使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

摘要

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。

摘要

蛋白质赖氨酸残基的N_Ɛ-酰化翻译后修饰可诱导结构变化，从而动态调控蛋白质功能，例如通过改变酶活性或介导分子间相互作用。精确量化特定位点的蛋白质酰化占据率（即化学计量比）对于理解整体低化学计量比以及特定赖氨酸残基的个别高化学计量比酰化事件的功能意义至关重要。已有研究组报道了通过比较内源性天然丰度酰化肽段与外源性重同位素标记酰化肽段的前体离子同位素比例，来测定赖氨酸乙酰化化学计量比的方法，其中重同位素标记通过使用稳定同位素标记的乙酸酐对蛋白质进行定量化学乙酰化后引入。本实验方案描述了一种经过优化的方法，包含多项改进：（1）提高了化学酰化效率；（2）能够同时检测蛋白质琥珀酰化和乙酰化；（3）通过采用数据非依赖采集（DIA）中的碎片离子定量而非数据依赖采集（DDA）中的前体离子信号定量，减少了干扰，从而提高了定量准确性。使用碎片离子的提取峰面积进行定量，还能够独特地区分含有多个赖氨酸残基的蛋白水解肽段中各个位点的酰化化学计量比，而这是使用前体离子信号定量所无法实现的。在Skyline（一个开源的定量蛋白质组学分析平台）中进行数据可视化，便于对数据进行便捷的检查与审阅。综上，该工作流程可对整个蛋白质组中特定位点的赖氨酸乙酰化和琥珀酰化占据率实现无偏倚、精确且准确的定量，有助于发现并优先筛选具有生物学意义的酰化位点。

引言

蛋白质赖氨酸残基的N_ε-酰基化是调控蛋白质功能的重要机制。赖氨酸乙酰化及其他酰基化修饰（如琥珀酰化、丙二酰化和戊二酰化）被认为在代谢、细胞信号转导及其他细胞过程中发挥调控作用^1,2,3,4，并可能与代谢紊乱相关⁵。大量研究表明，在不同条件下，哺乳动物组织和细胞系^5,6,7,8以及细菌^9,10,11中，赖氨酸酰基化修饰水平可发生显著的倍数变化。然而，这些相对倍数变化并不能反映被修饰蛋白占总蛋白的比例。尽管准确测定酰基化位点占据率对于深入理解修饰的生物学意义至关重要，且其提供的信息远超相对倍数变化，但相关研究报道仍十分有限^12,13,14。例如，10倍的变化可能对应于占据率从0.01%升至0.1%、从1%升至10%，甚至从10%升至100%。因此，精确的化学计量学测量对于解读酰基化的生物学意义，以及预测其对蛋白质结构乃至功能改变的影响程度，具有关键作用。

一种先前用于量化位点占据率的方法利用重稳定同位素化学标记未修饰的赖氨酸残基，随后通过质谱法测量内源性与标记肽段之间的比率 "光" 与外源性化学标记的乙酰化相比 "重" 使用前体离子强度检测乙酰化赖氨酸¹². 另一项近期由Zhou开展的研究 等.¹³ Nakayasu 描述了一种类似的方法用于评估赖氨酸乙酰化的化学计量比，该方法同样采用稳定同位素标记对蛋白质中所有未修饰的赖氨酸残基进行完全化学乙酰化，但使用 DDA 测定的碎片离子强度进行分析。 等.¹⁴ 采用了一种类似的DDA方法，但定量时使用了轻链与重链乙酰化赖氨酸亚胺离子（acetyl-lysine immonium ions）的比值。基于碎片离子（包括亚胺离子或序列离子，MS2）进行定量，在大多数情况下相比处理完整的肽段前体离子（MS1）可减少信号干扰。然而，基于DDA生成的MS/MS谱图对碎片离子进行定量时，可能受到随机采样不足的影响，即高丰度的前体离子更易被选中进行MS/MS分析，从而导致前体离子采样的偏差和不完整性。

这一新型工作流程⁴（图1）在概念上采用了Baeza et al.¹²最初开发的稳定同位素化学标记方法，但随后将该流程与DIA技术结合，以在可检测的质量范围内同时采集前体离子和多个碎片离子的丰度^15,16，从而实现精确的化学计量计算。

