利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

摘要

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。

摘要

将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为肝细胞样细胞（HLCs）的能力为研究肝脏代谢中的先天性错误提供了新的机会。然而，为了建立一个可用于筛选潜在治疗肝病小分子的平台，该方法需要一种能够兼容数千种化合物筛选的培养体系。本文介绍了一种在完全明确的培养条件下，于96孔组织培养板中可重复地将人iPSCs分化为肝细胞样细胞的实验方案。我们还展示了利用该平台筛选能够降低家族性高胆固醇血症患者来源的iPSC衍生肝细胞所产生的载脂蛋白B（APOB）的化合物的实例。这一适用于药物发现的平台的建立，将有助于研究人员发现治疗肝脏相关疾病的新疗法。

引言

成功发现可用于靶向罕见病的药物依赖于可用于筛选的检测方法的开发。基于假设或靶点的筛选（反向药理学）具有一定的应用价值，但需要对疾病的分子机制有深入的理解。表型筛选（经典药理学）则无需对生化通路有详尽的认知，而是依赖于能够准确模拟疾病病理生理学的模型的建立。尽管靶点导向的方法备受关注，但对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首创新药的分析表明，表型筛选的成功率远高于前者。 关键词：药物筛选，罕见病，反向药理学，经典药理学，表型筛选，靶点筛选，疾病模型，分子机制，首创新药，FDA批准¹该方法的总体目标是建立一个可用于高通量筛选的平台，以鉴定用于治疗代谢性肝病的小分子。多个 体外 已描述的模型包括原代肝细胞、肝癌细胞和肝前体细胞²然而，这些模型大多存在局限性，亟需开发能够在体外培养中准确模拟代谢性肝功能障碍病理生理过程的新模型。近年来，人类多能干细胞结合基因编辑技术为在体外模拟极为罕见的疾病提供了可能，且无需直接获取患者样本。³尽管使用患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）作为发现治疗罕见肝病小分子的工具在概念上是合理的，但目前仅有少数研究报告证实了该方法的可行性⁴然而，我们最近建立了一个利用诱导多能干细胞衍生的肝细胞的平台，成功筛选出可用于治疗肝脏代谢缺陷的可重新定位药物⁵.<....

方案

1. 人类诱导多能干细胞的培养

1. 包被重组人E-钙黏蛋白Fc融合蛋白（E-cad-Fc）或其他适用于人多能干细胞（hPSC）培养的基质⁶
   1. 用含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS (+)）将E-cad-Fc稀释至15 μg/mL。
   2. 在100 mm悬浮组织培养皿中加入5 mL稀释后的E-cad-Fc进行包被，并于37 ˚C孵育至少1小时。移除包被液，替换为5 mL培养基（例如，后续称为M-培养基的mTeSR1）⁷。
      注意：本实验方案所用培养基的配制依据已发表的方案⁷。然而，已有其他多种培养基配方被报道或可商业获得，可能也适用于本实验流程。
   3. 从液氮中取出一管冷冻保存的诱导多能干细胞（iPSCs），在37 ˚C水浴中解冻至仅剩微小冰晶。轻柔地将细胞吹打转移至含有4 mL M-培养基的无菌15 mL锥形离心管中。
   4. 以300 x g离心5分钟。弃去上清液，用5 mL添加了10 µM Y-27632（一种选择性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂）的培养基轻柔重悬细胞。
   5. 移除步骤1.1.2中的M-培养基，将步骤1.1.4中获得的5 mL细胞悬液转移至已包被E-ca....

结果

肝细胞的生成-类似细胞： 图1 描述了人iPSCs向肝细胞样细胞分化过程中发生的变化的时间框架。在E-Cad-Fc上培养的iPSCs可形成直径约2 mm的克隆，表达多能性标志物OCT4（图1A-B）。在E-cadherin基质上培养的细胞形态会与其他表面培养的细胞略有不同，通常呈现扁平形态，胞质表面积更大（图1A）。尽管人类多能干细胞可以在多种不同的基质上高效培养¹¹在E-钙黏蛋白基质上培养iPSC被认为可提高多能细胞群体的均一性，并可在传代过程中实现无需酶处理的细胞操作¹²然而，也可使用多种替代基质，包括基底膜基质、层粘连蛋白、纤连蛋白和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）.......

讨论

基于靶点的药物发现旨在筛选出能够影响特定蛋白质活性的小分子化合物，是目前许多筛选工作的重点。尽管这种方法已成功开发出多种药物，但基于逆转表型的经典药理学筛选方法在发现具有临床疗效的首创新药方面更为成功¹。表型药物发现的一个缺点是其依赖于合适的疾病模型。当缺乏该疾病的细胞模型，或常用实验动物物种无法重现临床症状时，这可能构成挑战。然而，利用患者的体细胞生成诱导多能干细胞（iPSC）的能力，为在体外培养中模拟人类疾病提供了新的机遇³。对于某些疾病，例如罕见遗传病，患者数量稀少，且难以接触和获得知情同意。然而，随着基因组编辑技术的发展，将致病突变引入iPSC基因组已相对简便，使得即使是最为罕见的疾病也能够被建模研究。

获得诱导多能干细胞（iPSCs）后，必须将其分化为能够表现疾病表型的适当细胞类型。例如，影响神经功能的疾病可能需要生成神经元或胶质细胞¹⁷，而影响肝脏的疾病则可能需要肝细胞^9.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm x 20 mm 无菌组织培养皿	Corning	430167
100 mm x 20 mm 无菌悬浮培养皿	Corning	430591
96孔组织培养板	Corning	3595
抗人白蛋白抗体	Dako	A 0001
抗人FOXA2(6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
抗人HNF4 alpha	Santa Cruz	SC-6556
抗人Oct-3/4抗体	Santa Cruz	SC-9081
抗人SOX17	R&D	AF1924
抗人TRA-1-60 FITC偶联抗体	Millipore	FCMAB115F
Activin A重组人蛋白	Invitrogen	PHC9563
B-27添加剂（不含胰岛素）	Invitrogen	0050129SA
B-27添加剂（无血清）	Invitrogen	17504044
BMP4重组人蛋白	Invitrogen	PHC9533
细胞解离试剂StemPro  Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒	Promega	7572
DPBS+（含钙、镁）	Invitrogen	14040-133
DPBS-（无钙、无镁）	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12培养基，含HEPES	Invitrogen	11330057
人载脂蛋白B（APOB）ELISA检测试剂盒	Mabtech	3715-1H-20
成纤维细胞生长因子2（FGF2）	Invitrogen	PHG0023
肝细胞培养基（HCM Bullet Kit）	Lonza	CC-3198
肝细胞生长因子 （HGF）	Invitrogen	PHC0321
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030081
MEM非必需氨基酸溶液	Invitrogen	11140076
Oncostatin M（OSM）重组人蛋白	Invitrogen	PHC5015
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140163
无饲养层多能干细胞培养基：mTesR1	STEMCELL technologies	5850
生长因子减少型基底膜基质	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640培养基，含HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere人多能干细胞定义基质（E-cad-Fc）	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA底物溶液	Thermo Scientific	34022
抗TRA-1-60 FITC偶联抗体	Millipore	FCMAB115F
Versene（EDTA）0.02%	Lonza	17-711E
Y-27632 ROCK抑制剂	STEMCELL Technologies	72302