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脂多糖处理小鼠肝脏中免疫反应期间白细胞的双光子活体成像

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DOI：

10.3791/57191

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2018年2月6日

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种用于活体小鼠肝脏双光子成像的新型微创手术方案。利用该技术，我们揭示了脂多糖诱导的内毒素血症期间肝脏的精细结构。我们预计该方法可用于评估不同试剂治疗对肝内白细胞迁移的有效性。

摘要

脓毒症是一种可导致器官衰竭和组织损伤的严重感染类型。尽管与脓毒症相关的死亡率和发病率极高，但目前尚无针对其器官相关机制的实时深入研究。肝脏是人体内处理毒素和感染的关键器官。本研究旨在通过建立内毒素血症小鼠模型，对小鼠肝脏进行活体成像，以追踪中性粒细胞和肝包膜巨噬细胞（LCMs）等免疫细胞的运动情况。为此，我们设计了一种新型微创手术方法，用于暴露小鼠肝脏。通过腹腔注射常用内毒素脂多糖（LPS）诱导小鼠内毒素血症。利用该新型手术暴露方法结合活体成像技术，我们发现，在LPS处理的LysM-绿色荧光蛋白（GFP）小鼠肝脏中，中性粒细胞的募集较磷酸盐缓冲液处理组明显增加。随着LPS处理时间的延长，中性粒细胞数量显著上升。此外，通过使用CX3Cr1-GFP小鼠，我们成功实现了对肝脏定居巨噬细胞——肝包膜巨噬细胞（LCMs）的可视化观察。因此，该方法可用于评估新型试剂调控免疫细胞迁移能力的有效性 体内确定中性粒细胞和肝脏驻留巨噬细胞（LCMs）在肝脏中的运动能力与形态特征，可能有助于我们识别脓毒症中白细胞活化所导致的器官衰竭和组织损伤的治疗效应。

引言

肝脏是哺乳动物的主要代谢器官，它在能量、激素调节和解毒过程中起着控制中心的作用1。由于其重要性，研究人员已开展了大量体外（in vitro）和体内（in vivo）实验，以阐明肝脏在炎症过程中的变化。活体显微技术已被用于获取肝脏的实时图像2。事实上，目前已提出多种肝脏成像方法2,3,4,5,6。然而，为了建立一种更为简化的手术方法，并实现对目标器官及免疫细胞的稳定观察，我们设计了一种简便的实验方案，可指导研究人员最大限度地减少活体成像所需的操作难度和工作量。

在本研究中，我们介绍了一种稳定且新颖的成像腔室及手术技术，可用于减少出血和可能的感染。我们证实肝脏在超过2小时的时间内保持完整。利用该方法，我们成功识别了脓毒症条件下肝内巨噬细胞（LCMs）7和中性粒细胞的形态。由于该方法可最大限度地减少手术过程中诸如震颤和意外炎症等物理与生物学混杂因素，我们预期该方法可用于观察肝脏免疫细胞对LPS等试剂刺激所产生的急性反应。

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方案

所有操作均按照韩国延世大学医学院机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用8至12周龄的LysM-绿色荧光蛋白（GFP；gfp/+）小鼠8和CX3Cr1-GFP（gfp/+）9小鼠进行活体成像。 所有手术器械均经高压灭菌，并用70%酒精消毒。

1. 定制小鼠肝脏成像腔室及其配套工具

  1. 小鼠肝脏成像腔室设计
    1. 制作用于小鼠肝脏成像的腔室，尺寸如下（图1）：内腔室（120 mm 长 × 160 mm 宽 × 30 mm 高），外腔室（100 mm 长 × 100 mm 宽 × 24 mm 高），螺栓（Ф 3 mm × 30 mm 高），螺母（Ф 4 mm）和翼形螺母（Ф 4 mm）。
    2. 按1:9的比例称取固化剂与弹性体基质，共配制120 g硅胶。
    3. 将液态硅胶混合物倒入250 mL锥形瓶中，充分混合。然后将锥形瓶放入干燥器中，通过泵抽真空约1小时以去除气泡。
    4. 将液态硅胶混合物倒入定制的小鼠腔室中，高度约为10 mm，静置数天使其固化（图1A）。
  2. 盖玻片与肝脏固定床的制备
    1. 在金属框架上使用硅胶粘合剂固定盖玻片，室温下干燥1天（图1B）。
    2. 为有效容纳浸水物镜所需的蒸馏水，必须构建半永久性的防水结构。使用直径1 mm的圆形硅胶密封条，并过夜固化。
    3. 混合固化剂与弹性体基质，然后将其倒入6孔板中，高度约为8–10 mm。按照步骤1.1.2–1.1.4所述进行固化处理。

