利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

摘要

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。

摘要

将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为肝细胞样细胞（HLCs）的能力为研究肝脏代谢中的先天性错误提供了新的机会。然而，为了建立一个可用于筛选潜在治疗肝病小分子的平台，该方法需要一种能够兼容数千种化合物筛选的培养体系。本文介绍了一种在完全明确的培养条件下，于96孔组织培养板中可重复地将人iPSCs分化为肝细胞样细胞的实验方案。我们还展示了利用该平台筛选能够降低家族性高胆固醇血症患者来源的iPSC衍生肝细胞所产生的载脂蛋白B（APOB）的化合物的实例。这一适用于药物发现的平台的建立，将有助于研究人员发现治疗肝脏相关疾病的新疗法。

引言

成功发现可用于靶向罕见病的药物依赖于可用于筛选的检测方法的开发。基于假设或靶点的筛选（反向药理学）具有一定的应用价值，但需要对疾病的分子机制有深入的理解。表型筛选（经典药理学）则无需对生化通路有详尽的认知，而是依赖于能够准确模拟疾病病理生理学的模型的建立。尽管靶点导向的方法备受关注，但对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首创新药的分析表明，表型筛选的成功率远高于前者。 关键词：药物筛选，罕见病，反向药理学，经典药理学，表型筛选，靶点筛选，疾病模型，分子机制，首创新药，FDA批准¹该方法的总体目标是建立一个可用于高通量筛选的平台，以鉴定用于治疗代谢性肝病的小分子。多个 体外 已描述的模型包括原代肝细胞、肝癌细胞和肝前体细胞²然而，这些模型大多存在局限性，亟需开发能够在体外培养中准确模拟代谢性肝功能障碍病理生理过程的新模型。近年来，人类多能干细胞结合基因编辑技术为在体外模拟极为罕见的疾病提供了可能，且无需直接获取患者样本。³尽管使用患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）作为发现治疗罕见肝病小分子的工具在概念上是合理的，但目前仅有少数研究报告证实了该方法的可行性⁴然而，我们最近建立了一个利用诱导多能干细胞衍生的肝细胞的平台，成功筛选出可用于治疗肝脏代谢缺陷的可重新定位药物⁵.

本方案介绍了在96孔板中将人iPSCs分化为肝细胞样细胞的过程，并利用这些细胞筛选小分子文库的方法。同时，以高胆固醇血症为例，描述了代谢性肝病的终点分析。该方法可用于研究小分子在传染性肝病、代谢性肝病、药物毒性及其他肝脏疾病中的作用与应用。

方案

1. 人类诱导多能干细胞的培养

1. 包被重组人E-钙黏蛋白Fc融合蛋白（E-cad-Fc）或其他适用于人多能干细胞（hPSC）培养的基质⁶
   1. 用含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS (+)）将E-cad-Fc稀释至15 μg/mL。
   2. 在100 mm悬浮组织培养皿中加入5 mL稀释后的E-cad-Fc进行包被，并于37 ˚C孵育至少1小时。移除包被液，替换为5 mL培养基（例如，后续称为M-培养基的mTeSR1）⁷。
      注意：本实验方案所用培养基的配制依据已发表的方案⁷。然而，已有其他多种培养基配方被报道或可商业获得，可能也适用于本实验流程。
   3. 从液氮中取出一管冷冻保存的诱导多能干细胞（iPSCs），在37 ˚C水浴中解冻至仅剩微小冰晶。轻柔地将细胞吹打转移至含有4 mL M-培养基的无菌15 mL锥形离心管中。
   4. 以300 x g离心5分钟。弃去上清液，用5 mL添加了10 µM Y-27632（一种选择性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂）的培养基轻柔重悬细胞。
   5. 移除步骤1.1.2中的M-培养基，将步骤1.1.4中获得的5 mL细胞悬液转移至已包被E-cad-Fc的100 mm悬浮组织培养皿中。
2. 人iPSCs的培养维持
   1. 当iPSCs达到约80%融合度时，移除培养基，用无钙镁的DPBS (-)洗涤一次。吸除DPBS (-)，加入足量0.02% EDTA溶液覆盖培养皿表面，室温孵育最多3分钟。
      注意：在80%融合度时，培养皿中细胞数量约为2 x 10⁷个。应避免细胞过度生长，并确保细胞保持未分化形态。可通过干细胞标志物Tra-1-60染色或等效方法检测细胞的多能性⁸。
   2. 一旦细胞开始脱落，立即移除0.02% EDTA溶液，并加入10 mL M-培养基充分冲洗培养皿以释放细胞。通过轻柔吹打辅助iPSC脱离。
      注意：细胞脱落的平均孵育时间约为3分钟，但需根据每种iPSC系的经验确定最佳时间。细胞应以小细胞团形式释放，每个团块包含约5–10个iPSCs。
   3. 将悬浮细胞的1/10转移至新的E-cad-Fc包被的100 mm悬浮组织培养皿中，每皿含5 mL M-培养基。将培养物置于37 ˚C、4% O₂/5% CO₂条件下培养，并每日更换培养基。
      注意：尽管通常在生理氧浓度条件下培养iPSCs以促进其多能性维持，但iPSCs也可在常氧条件下生长。

