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方法文章

微生物菌落生物膜的石蜡包埋与显微切片技术用于显微分析

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DOI：

10.3791/57196

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2018年3月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Biology, Barnard College, Columbia University

本文内容

摘要

我们介绍了微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋和切片技术。在制备好的样品中，可通过显微镜观察生物膜的亚结构及报告基因表达模式。

摘要

通过石蜡包埋进行切片是真核生物系统中广泛建立的一种技术。本文提供了一种利用灌注石蜡对完整微生物菌落生物膜进行固定、包埋和切片的方法。为了将该方法适用于菌落生物膜，我们开发了在保持样品原有生长基质的基础上，以琼脂覆盖层对其进行覆膜的技术，并在固定液中添加了赖氨酸。这些优化措施提高了样品的保留性以及微形态特征的保存效果。采用此方法制备的样品可适用于薄切片，并可用于光学显微镜、荧光显微镜和透射电子显微镜成像。我们已将该技术应用于菌落生物膜的研究，包括 铜绿假单胞菌, 假单胞菌属 synxantha，枯草芽孢杆菌，以及 霍乱弧菌该方法所生成样本中可见的高细节水平，结合报告菌株的构建或特异性染料的使用，可为微生物群落的生理学与发育过程提供令人振奋的深入见解。

引言

大多数微生物具有形成生物膜的能力，即由细胞通过自产基质聚集而成的群落。生物膜可在多种物理装置中培养，并通过不同的营养和底物供给方式维持生长。针对生物膜形成的特定检测方法通常可产生可重复的多细胞结构，在群落或宏观层面上，系统发育上多样的物种常表现出相似的结构特征。当微生物在固体培养基及特定气体环境下以菌落形式生长时，其宏观形态可反映其基质生成能力，并常与其他表型特征相关联。 1,2,3微生物菌落的内部结构也可为生物膜特有的化学与生理特性提供线索，但其表征一直存在困难。近期将冷冻包埋与冷冻切片技术应用于细菌菌落，使得特定结构特征的成像与可视化达到了前所未有的分辨率。 4,5,6然而，动物组织研究表明，与冷冻包埋相比，石蜡包埋在形态学保存方面具有更优的效果 7 并已用于在组织中可视化细菌 8,9因此，我们建立了一种用于微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋及切片的实验方案。本文将介绍生物膜样本的制备方法 铜绿假单胞菌 PA14 菌落生物膜薄切片 10,11，但我们已成功将该技术应用于细菌形成的生物膜 假单胞菌属 synxantha，枯草芽孢杆菌， 和 霍乱弧菌12.

石蜡包埋和生物膜切片的过程遵循一个简单的逻辑。首先，将生物膜包裹在一层琼脂中，以在处理过程中保持其形态。其次，将包裹好的生物膜浸入固定剂中，使大分子交联并保存微细结构。随后，用酒精脱水，再用极性更弱的溶剂透明，最后浸入液态石蜡中。浸蜡完成后，将样品包埋于石蜡块中以便切片。切片后，将切片贴附于载玻片上，并进行再水化，使其恢复至更接近天然的状态。此后，即可对切片进行染色或封片，用于显微镜分析。

本方案可制备适用于组织学分析的微生物生物膜薄切片。采用该方法制备的薄切片经光学显微镜成像后，可清晰观察到菌落生物膜的亚结构。生物膜亦可在含有针对特定组分的荧光染料的培养基中生长，或在封片前的复水步骤中进行染色（步骤9.5–9.6）。此外，还可对微生物进行基因改造，使其以组成型或诱导型方式表达荧光蛋白，从而实现 原位 报告这些群落中的细胞分布或基因表达情况。我们已利用这些方法确定了菌落生物膜的厚度、细胞分布、基质分布、生长模式以及基因表达的时空动态。