2. LPS 的制备

  1. 准备无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS），用于稀释伤寒沙门菌肠炎血清型（Salmonella enterica serotype enteritidis）的LPS粉末。（1× PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）。
  2. 将PBS在37 °C水浴中预热，并小心打开LPS粉末瓶（25 mg）。
  3. 使用移液器辅助装置，将无菌PBS（5 mL）倒入LPS粉末瓶中，轻轻搅拌或悬浮以制备储备液。
    注意：LPS粉末溶解后，剧烈涡旋会产生气泡。在分装至1.5 mL离心管时应避免产生气泡，以尽量减少样品损失。
  4. 将LPS储备液储存于−20 °C，并将其稀释为1 mg/mL的LPS注射液。
  5. 使用1 mL注射器，将1 mg/mL的LPS溶液（20 mg/kg）注射入未麻醉小鼠的腹腔内。对照组动物注射等体积的PBS。
  6. 等待2小时，以获得充分的炎症反应。

3. 制备Texas-Red葡聚糖以染色血管

  1. 准备两个15 mL的锥形管和10 mL无菌PBS。
  2. 将Texas-Red Dextran粉末（25 mg）溶于3 mL PBS中，充分混匀。将混合液转移至一个空的15 mL锥形管中。
  3. 将剩余的PBS（7 mL）转移至含有葡聚糖混合液（3 mL）的15 mL锥形管中。
  4. 将一个0.45 µm的针筒滤器连接至10 mL针筒的前端，替代针头。
  5. 过滤葡聚糖混合液（10 mL），推动针筒时应保持力度均匀，避免洒漏。
  6. 将500 µL浓度为2.5 mg/mL的葡聚糖溶液分装至避光的1.5 mL离心管中，于−20 °C保存。解冻后置于4°C保存。

4. 手术过程

  1. 手术前使用 70% 酒精对手术台及所有器械进行消毒。然后准备好肝脏手术器械，并将加热板调节至 37 °C（图 2A，B）。
  2. 麻醉时，通过腹腔注射给予小鼠 30 mg/kg 的替来他明/唑拉西泮 和 10 mg/kg 的赛拉嗪。这些溶液可混合并在 PBS 中稀释后同时注射。通过轻压小鼠脚趾确认麻醉效果，当无反射反应时进行下一步操作。
  3. 涂抹少量眼膏以防止小鼠视网膜干燥。
  4. 使用 脱毛膏去除腹部区域的体毛（图 2C）。
  5. 使用胰岛素注射器通过尾静脉或眶后注射注入 200 µL 德州红葡聚糖溶液（浓度为 2.5 mg/mL）（图 2D）。
  6. 用记号笔标记右侧肋下区域，划线应从剑突延伸至肋骨末端。用镊子和剪刀剪开表皮（图 2E，F）。
  7. 使用显微剪刀和镊子打开腹腔，小心暴露肝脏。应用棉签轻轻将左外侧叶翻出（图 2G，H）。
  8. 向腹腔内加入 500 µL 无菌 PBS，以防止肝脏干燥。
  9. 将小鼠置于定制腔室中，呈右侧卧位，并在硅胶基底上涂抹少量组织胶。然后使用棉签小心地将肝脏固定（图 2I）。
    注意：由于肝组织极为脆弱，切勿机械性牵拉肝脏。应使用棉签轻柔地将其翻出。
  10. 数秒后，再次用 500 µL 无菌 PBS 润湿肝脏，以防其干燥。将金属支架置于肝脏上，并用螺母牢固固定（图 2J）。

5. 使用双光子显微镜对肝脏进行活体成像

  1. 运行 ZEN 软件（Carl Zeiss）以开启激光器，将波长设置为 880 nm，并设置绿色和红色通道。根据荧光强度调整激光功率（图3A发射滤光片信息如下：绿色/Alexa488，500-550 nm；红色/Alexa555，575-610 nm。
  2. 将培养室置于成像载物台上，并将20倍水浸物镜靠近盖玻片。
  3. 将硅橡胶加热器固定在小鼠身体下方以维持其体温（图3B).
  4. 在金属支架上滴加500 µL蒸馏水，然后将物镜靠近肝脏图3C).
  5. 调整焦距并确定成像区域的深度和时间。
  6. 进行成像。
  7. 对于长期成像，注射半剂量的替来他明/唑拉西泮与赛拉嗪混合物  成像期间每小时一次 在此阶段，维持小鼠体温在37 °C至关重要。需始终密切观察小鼠，因为每只小鼠的麻醉时间存在差异。
    注意：该方法不适用于手术和成像后的恢复。我们在手术后立即人道处死小鼠。
  8. 每30分钟检查一次足底反射，以确保麻醉状态稳定。