通过含有目标酰化位点的碎片离子（即“区分性碎片离子”）的峰面积来定量酰化位点的占据率（图2）。不含修饰的碎片离子具有相同的轻链和重链质荷比（m/z），可用于肽段鉴定，但不用于定量。使用Skyline软件¹⁷提取前体离子和碎片离子的峰面积。当某些碎片离子出现干扰时，多个包含特定酰化位点的碎片离子可提供分析灵活性。Skyline中的数据可视化功能可用于严格检查轻链与重链碎片离子的比值。除手动数据分析外，我们实验室还开发了一个开源R软件包StiochiolyzeR（https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR），该工具利用DIA方法获得的前体离子和碎片离子数据，对含有多个赖氨酸残基的肽段进行位点特异性酰化化学计量比的定量分析，而仅依赖前体离子强度的测量方法无法实现这一功能⁴。

本方案还展示了使用内切蛋白酶Glu-C，该酶特异性切割谷氨酸和天冬氨酸残基的C端，以替代胰蛋白酶或Arg-C蛋白酶；因为后两者在酰化赖氨酸残基处会阻碍胰蛋白酶的切割，从而常常产生非常大且可能多重酰化的蛋白水解肽段。化学标记步骤还进一步扩展，包括使用琥珀酸酐（图1），从而实现对琥珀酰化化学计量比的定量。除了在样品制备方面的改进外，还通过离线、高pH值、反相（bRP）肽段分离实现肽段分级，进一步减少了定量干扰，使得在全蛋白质组样品中对酰化化学计量比的解析更加准确。综上，该方法具有以下几项优势：（1）化学酰化效率提高；（2）除乙酰化外，还可测定蛋白质的琥珀酰化化学计量比；（3）定量准确性提升。定量性能的改善主要归因于与DDA前体信号相比，DIA的碎片离子信号干扰减少，以及通过bRP实现的离线肽段预分级。

方案

1. 使用同位素标记的乙酸酐或琥珀酸酐对蛋白质进行定量乙酰化和/或琥珀酰化

1. 使用尿素和三乙基碳酸氢铵（TEAB）溶液（8 M 尿素，200 mM TEAB，pH 8），平行制备3份100 µg牛血清白蛋白（BSA）蛋白样品，每份浓度为1 µg/µL（总体积100 µL）。
   注意：必须使用不含胺的缓冲液。本代表性结果部分所用的蛋白样品为BSA、定量琥珀酰化BSA，以及两者的混合物，分别得到琥珀酰化占据率为0%、1%、10%、50%和100%的BSA样品（每种样品均制备3个重复）。本方案也已用于大肠杆菌（Escherichia coli）和小鼠肝脏的蛋白裂解液⁴。该方案同样适用于其他细胞或组织裂解液。
2. 向100 µL BSA样品（100 µg）中加入8 µL 250 mM二硫苏糖醇（DTT），使DTT终浓度达到20 mM，并在37 °C、1,400 rpm振荡条件下孵育30分钟。
3. 向还原后的BSA样品中加入21.6 µL 200 mM碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度达到40 mM，并在室温避光条件下孵育30分钟。
   注意：碘乙酰胺浓度应略高于DTT浓度的2倍，以确保所有还原的蛋白巯基均被烷基化。
4. 继续准备后续步骤所需的乙酸酐-d₆（步骤1.4.1）或琥珀酸酐-d₄（步骤1.4.2），用于样品的化学（定量）乙酰化或琥珀酰化。
   1. 根据分子量（108.13 g/mol）和密度（25 °C时为1.143 g/mL），计算1 g水相乙酸酐-d₆溶液的摩尔浓度（M）。
      注意：1 g包装中含有875 µL体积的9,248 µmol乙酸酐-d₆，配制成10.57 M溶液，用于样品的完全乙酰化。
   2. 在反应前立即用无水DMSO溶解粉末，配制5 M琥珀酸酐-d₄溶液，以避免试剂水解。将0.24 g琥珀酸酐-d₄溶解于461 µL无水DMSO中，得到5 M溶液。
5. 通过分别加入60 µmol乙酸酐-d₆（10.57 M溶液6 µL）或琥珀酸酐-d₄（5 M溶液12 µL），进行定量化学乙酰化或琥珀酰化反应，并在4 °C下于涡旋混合器上孵育20分钟。
   注意：由于酸酐具有酸性，蛋白可能发生沉淀。请注意观察，并按步骤1.6所述进行调整。
6. 孵育后加入10 µL 7.25 M NaOH，将pH升至约8，以消除任何O-酰化副产物。短暂涡旋混匀，并取1 µL样品点于pH试纸检测pH值。
   注意：可能需要加入超过10 µL的7.25 M NaOH才能达到pH 8。此外，可能沉淀的蛋白应重新溶解。
7. 重复步骤1.5和1.6的完全酰化及pH调节过程，共进行三次。每次记录pH值及所加碱性溶液的体积。上述化学酰化步骤应迅速操作，因为酸酐会水解并失去反应活性。
8. 在最后一次标记反应和pH调节后，加入10 µL 50%羟胺溶液，以逆转O-酰化副反应。