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方案

1. 铜绿假单胞菌菌落生物膜的培养

  1. 制备双层培养基平板
    1. 在去离子水中配制含10 g/L胰蛋白胨和10 g/L琼脂（见材料表）的溶液。
    2. 121 °C高压灭菌20分钟，然后在水浴中冷却至50–60 °C。
    3. 使用50 mL锥形管将45 mL琼脂-胰蛋白胨溶液倒入100 mm × 100 mm方形培养皿（见材料表）中，静置使其凝固（约20–30分钟）。随后在第一层上覆盖15 mL第二层琼脂溶液，静置过夜，必要时用无尘纸擦拭盖子内表面以去除冷凝水。
  2. 点种菌落生物膜
    1. 从冷冻保存菌种中挑取目标菌株，在LB琼脂平板上划线接种13，于37 °C、相对湿度80–100%条件下避光培养12–16小时。
    2. 对每种菌株或重复实验，挑取单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm振荡条件下避光培养12–16小时。
    3. 将上述培养物按1:100比例转接至新鲜LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm振荡条件下避光培养2.5–3小时。
    4. 使用分光光度计测定光密度，并用无菌LB培养基调节菌液浓度，使菌悬液在500 nm处的OD值（OD500 nm）约为0.5。
    5. 根据所需菌落大小，取2.5–10 µL菌悬液点种于双层培养基平板（按步骤1.1制备）表面，静置约20分钟使其干燥。将培养皿盖稍打开并靠近火焰可加速干燥过程。
    6. 将点种后的菌落置于25 °C、相对湿度80–100%、避光条件下培养最多4天。

2. 固定剂溶液的制备

  1. 在样品收获当天配制固定液。将37%甲醛（FA）用1×PBS稀释，得到终浓度为4% FA的溶液。
    注意：FA具有挥发性和毒性。请佩戴防护装备，并在通风良好的通风橱中操作。
  2. 使用前立即在室温下将盐酸赖氨酸加入步骤2.1配制的4% FA溶液中，使其终浓度为50 mM盐酸赖氨酸。

3. 固定剂对菌落生物膜的直接应用 [可选]

注意：我们发现，在固定之前添加琼脂覆盖层时，生物膜形态的保存效果最佳。然而，此步骤也改变了环境条件，可能影响基因表达。因此，应使用另一种独立的实验方案验证荧光报告基因的表达模式，即在添加琼脂覆盖层之前进行固定步骤，具体方法如本文所述。

  1. 在固定当天，于通风良好的通风橱中操作，用移液器将步骤2中配制的固定液直接滴加到菌落边缘周围的琼脂表面，使固定液接触到菌落外围但不淹没菌落。固定液用量以恰好完全包围菌落为宜，约500 µL。让固定液自然扩散进入菌落及周围琼脂中。
  2. 待固定液完全被菌落及周围培养基吸收（约20–30分钟），且平板表面不再可见残留的甲醛（FA）时，重复步骤3.1。让此次添加的固定液扩散进入菌落及周围琼脂中。
  3. 待固定液完全被菌落及周围培养基吸收后，再次重复步骤3.1，此次直接将固定液滴加至菌落表面。让固定液扩散进入菌落及周围琼脂，直至所有固定液均被吸收且平板表面不可见时，方可进行步骤4。

4. 用琼脂覆盖菌落

  1. 在固定的当天，用去离子水配制 10 g/L 的琼脂溶液，并高压灭菌 10–20 分钟以溶解。在水浴中冷却至 50 ˚C。
  2. 将 15 mL 琼脂溶液轻轻倒在生长培养基和菌落上。在室温下静置 5 分钟，使琼脂形成凝胶（图 1B）。
  3. 使用锋利的剃刀刀片切割出一个正方形的三层样品块，使菌落夹在上两层之间。若需制备多个样品，应确保每个样品块的尺寸相近。
  4. 轻轻去除含菌落样品块上多余的琼脂。
  5. 为将上两层琼脂（含菌落）从样品块底层分离（图 1C），将刮刀的平头浸湿于 1× PBS 或水中，然后轻轻插入上下层之间。夹层中的菌落应与底层分离。提起时注意避免扭曲或弯曲夹层菌落。

5. 固定

  1. 在通风良好的通风橱中操作，立即将分层菌落（即双层chuck）转移至已用耐化学标记笔标记的包埋盒中（参见材料表）。将包埋盒放入装有步骤2.1–2.2中配制的固定液的玻片邮寄盒中（参见材料表）。确保包埋盒内无气泡残留。
  2. 将样品在固定液中于室温避光条件下孵育过夜。

