微生物菌落生物膜的石蜡包埋与显微切片技术用于显微分析

摘要

我们介绍了微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋和切片技术。在制备好的样品中，可通过显微镜观察生物膜的亚结构及报告基因表达模式。

摘要

通过石蜡包埋进行切片是真核生物系统中广泛建立的一种技术。本文提供了一种利用灌注石蜡对完整微生物菌落生物膜进行固定、包埋和切片的方法。为了将该方法适用于菌落生物膜，我们开发了在保持样品原有生长基质的基础上，以琼脂覆盖层对其进行覆膜的技术，并在固定液中添加了赖氨酸。这些优化措施提高了样品的保留性以及微形态特征的保存效果。采用此方法制备的样品可适用于薄切片，并可用于光学显微镜、荧光显微镜和透射电子显微镜成像。我们已将该技术应用于菌落生物膜的研究，包括 铜绿假单胞菌, 假单胞菌属 synxantha，枯草芽孢杆菌，以及 霍乱弧菌该方法所生成样本中可见的高细节水平，结合报告菌株的构建或特异性染料的使用，可为微生物群落的生理学与发育过程提供令人振奋的深入见解。

引言

大多数微生物具有形成生物膜的能力，即由细胞通过自产基质聚集而成的群落。生物膜可在多种物理装置中培养，并通过不同的营养和底物供给方式维持生长。针对生物膜形成的特定检测方法通常可产生可重复的多细胞结构，在群落或宏观层面上，系统发育上多样的物种常表现出相似的结构特征。当微生物在固体培养基及特定气体环境下以菌落形式生长时，其宏观形态可反映其基质生成能力，并常与其他表型特征相关联。 ^1,2,3微生物菌落的内部结构也可为生物膜特有的化学与生理特性提供线索，但其表征一直存在困难。近期将冷冻包埋与冷冻切片技术应用于细菌菌落，使得特定结构特征的成像与可视化达到了前所未有的分辨率。 ^4,5,6然而，动物组织研究表明，与冷冻包埋相比，石蜡包埋在形态学保存方面具有更优的效果 ⁷ 并已用于在组织中可视化细菌 ^8,9因此，我们建立了一种用于微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋及切片的实验方案。本文将介绍生物膜样本的制备方法

方案

1. 铜绿假单胞菌菌落生物膜的培养

1. 制备双层培养基平板
   1. 在去离子水中配制含10 g/L胰蛋白胨和10 g/L琼脂（见材料表）的溶液。
   2. 121 °C高压灭菌20分钟，然后在水浴中冷却至50–60 °C。
   3. 使用50 mL锥形管将45 mL琼脂-胰蛋白胨溶液倒入100 mm × 100 mm方形培养皿（见材料表）中，静置使其凝固（约20–30分钟）。随后在第一层上覆盖15 mL第二层琼脂溶液，静置过夜，必要时用无尘纸擦拭盖子内表面以去除冷凝水。
2. 点种菌落生物膜
   1. 从冷冻保存菌种中挑取目标菌株，在LB琼脂平板上划线接种¹³，于37 °C、相对湿度80–100%条件下避光培养12–16小时。
   2. 对每种菌株或重复实验，挑取单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm振荡条件下避光培养12–16小时。
   3. 将上述培养物按1:100比例转接至新鲜LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm振荡条件下避光培养2.5–3小时。
   4. 使用分光光度计测定光密度，并用无菌LB培养基调节菌液浓度，使菌悬液在500 nm处的OD值（OD_{500 nm}）约为0.5。
   5. ....

结果

该方法可制备生物膜的超薄切片，从而通过微分干涉差显微镜（DIC）、荧光显微镜和透射电子显微镜（TEM）对不同的形态特征及基因表达区域进行成像。虽然使用40倍油镜物镜进行DIC成像已足以显示部分形态特征（图2E），但我们发现，对经基因工程改造后持续表达荧光蛋白的菌株进行荧光显微成像，可更清晰地展示样品内细胞的分布情况（图2D）。单个切片的图像可拼接成整个菌落的横截面图（图2B），从而在宏观层面为结构特征的定位提供整体形态学背景（比较 图2A、B和C）。可使用图像分析软件对形态特征和荧光信号进行定量测量¹⁴。随后，可将生物膜内的结构或基因表达区域之间的过渡区与代谢物分布或化学梯度相关联¹¹。

