脂多糖处理小鼠肝脏中免疫反应期间白细胞的双光子活体成像

摘要

我们建立了一种用于活体小鼠肝脏双光子成像的新型微创手术方案。利用该技术，我们揭示了脂多糖诱导的内毒素血症期间肝脏的精细结构。我们预计该方法可用于评估不同试剂治疗对肝内白细胞迁移的有效性。

摘要

脓毒症是一种可导致器官衰竭和组织损伤的严重感染类型。尽管与脓毒症相关的死亡率和发病率极高，但目前尚无针对其器官相关机制的实时深入研究。肝脏是人体内处理毒素和感染的关键器官。本研究旨在通过建立内毒素血症小鼠模型，对小鼠肝脏进行活体成像，以追踪中性粒细胞和肝包膜巨噬细胞（LCMs）等免疫细胞的运动情况。为此，我们设计了一种新型微创手术方法，用于暴露小鼠肝脏。通过腹腔注射常用内毒素脂多糖（LPS）诱导小鼠内毒素血症。利用该新型手术暴露方法结合活体成像技术，我们发现，在LPS处理的LysM-绿色荧光蛋白（GFP）小鼠肝脏中，中性粒细胞的募集较磷酸盐缓冲液处理组明显增加。随着LPS处理时间的延长，中性粒细胞数量显著上升。此外，通过使用CX3Cr1-GFP小鼠，我们成功实现了对肝脏定居巨噬细胞——肝包膜巨噬细胞（LCMs）的可视化观察。因此，该方法可用于评估新型试剂调控免疫细胞迁移能力的有效性 体内确定中性粒细胞和肝脏驻留巨噬细胞（LCMs）在肝脏中的运动能力与形态特征，可能有助于我们识别脓毒症中白细胞活化所导致的器官衰竭和组织损伤的治疗效应。

引言

肝脏是哺乳动物的主要代谢器官，它在能量、激素调节和解毒过程中起着控制中心的作用¹。由于其重要性，研究人员已开展了大量体外（in vitro）和体内（in vivo）实验，以阐明肝脏在炎症过程中的变化。活体显微技术已被用于获取肝脏的实时图像²。事实上，目前已提出多种肝脏成像方法^2,3,4,5,6。然而，为了建立一种更为简化的手术方法，并实现对目标器官及免疫细胞的稳定观察，我们设计了一种简便的实验方案，可指导研究人员最大限度地减少活体成像所需的操作难度和工作量。

在本研究中，我们介绍了一种稳定且新颖的成像腔室及手术技术，可用于减少出血和可能的感染。我们证实肝脏在超过2小时的时间内保持完整。利用该方法，我们成功识别了脓毒症条件下肝内巨噬细胞（LCMs）⁷和中性粒细胞的形态。由于该方法可最大限度地减少手术过程中诸如震颤和意外炎症等物理与生物学混杂因素，我们预期该方法可用于观察肝脏免疫细....

方案

所有操作均按照韩国延世大学医学院机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用8至12周龄的LysM-绿色荧光蛋白（GFP；gfp/+）小鼠⁸和CX3Cr1-GFP（gfp/+）⁹小鼠进行活体成像。 所有手术器械均经高压灭菌，并用70%酒精消毒。

1. 定制小鼠肝脏成像腔室及其配套工具

1. 小鼠肝脏成像腔室设计
   1. 制作用于小鼠肝脏成像的腔室，尺寸如下（图1）：内腔室（120 mm 长 × 160 mm 宽 × 30 mm 高），外腔室（100 mm 长 × 100 mm 宽 × 24 mm 高），螺栓（Ф 3 mm × 30 mm 高），螺母（Ф 4 mm）和翼形螺母（Ф 4 mm）。
   2. 按1:9的比例称取固化剂与弹性体基质，共配制120 g硅胶。
   3. 将液态硅胶混合物倒入250 mL锥形瓶中，充分混合。然后将锥形瓶放入干燥器中，通过泵抽真空约1小时以去除气泡。
   4. 将液态硅胶混合物倒入定制的小鼠腔室中，高度约为10 mm，静置数天使其固化（图1A）。
2. 盖玻片与肝脏固定床的制备
   1. 在金属框架上使....