2. 使用 Glu-C 内肽酶消化反应后的蛋白质样品

1. 使用 pH 8 的 50 mM TEAB 将尿素浓度稀释至 0.8 M，并调整各样品体积至一致。
2. 加入内肽酶 Glu-C 进行蛋白质样品消化，酶与底物蛋白的质量比（w/w）为 1:50，37 °C 下振荡孵育过夜，转速为 1,400 rpm。
3. 通过加入甲酸至终体积浓度为 1%，对蛋白质消化产物进行酸化和终止反应。
4. 使用亲水-疏水平衡固相萃取柱对样品进行脱盐。每份样品使用一个 30 mg 填料的萃取柱，每柱最大上样量不超过 5 mg^4,18。
   注意：在整个脱盐过程中，必须始终保持萃取柱内填料处于湿润状态。必要时关闭真空泵，以减缓溶剂或样品通过萃取柱的速度。
   1. 将萃取柱插入 24 孔玻璃真空 manifold 的对应接口中，并开启真空泵。未使用的接口应加盖封闭。必要时留出一至两个接口不加盖，以维持真空表上的较低压力。
   2. 每根萃取柱用 800 µL 的 80% 乙腈（ACN）/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液润洗两次。确保液面始终高于填料层 2–3 mm。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。
   3. 每根萃取柱用水中含 0.2% 甲酸的溶液平衡三次，每次 800 µL。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。
   4. 将肽段样品加载至萃取柱上。确保 manifold 上的真空表读数为 6.77–8.47 kPa（2–2.5 in Hg），流速不超过 1 mL/min。
   5. 每根萃取柱用水中含 0.2% 甲酸的溶液洗涤三次，每次 800 µL。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。
   6. 将萃取柱从真空 manifold 上取下，并置于 1.5 mL 微管中。
   7. 用 800 µL 的 80% ACN/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液洗脱肽段一次，使溶剂与填料孵育 2–3 分钟。
   8. 使用移液器推动溶剂通过萃取柱内的填料层。重复操作，将第二轮 400 µL 的 80% ACN/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液洗脱液收集至同一 1.5 mL 微管中。
5. 通过真空离心浓缩干燥洗脱液（固定离心力为 268 x g），通常持续约 3 小时。
   注意：如需暂存，干燥后的洗脱液样品可在 -20 °C 冷冻保存，待后续进行组分分离时再继续操作。

3. 使用离线碱性pH反相高效液相色谱分离肽段

1. 将预酰化并经Glu-C酶解的样品（按第1和第2节所述方法制备）重新悬浮于200 µL缓冲液A（10 mM甲酸铵水溶液，pH 10）中，在4 °C下涡旋混匀10分钟，然后在室温下以17,500 × g 离心10分钟。
   注：所得肽样品可进行高pH值离线分级分离^19,20。
2. 根据所使用的仪器和软件设置离线高效液相色谱（HPLC）分级方法。以下方法适用于配备双波长紫外检测器、自动进样器、馏分收集器和耐pH 10的C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm粒径）的二元HPLC泵系统。
3. 每份样品收集40个馏分，每个馏分收集2.1分钟，并将每第四个馏分合并，最终得到四个合并馏分⁴。可增加合并馏分数目以进一步降低样品复杂性，但会延长质谱数据采集时间。
4. 将合并的馏分在冷冻干燥机中干燥，将干燥后的肽样品重新悬浮于1 mL含50%乙腈和1%甲酸的水溶液中，转移至较小的样品容器中。通过真空离心（固定离心速率为268 × g）干燥转移后的样品，通常持续1小时。
   注：甲酸铵的低蒸气压可能导致完全干燥困难。若干燥后仍有大量甲酸铵盐以沉淀形式残留，应重复固相萃取步骤。
5. 将样品重新悬浮于20 µL含0.2%甲酸的水溶液中，并加入保留时间索引（iRT）肽标准混合物。
   注：样品现已准备好用于质谱分析。