2. 在96孔板上将人iPSC分化为肝细胞样细胞

注意： 本部分描述了一种适用于筛选的iPSC分化方案。采用该方法，可在20天内诱导人iPSC分化并形成肝细胞样细胞。尽管此周期适用于大多数检测，但可延长培养时间以提高细胞的成熟度。

1. 用生长因子减少型基底膜基质包被96孔组织培养板
   1. 通过将基质用预冷的无菌DMEM/F12组织培养基稀释至2 mg/mL来制备储备液。将基质分装为250 μL每份，于-80 ˚C保存备用。将10 mL DMEM/F12置于冰上预冷30分钟。取一份250 μL的2 mg/mL基质储备液，于冰上解冻。
   2. 将基质与10 mL冷的DMEM/F12混合，使用预冷的移液管轻轻混匀，使终浓度为0.05 mg/mL。
   3. 将100 μL稀释后的基质转移至96孔组织培养板的每个孔中。在37 ˚C、4% O₂条件下孵育。₂/5% CO₂₂ 至少 1 小时。弃去基质，每孔加入 50 μL M 培养基。于 37 °C、4% O₂ 条件下保存₂/5% CO₂₂ 直到需要时
2. 铺板细胞以进行分化
   1. 将iPSCs在100 mm培养皿中培养至细胞汇合度接近80%。确保培养皿中的细胞数量约为2 × 10⁶⁷ 细胞。使用流式细胞仪或血细胞计数板确定细胞数量。
      注意： 随着经验积累，可通过显微镜评估iPSC细胞的质量；然而，在通过FACS或免疫染色检测时，接近98%的细胞应表达多能性标志物，如TRA-1-60表位。细胞需保持活跃分裂状态，避免过度生长。
   2. 从每个100 mm培养皿中收获iPSC时，吸除培养基，并用5 mL DPBS (-) 洗涤一次。弃去洗涤液后，加入3 mL细胞解离溶液（例如，accutase）在37 °C、4% O₂条件下孵育约2分钟₂/5% CO₂₂.
      注意： 通过显微镜观察细胞脱落情况至关重要。使用accutase消化时切勿过度，目标是在最小处理条件下以小细胞簇的形式释放细胞。
   3. 一旦细胞开始脱落，立即加入7 mL M-培养基进行收集。反复吹打数次，将细胞集落解离为含有约3–6个细胞的小型细胞簇。图1A).
   4. 将iPSCs收集至15 mL无菌离心管中，以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL M-培养基中。
   5. 将细胞均匀分配至96孔基质包被板中，每孔加入50 μL悬浮细胞。每块96孔板使用一块约80%融合度的100 mm iPSC培养板，其细胞数量约为5 x 10⁶ 细胞以启动分化。使用多通道移液器可加快此过程。将细胞在37 ˚C、4% O₂条件下培养过夜。₂/5% CO₂₂.
      注意： 确保每个孔中接种的细胞数量相等，对于实现可重复的分化至关重要。
3. 诱导细胞分化
   1. 在显微镜下检查96孔板，确保细胞覆盖每个孔表面至少70%的区域。若覆盖率低于70%，则更换为新鲜培养基，并在37 ˚C、4% O₂条件下继续孵育24小时。₂/5% CO₂₂.
      注意： 接种细胞后若未诱导分化而培养超过48小时，通常会降低分化效率。尽管在常氧条件下也可发生分化，但其效率可能受到影响。.
   2. 从分化第1天到第2天，将培养基更换为添加有2% B27（不含胰岛素）、100 ng/mL Activin A、10 ng/mL BMP4和20 ng/mL FGF2的RPMI培养基。每孔加入100 μL培养基，于37 ˚C、常氧O₂条件下培养₂/5% CO₂₂ 每天更换培养基，持续2天。
      注意： 处理大量96孔板时，需使用辅助移液器或机器人。12通道和96通道移液器非常适合日常的培养基更换。
   3. 从分化第3天至第5天，将培养基更换为添加有2% B27（不含胰岛素）和100 ng/mL Activin A的RPMI培养基。在37 ˚C、常氧O₂条件下培养细胞₂/5% CO₂₂ 每天更换培养基，持续3天。
   4. 在分化第5天，更换新鲜培养基前，每孔加入100 μL 0.02% EDTA溶液处理30秒，随后吸除并更换为新鲜培养基。
      注意： 如果向内胚层的分化效率较高，正在分化的细胞单层容易从培养板上脱落。用0.02% EDTA溶液进行短时间处理有助于减轻细胞脱落，该处理不影响向肝细胞的分化。
   5. 在第6至10天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL BMP4和10 ng/mL FGF2的RPMI/2% B27（含胰岛素），于37 ˚C、4% O₂条件下培养₂/5% CO₂₂ 连续5天每天更换培养基。此阶段可诱导细胞分化为肝前体细胞。
   6. 在第11至15天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL HGF的RPMI/2% B27（含胰岛素）培养基。在37 ˚C、4% O₂条件下培养。₂/5% CO₂₂ 连续培养5天，每天更换培养基。
   7. 在第16至20天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL Oncostatin-M（OSM）的肝细胞培养基（HCM）。将细胞置于37 ˚C、常氧O₂/5% CO₂₂ 每天更换培养基，持续5天。
      注意： 通过ELISA法检测各孔中培养基分泌的白蛋白（Albumin）、甲胎蛋白（AFP）或载脂蛋白B（APOB）的相对水平，可有效评估个体孔间分化的可重复性（参见3.2）。