6. 样品处理：缓冲液洗涤、脱水、透明和浸润

  1. 过夜固定后，用 1x PBS 将样品清洗两次，每次 1 小时。为获得最佳效果，可使用自动组织处理机的旋转功能（参见材料表）并设置为低速，以实现试剂的均匀混合。若无处理机，也可手动操作。
  2. 随后在室温下，使用一系列浓度递增的乙醇（EtOH）溶液（25%、50%、70%、95%，溶于 1x PBS）进行脱水，每步 1 小时。
  3. 在 100% EtOH 中进行三次脱水，每次 1 小时，室温下进行。
  4. 将脱水后的样品置于 100% 橙油基透明剂（参见材料表）中进行透明处理，共清洗三次，每次 1 小时，室温下进行。
  5. 将透明后的样品浸入熔融的石蜡（参见材料表）中两次，温度维持在 55˚C，每次 2 小时。

7. 样品包埋

  1. 将加热至 55 ˚C 的熔融石蜡倒入石蜡模具中。使用预热的扁平刮刀，迅速将浸润过的样本块从包埋盒转移至石蜡模具内，确保样本块与模具底部平行放置。避免对样本块施加过大的压力。石蜡模具可定制 3D 打印，或使用市售产品（见材料表）。
  2. 在 4 ˚C 下静置过夜，使石蜡完全凝固。包埋于固体石蜡中的样品可在 4 ˚C 长期保存。
  3. 待石蜡完全凝固后，将样品从模具中取出，并用刀片修去样品周围多余的石蜡。在样品一端保留适量延伸的石蜡，方向与切片平面平行，以便于将其夹紧在切片机上（见材料表）。同时在样品周围保留约 1 mm 厚的石蜡鞘，并将其表面修整平滑。

8. 切片

  1. 将水浴加热至 42 ˚C。将样品夹紧在切片机上，使菌落表面与刀刃边缘垂直（参见 材料表）。
  2. 以 50-µm 的间隔修切样品，直至达到所需菌落切面，从此处开始收集切片。
  3. 使用设定切片速度为 75–80 rpm、 Clearance angle 为 6–10˚ 的切片机，切出所需数量的 10-µm 厚切片带。用细尖毛笔将切片带从刀片上轻轻剥离。
  4. 用巴斯德移液管尖端的一滴水（推荐）或镊子，将切片带轻柔转移至水浴中。注意避免切片下方困住气泡。
  5. 立即将载玻片插入水浴中，并以 45˚ 角度置于切片带下方。
  6. 将切片带的窄边接触载玻片，位置在磨砂标签稍下方处。切片带应自然黏附于载玻片上。
  7. 将载玻片从水浴中缓慢拉出，调整角度使其垂直于水面，并让切片带沿载玻片长度方向平整贴附。避免在切片带下方残留过多水分。
  8. 将载玻片轻轻竖立在无尘吸水纸上，吸除切片上的多余水分。
  9. 将载玻片平放在纸巾上，于室温避光条件下过夜干燥。载玻片可长期在 4 ˚C 避光保存。

9. 热固定、再水化与封片

  1. 将调平的加热板加热至 45 ˚C，将载玻片加热 30–60 分钟，使石蜡变为半熔融状态并紧贴载玻片表面。
  2. 小心地将载玻片从加热板上取下，并将其平放在光滑、水平、室温的表面上，注意防止熔融石蜡向载玻片一侧偏移，直至石蜡完全凝固（约 1 分钟）。
  3. 使用玻璃载玻片邮寄盒，将载玻片在透明剂中清洗四次，每次 5 分钟，每次清洗之间使用布氏抽滤装置去除液体。
  4. 用 100% 乙醇清洗载玻片三次，每次 1 分钟。
  5. 按照与脱蜡相反的梯度乙醇系列（95%、70%、50% 和 25%）对载玻片进行再水化处理，每步 1 分钟，随后在 1x PBS 中清洗两次，每次 1 分钟。
  6. 立即使用 Tris 缓冲封片介质（见材料表）封片，并加盖盖玻片，注意避免产生气泡。在室温下静置过夜，使封片介质充分聚合。
  7. 聚合完成后，用透明指甲油将盖玻片密封至载玻片上。密封后的载玻片可长期避光保存于 4 ˚C 环境中。

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结果

该方法可制备生物膜的超薄切片，从而通过微分干涉差显微镜（DIC）、荧光显微镜和透射电子显微镜（TEM）对不同的形态特征及基因表达区域进行成像。虽然使用40倍油镜物镜进行DIC成像已足以显示部分形态特征（图2E），但我们发现，对经基因工程改造后持续表达荧光蛋白的菌株进行荧光显微成像，可更清晰地展示样品内细胞的分布情况（图2D）。单个切片的图像可拼接成整个菌落的横截面图（图2B），从而在宏观层面为结构特征的定位提供整体形态学背景（比较 图2A、B和C）。可使用图像分析软件对形态特征和荧光信号进行定量测量14。随后，可将生物膜内的结构或基因表达区域之间的过渡区与代谢物分布或化学梯度相关联11。