6. 数据分析

  1. 打开数据分析软件 Volocity，然后将库中的原始数据导入该软件。
  2. 根据实际情况去除图像噪声，并截取图像快照。
    注意：为获得平滑的图像，可使用“精细”或“中值”滤波器。此外，可使用“对比度增强”功能使过暗或模糊的图像更清晰。
  3. 将编辑后的内容调整至 100% 适配，快照图像导出为 JPEG 或 TIFF 文件，视频导出为 AVI 文件。

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结果

设计了一种简单且非常稳定的成像腔室。腔室底部覆盖有硅胶，可防止小鼠身体和器官滑动。此外，由于硅胶具有适当的弹性，能够避免盖玻片压力所引起的组织损伤（图1A，C）。其次，使用对组织安全的胶水（Vet bond）将取出的肝脏固定在圆形硅胶基座上。该方法有助于避免由心跳或呼吸运动引起的颤动。最后，根据小鼠体型及肝脏突出位置，用螺栓和螺母固定金属盖玻片（图1B-D）。若麻醉操作得当，该成像设置可维持超过6小时。

手术开始前，将小鼠置于预设为37 °C的加热腔室内，以控制其体温（图2A）。接着，为防止继发感染，所有用于小鼠手术和成像的必要器械均使用70%酒精消毒和/或高压灭菌（

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讨论

由于肝脏功能的重要性，许多研究团队一直在积极研究肝脏3,10。例如，Heymann 等人提出了一种使用琼脂糖的精细方法。尽管该方法被证明具有很高的精确性，但琼脂糖凝固所需时间较长。然而，采用我们的方法，所有操作可在30分钟内完成，从而最大限度地减少了其他混杂因素的影响。其次，稳定肝脏极为重要，因为心跳可能干扰视频成像。为消除这一现象，我们将小鼠重新置于右侧卧位。

该方案中的另一个关键步骤是金属盖板框架的制作及其在金属杆上的定位。我们面临的最主要难题是如何根据肝脏的脆性，通过施加适当的压力来实现肝脏的固定。最初，仅使用蝶形螺母来固定盖玻片时，血液流动受到阻碍，且肝脏无法承受盖玻片的重量。为此，我们设计了一种方法：在放置盖玻片之前，先将螺栓沿金属杆旋下。由于盖玻片由螺栓支撑，从而为肝脏的厚度预留了一定空间，因此不会对肝脏施加过大的压力，同时仍能保持稳定和固定。通过使用LysM-GFP小鼠6，我们证实该设计可实现对肝窦和中央...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由韩国政府（MSIP）提供资金支持（项目编号：2016R1A2B4008199，项目负责人：Y-M. H.），以及由大韩民国保健福祉部（项目编号：HI14C1324）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
定制设计的腔室Live Cell Instruments定制尺寸
金属盖玻片Live Cell Instruments定制尺寸
盖玻片Electron Microscopy Sciences#72204-03
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒Dow Corning
锥形瓶DURAN21 216 36
细胞培养板（平底型）HYUNDAI Micro Co.H31006
干燥器ADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LAB用于制作半永久性坝
柔性硅橡胶加热器OmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
直流电源ToyotechDP30-03A
磷酸盐缓冲液自制
来自鼠伤寒沙门氏菌肠炎血清型的脂多糖（LPS）Sigma-AldrichL6011
德克萨斯红葡聚糖Thermo Fisher ScientificD1830
15 mL 高透明度聚丙烯
圆锥形管		FALCON14-959-49B
0.45 μm 滤膜（Minisart 注射器滤器）Sartorius16555k
1.5 ml 棕色微量离心管AxygenMCT-150-X用于避光
1 mL 注射器Korea VaccineKV-S01
3 mL 注射器Korea VaccineKV-S03
10 mL 注射器Korea VaccineKV-S10
0.3 mL 胰岛素注射器Becton Dickinson324900
脱毛膏 100 mLBody natur
棉签ABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
加热板Live Cell InstrumentsPH-S-10定制尺寸
直流控制器Live Cell InstrumentsCU-301
显微解剖剪刀Harvard Apparatus72-5418
剪刀RobozRS-5882
镊子RobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN 软件（黑版）Carl ZeissLSM 7 MP 程序
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocityPerkinElmer分析软件

参考文献

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
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  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
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  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

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