结果

设计了一种简单且非常稳定的成像腔室。腔室底部覆盖有硅胶，可防止小鼠身体和器官滑动。此外，由于硅胶具有适当的弹性，能够避免盖玻片压力所引起的组织损伤（图1A，C）。其次，使用对组织安全的胶水（Vet bond）将取出的肝脏固定在圆形硅胶基座上。该方法有助于避免由心跳或呼吸运动引起的颤动。最后，根据小鼠体型及肝脏突出位置，用螺栓和螺母固定金属盖玻片（图1B-D）。若麻醉操作得当，该成像设置可维持超过6小时。

手术开始前，将小鼠置于预设为37 °C的加热腔室内，以控制其体温（图2A）。接着，为防止继发感染，所有用于小鼠手术和成像的必要器械均使用70%酒精消毒和/或高压灭菌（

讨论

由于肝脏功能的重要性，许多研究团队一直在积极研究肝脏^3,10。例如，Heymann 等人提出了一种使用琼脂糖的精细方法。尽管该方法被证明具有很高的精确性，但琼脂糖凝固所需时间较长。然而，采用我们的方法，所有操作可在30分钟内完成，从而最大限度地减少了其他混杂因素的影响。其次，稳定肝脏极为重要，因为心跳可能干扰视频成像。为消除这一现象，我们将小鼠重新置于右侧卧位。

该方案中的另一个关键步骤是金属盖板框架的制作及其在金属杆上的定位。我们面临的最主要难题是如何根据肝脏的脆性，通过施加适当的压力来实现肝脏的固定。最初，仅使用蝶形螺母来固定盖玻片时，血液流动受到阻碍，且肝脏无法承受盖玻片的重量。为此，我们设计了一种方法：在放置盖玻片之前，先将螺栓沿金属杆旋下。由于盖玻片由螺栓支撑，从而为肝脏的厚度预留了一定空间，因此不会对肝脏施加过大的压力，同时仍能保持稳定和固定。通过使用LysM-GFP小鼠⁶，我们证实该设计可实现对肝窦和中央.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定制设计的腔室	Live Cell Instruments		定制尺寸
金属盖玻片	Live Cell Instruments		定制尺寸
盖玻片	Electron Microscopy Sciences	#72204-03
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning
锥形瓶	DURAN	21 216 36
细胞培养板（平底型）	HYUNDAI Micro Co.	H31006
干燥器	ADARSH	55204
High Q BOND SE 5 mL	BJM LAB		用于制作半永久性坝
柔性硅橡胶加热器	Omega	SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
直流电源	Toyotech	DP30-03A
磷酸盐缓冲液			自制
来自鼠伤寒沙门氏菌肠炎血清型的脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich	L6011
德克萨斯红葡聚糖	Thermo Fisher Scientific	D1830
15 mL 高透明度聚丙烯 圆锥形管	FALCON	14-959-49B
0.45 μm 滤膜（Minisart 注射器滤器）	Sartorius	16555k
1.5 ml 棕色微量离心管	Axygen	MCT-150-X	用于避光
1 mL 注射器	Korea Vaccine	KV-S01
3 mL 注射器	Korea Vaccine	KV-S03
10 mL 注射器	Korea Vaccine	KV-S10
0.3 mL 胰岛素注射器	Becton Dickinson	324900
脱毛膏 100 mL	Body natur
棉签	ABDI
Zoletil 50 5 mL	Virbac
Rompun 10 mL	Bayer
加热板	Live Cell Instruments	PH-S-10	定制尺寸
直流控制器	Live Cell Instruments	CU-301
显微解剖剪刀	Harvard Apparatus	72-5418
剪刀	Roboz	RS-5882
镊子	Roboz	RS-5137
Vet bond	3M	1469SB
ZEN 软件（黑版）	Carl Zeiss		LSM 7 MP 程序
LSM 7 MP	Carl Zeiss
Volocity	PerkinElmer		分析软件