上样至预清洗的磁性柱中。用3 mL分离缓冲液洗涤磁柱两次。
    1. 将柱子从磁铁上取下。用移液器将6 mL分离缓冲液加到柱子上，推动活塞，将磁标记细胞冲洗至无菌收集管中。在4℃下以400 rcf离心5–10分钟 oC.
    2. 以每 1 × 10⁶ 个细胞 100 μL 重悬细胞7 细胞并用以下荧光染料标记的抗体染色：谱系阴性（TCRb、Siglec F、B220、CD19、FceRI） 和 Ly6G） MHCII，Ly-6C
  9. 通过侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）圈选小细胞，并在添加了5 ng/mL GM-CSF的完全培养基中培养。将细胞在37℃孵育1小时。 oC，以使巨噬细胞贴壁。随后，将未贴壁的松散非黏附细胞转移至新的培养皿中。
    注意：小鼠 MoDC 定义为 CD11b+/CD11c+/MHCII你好/Ly6Clo/int 7,26,27Ly6C 的表达在不同肿瘤模型之间可能存在显著差异，在某些模型（例如 LMP）中，单核细胞来源的树突状细胞完全不表达 Ly6C。总体而言，一个 100 mm3 B16F10 肿瘤通常含有 5 x 104 的DC，得到约4 - 5 x 106 总细胞中，免疫细胞占10-15%，其中MoDC占8-10%。通过在多个位点接种肿瘤细胞可增加DC数量。分选时仅选择小颗粒SSC/FSC细胞，因为其他髓系细胞也可能表达CD11c和Ly6C等标志物。 
    可选：根据小的SSC/FSC特征及表达Ly6C，分选肿瘤浸润的单核细胞你好 且MHCII呈阴性。随后，培养单核细胞 体外 加入50 ng/mL GM-CSF以获得树突状细胞（DC）。

2. 从外周血中分离单核细胞来源的树突状细胞

注意：由于成熟的小鼠树突状细胞（MoDCs）在小鼠血液中相对稀少，以下方案描述的是其衍生方法 体外 从分选的单核细胞中。

  1. 为了提高血液中单核细胞的水平，使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并在皮下（s.c.）注射 1 μg 的 GM-CSF 溶于 50 μL PBS 中。
  2. 1–2 小时后，使用 CO2 处死小鼠。
    注意：不要采用颈椎脱位法处死小鼠，因为这会导致内出血。
  3. 安乐死后立即用 70% 乙醇喷洒小鼠，在无菌超净工作台中使用手术剪剪除覆盖心脏的皮肤。用乙醇清洁剪刀后剪开右心房。使用 10 mL 注射器和 25 号针头，通过右心室缓慢灌注 20 mM EDTA 的 HBSS 溶液冲洗心脏。
    1. 用无菌注射器从胸膜腔中抽取血液，收集至含有肝素硫酸盐和 EDTA 的无菌试管中。持续灌注心脏，直至肝脏和肺部变为粉红色或白色。
  4. 将血液加至密度梯度介质上，于室温下以 400 rcf 离心 15 分钟，刹车设置为低档。
    注意：使用无内毒素的密度梯度介质（通常每毫升内毒素含量低于 0.12 EU）。
    1. 将单个核细胞收集至新试管中。用 10 mL 含 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 10 mM EDTA 的 HBSS（分离缓冲液）重悬细胞进行洗涤，然后在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟，使细胞沉淀。
      注意：仅使用葡萄糖含量至少为 1 g/L 的培养基。
  5. 对于 CD11b 阳性筛选，将 1 × 108 个细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中，在 4 oC 下与 50 μL CD11b 偶联磁珠孵育 15 分钟。
    1. 加入 9 mL 分离缓冲液洗涤未结合的磁珠，在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中。按照制造商说明书，将细胞上样至预清洗的磁性分离柱中。
    2. 将分离柱从磁架上取下，用移液器加入 6 mL 分离缓冲液，并推动推杆将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5–10 分钟。用 3 mL 分离缓冲液洗涤分离柱两次。
    3. 将细胞重悬于 1 × 107 个细胞/100 μL 分离缓冲液中，并使用以下荧光素偶联抗体进行染色：每 1 × 106 个细胞加入 0.1 μg CD115、0.25 μg MHCII 和 0.1 μg Ly-6C。
  6. 通过设门选择侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）较小的细胞进行分选。
    注：小鼠炎症性单核细胞通常定义为 CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Chi，而巡逻型单核细胞定义为 CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5。当无需区分这两个亚群时，可分选总的 SSClo/FSClo/CD115+/MHCIIlo 细胞。在正常小鼠和荷瘤小鼠中，每 1 mL 血液中约含有 5–8 × 104 个 MoDC，注射 GM-CSF 后可增至 4–5 × 105 个 MoDC。其中约 70% 为炎症性单核细胞，30% 为巡逻型单核细胞。
  7. 将细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的浓度接种于补充了 20 ng/mL GM-CSF 的完全培养基中。培养 1 天后，将非贴壁和松散贴壁的细胞转移至新培养板，继续培养 4–5 天。
    注意：树突状细胞培养基中不应添加丙酮酸钠。