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讨论

石蜡包埋和组织样本切片是一种经典的组织学技术，可实现对微形态结构的成像，常用于真核生物组织，并已在一定程度上成功应用于微生物样本8,9。尽管冷冻包埋有利于内源性及免疫荧光信号的强效保留，但石蜡包埋通常更受青睐，因其对形态结构的保存效果更佳16。在将该方法改进用于微生物生物膜时，我们重点关注了本系统特有的性质。组织中的细胞与基质通常结合较为牢固，而生物膜则往往更为脆弱；因此，我们对常规固定和石蜡包埋流程进行了优化，以最大程度保留样本。在生长基质上直接保留样本，并在固定前立即用琼脂覆盖菌落，可确保样本不会从顶部或底部丢失。然而，若用于覆盖菌落的琼脂温度过高，则可能损伤菌落，因此该步骤需格外小心。

固定是保留样本结构的关键步骤，可使其经受住石蜡包埋所需的严苛脱水、透明和浸润过程。我们发现，赖氨酸-甲醛固定最能保持样本的完整性。可溶性赖氨酸是一种二胺，可与醛类反应形成交联聚合物，据称能够增强胞外聚合物（EPS）抵抗机械降解的能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER AWARD 1553023）和美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所资助项目（NIH/NIAID award R01AI103369）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 3/4" 帕斯特移液管费舍尔科技13-678-6A购自大学生物用品商店 
琼脂 泰克诺瓦 A7777
布氏抽滤瓶（真空） 派热克斯5340购自大学生物用品商店 
耐化学腐蚀标记笔VWR103051-182制造商：徕卡
透明指甲油 ****************市售购买
刚果红指示剂级VWRAAAB24310-14制造商：阿尔法艾撒
考马斯亮蓝 VWREM-3340制造商：默克密理博
TRIS缓冲封片剂（含DAPI） 费舍尔科技50 247 04制造商：电子显微科学
包埋模具 ****************内部3D打印
包埋模具（商用） 电子显微科学70182
乙醇 200P德康实验室公司 2701购自大学生物用品商店 
细头刷****************市售购买，绘画用刷
玻璃盖玻片 60x22mm费舍尔科技12-519-21C
玻璃复水邮寄盒 泰德贝拉2104320片装邮寄盒 
Histoclear-II，橙油基透明剂 费舍尔科技50 899 90150制造商：国家诊断 
Histosette 包埋盒费舍尔科技15 182 701A
L-赖氨酸盐酸盐 费舍尔科技BP386 100
低剖面切片机刀片费舍尔科技22 210 048制造商：Sturkey 
微量移液器 VWR89080-004促销套装
微量移液器吸头 参见注释部分参见注释部分p10（费舍尔科技，02 707 469），p200（VWR，89079-474），p1250（VWR，89079-486）
切片机 费舍尔科技905200U/00016050型号：HM355S，制造商：Microm，非目录产品，供应商目录号 905200U/00016050
甲醛，37% 水溶液（福尔马林）里卡化学RSOF0010-500A
Paraplast Xtra（石蜡）VWR15159-486制造商：麦考密克科技 
方形培养皿 100x100x15mm实验室一次性用品 D210-16
氯化钾 EMD 化学品 PX1405-1磷酸盐缓冲液组分，内部配制 
磷酸钾 费舍尔科技P380-500磷酸盐缓冲液组分，内部配制 
剃须刀片 VWR55411-050购自大学生物用品商店 
载玻片加热台 费舍尔科技NC0865259非目录产品，供应商目录号 12857D
氯化钠 VWR0241-1KG磷酸盐缓冲液组分，内部配制 
磷酸钠 VWRBDH9296.500磷酸盐缓冲液组分，内部配制 
超冻组织学载玻片 费舍尔科技12-544-2
组织漂浮水浴锅 费舍尔科技NC0815797制造商：泰德贝拉，供应商目录号 28156-B
自动组织处理机 费舍尔科技813160U/Q#00009061型号：STP120 组织处理机
胰蛋白胨 泰克诺瓦 T9012
酵母提取物泰克诺瓦 Y9010

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