4. 分级肽段样品的DIA分析

1. 使用DIA LC-MS/MS方法分析样品，该方法可根据可用的质谱仪器进行调整。分析采用与正交四极杆飞行时间（QqTOF）质谱仪在线联用的nano-LC 2D高效液相色谱系统。
   1. 设置仪器软件，使肽段混合物转移至C18预柱芯片（200 µm x 6 mm C18-CL芯片，3 µm，300 Å），并以2 µL/min流速用上样溶剂（H₂O/0.1%甲酸）冲洗10分钟以脱盐。
   2. 在75 µm x 15 cm C18-CL芯片（3 µm，300 Å）上，以300 nL/min流速，采用2小时梯度，使用典型的（且与LC系统匹配的）水相和乙腈（ACN）溶剂缓冲液对肽段进行色谱分离⁴。
   3. 建立可变窗口DIA方法，其中不同宽度（5至90 m/z）的质量范围窗口以增量方式通过Q1四极杆进入碰撞池，覆盖完整质量范围（m/z 400–1,250）。
      注：3.2秒的循环时间包括一次250毫秒的前体离子扫描，以及对64个SWATH片段中每一个进行45毫秒的累积时间^21,22。
2. 通过DDA MS对样品进行平行分析并构建谱图库以鉴定肽段；或者，也可使用PIQED软件直接从DIA数据中鉴定肽段²³，该软件可处理数据处理、鉴定及导入Skyline进行后续定量的所有技术步骤。

5. 示例数据分析教程

1. 下载 Skyline 软件（http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline）并创建 PanoramaWeb 账户（https://panoramaweb.org）。
   注意：有关使用 Skyline 处理数据的详细教程，请参见（https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials）。也可使用其他软件算法从 DIA 采集数据中提取轻链和重链片段离子峰面积，例如 Open SWATH²⁴，将SWATH 2.0插件导入PeakView²⁵，以及 Spectronaut²⁶.
   1. 下载用于琥珀酰化BSA代表性结果的Skyline数据文件（图3) 从 Panorama Public 获取：https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url。在 Panorama 网页上，进入“Targeted MS Runs”表格，点击右侧的 DOWNLOAD 链接，下载 sky.zip 文件。解压下载的 .zip 文件夹，双击 skyline.sky 文件以在 Skyline 中打开。检查肽段碎片离子目标树（左侧面板）以及来自不同轻度琥珀酰化百分比的四个色谱图（右侧面板）。
   2. 选择“查看”菜单，进入“峰面积 | 重复比较”。窗口右侧将显示包含柱状图的“峰面积 – 重复比较”面板。在峰面积面板中，右键单击并选择“过渡离子 | 单一”，以显示所选碎片离子的碎片离子峰面积。最后，右键单击“峰面积”面板并选择“排序 | 按文件”。
   3. 在窗口左侧的目标树面板中，右键单击肽段“E.LCKVASLRE.T | Ratios To |Oneheavy”，该肽段用于计算轻离子信号与重离子信号的比值（Light/Heavy）。
      注意：这与光链/(重链+光链)的位点占据化学计量比不同。
   4. 注意，目标树现在在轻链片段离子右侧报告 L/H 比值。
2. 确定包含目标酰化位点的“差异化碎片离子”。
   注意：如图所示 图3，以该具体实例为例，鉴定出的差异离子为 y₇ （排名最高），y₈，b₃，以及 b₄注意，在目标树中，非特异性断裂的碎片离子比值为1。
   1. 在左侧目标树状图中，点击肽段 E.LCKVASLRE.T 的 588.30++ 子节点下的 y7 特异性碎片离子
      K [y₇ ] – 902.49+（第一级）[5]
      注意峰高和峰面积的逐渐增加。
   2. 在左侧目标树状图中，点击肽段 E.LCKVASLRE.T 的 588.30++ 子节点下的 y 离子₅ 非碎裂离子 A[y₅ ] – 575.31+（排名第6）[1]. 观察 y₅ 所有样品的碎片离子色谱图和峰面积均保持在相同范围内。
   3. 在目标树状图面板中，浏览其他具有不同分化特征（比例不为1）和无分化特征（比例为1）的碎片离子，观察峰面积柱状图和色谱图中的变化与规律。
   4. 确定不同离子轻、重同位素峰对的精确峰面积，以计算化学计量比（更多细节参见 Meyer 等⁴）。单击“视图 | 文档网格”，文档网格将弹出。在文档网格的左上角，单击“视图 | 转换结果”，即可查看包含碎片离子信息的多列表格，例如肽段序列、前体 m/z、重复名称 等等。
   5. 再次点击文档网格中的“Views”，选择“Edit View”以打开“Customize View”窗口，将报告格式更改为“pivot”。在“Customize View”窗口的左下角，勾选“Pivot Replicate Name”，然后选择“Ok”关闭该窗口。此时可观察到，“Document Grid: Transition Results”表格窗口已重新排列，按重复样本（1%、10%、50%、100% 丁二酰化）对重复样本名称、保留时间、峰面积、背景值、峰等级等列进行分组显示。
   6. 在“文档网格：Transition 结果”表格中，针对肽段“E.LCKVASLRE.T”，找到“Precursor Mz”列、“Fragment Ion”列以及“1pct_light_sw1 Area (1% succinylation)”列。观察到该肽段存在两种前体离子：轻型（前8行中 Precursor Mz 为 588.30）和重型（后8行中 Precursor Mz 为 590.32）。
   7. 在“碎片离子”列中，找到对应于轻链和重链前体离子的 y8 碎片离子的两行。从同一行的 1pct_light_sw1 面积列中，记录 y8 的面积值：轻链为 15,820，重链为 1,426,461。
3. 根据以下公式，利用这些峰面积值计算琥珀酰化化学计量比（即被修饰的比例），得到化学计量比为0.01，即1%琥珀酰化，与该定义混合物中轻度琥珀酰化的比例相符：
   