3. 肿瘤-IgG 免疫复合物的制备

  1. 在完全 DMEM 培养基中，将肿瘤细胞于 75 cm2 培养瓶中培养至 70% 汇合度。
    1. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 以使细胞从培养瓶中脱落，并在光学显微镜下监测细胞形态，避免过度消化。
    2. 每 2 mL 胰蛋白酶加入 8 mL 完全培养基以抑制胰蛋白酶消化作用，然后在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟以收集细胞。
      注意：必须使用商用 PCR 试剂盒检测肿瘤细胞中是否存在Mycoplasma。使用Limulus Amebocyte Lysate（LAL）试验检测革兰氏阴性菌和真菌内毒素的存在28。血清必须经 0.22 μM 滤膜过滤，并检测是否含有联邦法规 9 项病毒。此外，将 100–200 μL 培养基或血清滴加至 LB 琼脂或肉汤中，在 37 oC 培养 2 天进行检测。
    3. 用 10 mL PBS 重悬细胞以去除残留的胰蛋白酶和血清，在 400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。吸除上清液，并重复洗涤两次。
  2. 在室温下用 1.8% 缓冲的多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
    1. 用 10 mL PBS 重悬细胞进行洗涤，在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。
    2. 吸除上清液，并重复洗涤两次。
      可选步骤：对于肿瘤摄取实验，可将细胞在含 1 μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的 PBS 中于 37 oC 孵育 5 分钟进行标记。随后在冰上用完全培养基淬灭 CFSE 10 分钟。应用含 2% 血清的 PBS 对细胞进行充分洗涤，以去除残留染料。
  3. 将细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 2% FCS 和 5 mM EDTA 的 PBS）中，并加入 0.5 μg/mL 抗 CD16/32 抗体，以阻断潜在的非特异性蛋白-蛋白相互作用。以每 100 μL 含 1 × 105 个细胞的浓度接种至 U 型 96 孔板中。
    1. 加入不同稀释浓度的肿瘤结合抗体，范围为每 1 × 105 个细胞 5 μg 至 5 ng。将板置于冰上孵育 15–20 分钟。
      注意：IgG 抗体从未经处理的 20–24 周龄雌性小鼠血清中提取，通过蛋白 A 柱纯化获得，方法如文献所述24。
  4. 每孔加入 150 μL PBS 洗涤细胞，然后在 4 oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。
    1. 弃去上清液，重复洗涤两次。将细胞重悬于含荧光素标记的二抗的 100 μL FACS 缓冲液中。将板置于冰上孵育 20 分钟。
    2. 每孔加入 200 μL FACS 缓冲液洗涤细胞，在 400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。
    3. 通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的最低抗体浓度。
      注意：与同型对照相比，若抗体未能使染色肿瘤细胞的平均荧光强度（MFI）至少增加五倍，则不应在后续功能实验中使用。