讨论

石蜡包埋和组织样本切片是一种经典的组织学技术，可实现对微形态结构的成像，常用于真核生物组织，并已在一定程度上成功应用于微生物样本^8,9。尽管冷冻包埋有利于内源性及免疫荧光信号的强效保留，但石蜡包埋通常更受青睐，因其对形态结构的保存效果更佳¹⁶。在将该方法改进用于微生物生物膜时，我们重点关注了本系统特有的性质。组织中的细胞与基质通常结合较为牢固，而生物膜则往往更为脆弱；因此，我们对常规固定和石蜡包埋流程进行了优化，以最大程度保留样本。在生长基质上直接保留样本，并在固定前立即用琼脂覆盖菌落，可确保样本不会从顶部或底部丢失。然而，若用于覆盖菌落的琼脂温度过高，则可能损伤菌落，因此该步骤需格外小心。

固定是保留样本结构的关键步骤，可使其经受住石蜡包埋所需的严苛脱水、透明和浸润过程。我们发现，赖氨酸-甲醛固定最能保持样本的完整性。可溶性赖氨酸是一种二胺，可与醛类反应形成交联聚合物，据称能够增强胞外聚合物（EPS）抵抗机械降解的能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 3/4" 帕斯特移液管	费舍尔科技	13-678-6A	购自大学生物用品商店
琼脂	泰克诺瓦	A7777
布氏抽滤瓶（真空）	派热克斯	5340	购自大学生物用品商店
耐化学腐蚀标记笔	VWR	103051-182	制造商：徕卡
透明指甲油	********	********	市售购买
刚果红指示剂级	VWR	AAAB24310-14	制造商：阿尔法艾撒
考马斯亮蓝	VWR	EM-3340	制造商：默克密理博
TRIS缓冲封片剂（含DAPI）	费舍尔科技	50 247 04	制造商：电子显微科学
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包埋模具（商用）	电子显微科学	70182
乙醇 200P	德康实验室公司	2701	购自大学生物用品商店
细头刷	********	********	市售购买，绘画用刷
玻璃盖玻片 60x22mm	费舍尔科技	12-519-21C
玻璃复水邮寄盒	泰德贝拉	21043	20片装邮寄盒
Histoclear-II，橙油基透明剂	费舍尔科技	50 899 90150	制造商：国家诊断
Histosette 包埋盒	费舍尔科技	15 182 701A
L-赖氨酸盐酸盐	费舍尔科技	BP386 100
低剖面切片机刀片	费舍尔科技	22 210 048	制造商：Sturkey
微量移液器	VWR	89080-004	促销套装
微量移液器吸头	参见注释部分	参见注释部分	p10（费舍尔科技，02 707 469），p200（VWR，89079-474），p1250（VWR，89079-486）
切片机	费舍尔科技	905200U/00016050	型号：HM355S，制造商：Microm，非目录产品，供应商目录号 905200U/00016050
甲醛，37% 水溶液（福尔马林）	里卡化学	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra（石蜡）	VWR	15159-486	制造商：麦考密克科技
方形培养皿 100x100x15mm	实验室一次性用品	D210-16
氯化钾	EMD 化学品	PX1405-1	磷酸盐缓冲液组分，内部配制
磷酸钾	费舍尔科技	P380-500	磷酸盐缓冲液组分，内部配制
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载玻片加热台	费舍尔科技	NC0865259	非目录产品，供应商目录号 12857D
氯化钠	VWR	0241-1KG	磷酸盐缓冲液组分，内部配制
磷酸钠	VWR	BDH9296.500	磷酸盐缓冲液组分，内部配制
超冻组织学载玻片	费舍尔科技	12-544-2
组织漂浮水浴锅	费舍尔科技	NC0815797	制造商：泰德贝拉，供应商目录号 28156-B
自动组织处理机	费舍尔科技	813160U/Q#00009061	型号：STP120 组织处理机
胰蛋白胨	泰克诺瓦	T9012
酵母提取物	泰克诺瓦	Y9010