3. 小分子筛选

注意： 以下描述了用于鉴定可降低家族性高胆固醇血症诱导多能干细胞（iPSCs）来源的肝细胞样细胞培养基中载脂蛋白B（APOB）水平的化合物的实验步骤。该模型及其在降胆固醇药物筛选中的应用此前已有详细描述^5,9。在本示例中，筛选了来自南卡罗来纳化合物库（SC³）的1,000种化合物，每种化合物的测试浓度均为2 μg/mL。

1. 小分子处理iPSC来源的肝细胞
   1. 将母液化合物库稀释，制备工作储备液板，使化合物浓度为20 μg/mL，溶于2% DMSO中，并于-20 ˚C保存。
   2. 准备足够数量的96孔板iPSC来源肝细胞，以便对每种化合物进行测试。
      注意：待筛选化合物的数量将决定所需96孔板的数量。通常，每种化合物应准备一个孔，另需额外孔用于对照样本。为减少边缘效应可能带来的数据干扰，通常避免使用板的最外层孔。可通过z分数法识别阳性结果，无需设置重复孔；若设置重复孔，则更适合采用t检验。
   3. 在分化完成时（第20天，参见2.3.7），更换培养基为100 μL新鲜HCM ，并添加20 ng/mL Oncostatin-M。于37 ˚C、4% O₂/5% CO₂条件下精确孵育24小时。将培养基转移至新的96孔板中，于-20 ˚C保存。此样本用于测定加药前培养基中APOB的水平。
   4. 向每孔加入90 μL新鲜HCM，补充20 ng/mL Oncostatin-M。通过移液混匀后，向各孔加入10 μL工作储备液中的相应化合物。对照孔中加入DMSO至终浓度0.2%，以匹配处理组的DMSO浓度，并于37 ˚C、常氧O₂/5% CO₂条件下精确孵育24小时。收集培养基并储存于-20 ˚C。此样本用于测定化合物处理后APOB的水平。
   5. 可选步骤——剩余细胞可用于免疫染色、细胞活力检测或采用标准方法进行mRNA水平分析。
      注意：本筛选旨在鉴定对APOB水平具有快速作用的药物。然而，根据疾病模型、下游检测或药物作用机制的不同，可能需要对样本进行多天处理更为合适。
2. 通过ELISA测定APOB水平
   1. 使用人APOB ELISA开发试剂盒，按照制造商提供的操作说明，测定加药前和加药后样本中的载脂蛋白B（APOB）浓度。
   2. 配制以下溶液
      1. 洗涤缓冲液：含0.05% Tween 20的PBS，pH 7.4。4 ˚C保存至使用。
      2. 孵育缓冲液：含0.05% Tween 20和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，pH 7.4。4 ˚C保存至使用。
   3. 将APOB（mAB 20/17）抗体用PBS（pH 7.4）稀释至2 µg/mL，每孔加入100 μL稀释后的抗体，于4 ˚C孵育过夜。
   4. 从检测板中移除抗体，每孔用200 μL PBS（pH 7.4）洗涤两次。
   5. 每孔加入200 μL含0.05% Tween 20和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（pH 7.4），在摇床上室温孵育1小时。
   6. 使用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（pH 7.4）配制8点标准曲线，APOB浓度分别为：300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL和50 ng/mL。
   7. 用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（pH 7.4）将待测样本稀释1:4。
   8. 孵育缓冲液封闭1小时后，弃去缓冲液，用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤检测板5次。
   9. 彻底去除残留洗涤液后，将90 μL稀释后的样本及APOB标准品转移至检测板中。在摇床上室温孵育1小时。
   10. 弃去样本，每孔用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤，共洗涤5次。每孔加入100 μL mAB LDL 11-生物素抗体（用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS，pH 7.4稀释1:1,000），在摇床上室温孵育1小时。
   11. 弃去试剂，每孔用200 μL洗涤缓冲液洗涤5次。每孔加入100 μL链霉亲和素-HRP抗体（用孵育缓冲液1:1,000稀释），然后在摇床上室温孵育1小时。
   12. 弃去试剂，每孔用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤5次。彻底去除检测板中残留洗涤液后，每孔加入100 μL四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温孵育8分钟。
   13. 不移除TMB底物，直接每孔加入100 μL终止液（1N HCl）。
   14. 使用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
   15. 可采用四参数逻辑回归法建立标准曲线，并据此确定各样本中APOB的浓度¹⁰。
   16. 分析每个样本加药前与加药后APOB的比值，以识别可能降低培养基中APOB水平的化合物。