4. 使用肿瘤-IgG 免疫复合物激活 MoDC

  1. 按照第 3.1 至 3.4.3 节所述，用最低浓度的 IgG 包被肿瘤细胞。
    1. 在用肿瘤免疫复合物（IC）激活 MoDC 的前一天，更换含有 GM-CSF 的 MoDC 培养基。操作时，轻柔吸除培养基，并用预热的完全培养基洗涤细胞一次。
      注意：分选后，分离得到的成熟肿瘤相关 MoDC 应在不含 GM-CSF 的完全培养基中培养至少 2 - 3 小时（或过夜），然后再用 IC 激活。
    2. 进行肿瘤摄取分析时，将 CFSE 标记的肿瘤 IC 以 1:5（IC:MoDC）的比例加入 MoDC 中，每 1 × 106 个 DC 使用 1 mL 完全培养基，于 12 - 16 小时内过夜孵育。
    3. 进行 MoDC 激活实验的流式细胞术（FACS）分析时，以 1:1（IC:MoDC）的比例加入肿瘤 IC，并过夜孵育 12 - 16 小时。
      注意：强烈建议设置阳性对照孔，其中 MoDC 使用 1 μg/mL 的 LPS 或其他 TLR 激动剂进行刺激。
    4. 过夜激活后，吸除上清液，并用分离缓冲液或 10 mM EDTA HBSS 轻柔洗涤细胞三次。
    5. 为使 DC 从培养板上脱落，将细胞在含有 10 mM EDTA 的 1 mL HBSS 中孵育 2 - 3 分钟，并通过剧烈吹打使细胞脱落。
    6. 以 400 rcf 离心细胞，将 1 × 106 个 DC 重悬于 90 μL 含 2% FCS 和 5 mM EDTA 的 PBS（FACS 缓冲液）中，并加入 0.5 μg 阻断抗体。冰上孵育 5 - 10 分钟。
    7. 向细胞中加入 10 μL 染色抗体混合物，冰上孵育 15 分钟。
    8. 向细胞中加入 2 mL FACS 缓冲液，并在 4 oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。
  2. 将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。
    1. 在上机检测前 1 - 2 分钟加入 0.5 - 1 μg/mL 的 DAPI，以排除死细胞。DAPI 孵育时间不宜过长，因为 MoDC 会在 10 - 15 分钟内摄取 DAPI。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们首先比较了来自未经免疫的同系和异系小鼠的抗体与肿瘤细胞结合的能力。为此，将B16F10和LMP肿瘤细胞系用多聚甲醛固定并充分洗涤。B16F10是一种黑色素瘤细胞系，最初分离自C57Bl/6小鼠的肺转移灶。LMP是一种胰腺肿瘤细胞，源自KrasG12D/+、LSL-Trp53R172H/+和Pdx-1-Cre小鼠，并可在129F1小鼠中稳定生长。为获得免疫复合物（IC），将肿瘤细胞在冰上与抗体孵育20分钟 2 μg 每1×10⁶个同基因型或异基因型IgG5 肿瘤细胞。IgG和IgM抗体从20-24周龄未免疫小鼠的循环血液中通过蛋白A分离，随后按所述方法进行尺寸排阻色谱纯化24细胞随后被洗涤，并用PE标记的鼠抗小鼠IgG二抗染色，通过流式细胞仪分析平均荧光强度。如图所示 图1A，来自C57Bl/6同种异体小鼠的IgG抗体结合LMP肿瘤细胞 离体 比来自129S1同系小鼠的抗体效果强得多。类似地，用129S1异系IgG对固定的B...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

由于小鼠疫苗接种所需的树突状细胞（DC）数量较大（每只小鼠约需 2–4 × 106 个 DC），大多数小鼠疫苗接种策略均基于从小鼠骨髓（BM）和脾脏中分离 DC，随后进行体外（ex vivo）激活。然而，尝试在体内（in vivo）使用相同条件激活肿瘤相关 DC 时，往往难以诱导有效的免疫应答。Carmi et al. 在相继发表的两篇论文中发现，血液和肿瘤中的单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）与脾脏及骨髓来源的 DC 存在显著差异：前者天然具有较高的酪氨酸磷酸酶本底水平，因此在使用 IC24,25 激活前需要预先启动。此外，这些结果进一步强调了采取额外预防措施的必要性，以维持 DC 处于更接近其生理状态的激活水平。因此，本实验方案旨在详细描述从肿瘤组织和外周循环中分离 MoDC 的操作流程，并重点指出可能导致其过早激活的关键步骤。

首先，为了从血液和肿瘤中获得足够数量的树突状细胞（DC）...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者声明均无利益冲突，且无任何需要披露的内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep 单核细胞分离试剂盒StemCell Technologies19861
胶原酶 IVSigmaC9697-50MG每批次均需检测内毒素
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071每批次均需检测内毒素
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

参考文献

  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165(2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

免疫复合物激活肿瘤细胞分离血细胞分离磁珠分离密度梯度离心流式细胞术分析CD11b细胞筛选CFSE标记肿瘤复合物树突状细胞激活
小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。