结果

肝样细胞的生成：图1 描述了人诱导性多能干细胞（iPSCs）向肝样细胞分化过程中发生改变的时间框架。在E-Cad-Fc上培养的iPSCs可形成直径约2 mm的克隆，表达多能性标志物OCT4（图1A-B）。在E-钙黏蛋白基质上生长的细胞形态会与其他表面培养的细胞略有不同，通常呈现扁平形态，胞质表面积更大（图1A）。尽管人多能干细胞可在多种不同基质上高效培养¹¹，但在E-钙黏蛋白基质上培养iPSCs被认为可提高多能细胞群体的均一性，并允许在传代过程中进行无需酶处理的操作¹²。然而，也可使用其他多种替代基质，包括基底膜基质、层粘连蛋白、纤连蛋白和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），均可用于维持人iPSCs，且均应与本方案兼容

讨论

基于靶点的药物发现旨在筛选出能够影响特定蛋白质活性的小分子化合物，是目前许多筛选工作的重点。尽管这种方法已成功开发出多种药物，但基于逆转表型的经典药理学筛选方法在发现具有临床疗效的首创新药方面更为成功¹。表型药物发现的一个缺点是其依赖于合适的疾病模型。当缺乏该疾病的细胞模型，或常用实验动物物种无法重现临床症状时，这可能构成挑战。然而，利用患者的体细胞生成诱导多能干细胞（iPSC）的能力，为在体外培养中模拟人类疾病提供了新的机遇³。对于某些疾病，例如罕见遗传病，患者数量稀少，且难以接触和获得知情同意。然而，随着基因组编辑技术的发展，将致病突变引入iPSC基因组已相对简便，使得即使是最为罕见的疾病也能够被建模研究。

获得诱导多能干细胞（iPSCs）后，必须将其分化为能够表现疾病表型的适当细胞类型。例如，影响神经功能的疾病可能需要生成神经元或胶质细胞¹⁷，而影响肝脏的疾病则可能需要肝细胞^9...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm x 20 mm 无菌组织培养皿	Corning	430167
100 mm x 20 mm 无菌悬浮培养皿	Corning	430591
96孔组织培养板	Corning	3595
抗人白蛋白抗体	Dako	A 0001
抗人FOXA2(6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
抗人HNF4 alpha	Santa Cruz	SC-6556
抗人Oct-3/4抗体	Santa Cruz	SC-9081
抗人SOX17	R&D	AF1924
抗人TRA-1-60 FITC偶联抗体	Millipore	FCMAB115F
Activin A重组人蛋白	Invitrogen	PHC9563
B-27添加剂（不含胰岛素）	Invitrogen	0050129SA
B-27添加剂（无血清）	Invitrogen	17504044
BMP4重组人蛋白	Invitrogen	PHC9533
细胞解离试剂StemPro  Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒	Promega	7572
DPBS+（含钙、镁）	Invitrogen	14040-133
DPBS-（无钙、无镁）	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12培养基，含HEPES	Invitrogen	11330057
人载脂蛋白B（APOB）ELISA检测试剂盒	Mabtech	3715-1H-20
成纤维细胞生长因子2（FGF2）	Invitrogen	PHG0023
肝细胞培养基（HCM Bullet Kit）	Lonza	CC-3198
肝细胞生长因子 （HGF）	Invitrogen	PHC0321
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030081
MEM非必需氨基酸溶液	Invitrogen	11140076
Oncostatin M（OSM）重组人蛋白	Invitrogen	PHC5015
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140163
无饲养层多能干细胞培养基：mTesR1	STEMCELL technologies	5850
生长因子减少型基底膜基质	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640培养基，含HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere人多能干细胞定义基质（E-cad-Fc）	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA底物溶液	Thermo Scientific	34022
抗TRA-1-60 FITC偶联抗体	Millipore	FCMAB115F
Versene（EDTA）0.02%	Lonza	17-711E
Y-27632 ROCK抑制剂	STEMCELL Technologies	72302