4. 使用10%琥珀酰化样品的y8特征性片段离子峰面积值，从10pct_light_sw1面积列中获取轻链（144,953）和重链（1,188,041）的峰面积，计算其化学计量比，得到比值为0.10，即10%琥珀酰化。
5. 使用100pct_light_sw1面积列中的y8特征碎片离子峰面积值954,513（轻链）和16,407（重链），计算达到100%琥珀酰化时的化学计量比，得到比值为0.98，即98%琥珀酰化。
6. 类似地，利用1%轻链样品（1pct_light_sw1）面积列中的b3特征碎片离子峰面积值55,697（轻链）和3,149,119（重链），计算1%琥珀酰化修饰的化学计量比，得到比值为0.01，即1%琥珀酰化。
7. 使用该公式对所有不同的碎片离子（包括 y 离子和 b 离子）进行化学计量比计算，以获得 1%、10%、50% 和 100% 琥珀酰化混合物的赖氨酸琥珀酰化化学计量值。

结果

数据采集后，从蛋白水解产生的酰化肽段中确定具有区分性的MS2碎片离子，随后在Skyline中处理相应的提取离子色谱图（XIC），导出对应的轻标和重标峰面积，并最终用于计算修饰位点的占据率。图2A展示了前体离子XIC的示意图，其中包含轻标和重标肽段信号；图2B展示了对应碎片离子XIC的示例，采用颜色编码（红色=轻标；蓝色=重标）以区分含有赖氨酸酰化修饰的碎片离子。

图3 显示由占有率实验所得数据，例如上述分析自制的轻/重标记琥珀酰化BSA在1%、10%、50%或100%预定义比例下的结果，以及相应琥珀酰化修饰占有率的测定。将DIA占有率数据导入Skyline可实现目标树的便捷可视化，同时展示轻链和重链前体离子的肽段序列及碎片离子图3A）。每个定义的琥珀酰化BSA比例的DIA-MS数据均直接揭示了轻链与重链y离子比例的相对差异₇ 离子，来自已鉴定的肽段-质谱匹配中排名最高的差异性碎片离子（以红色标示） 图3B). 图4 展示了通过MS2占有率计算获得的处理结果概览，该结果确认了输入蛋白（此处为预先琥珀酰化的BSA）的赖氨酸琥珀酰化百分比占有率。对来自商业来源的、在特定百分比下预先琥珀酰化的BSA所获得的20个蛋白酶解琥珀酰化肽段，测定了其赖氨酸琥珀酰化占有率例如在0、1、10、50和100%条件下显示 表2对于每种20种蛋白酶解的BSA肽段，使用排名最高且具有区分性的MS2碎片离子计算赖氨酸琥珀酰化（Ksucc）的占据率，表示为L/(L+H)的百分比。总体而言，基于MS2的定量方法在确定酰化占据率方面表现出很高的准确性，即使在低化学计量比条件下也是如此。

图1：化学计量比分析流程。（A）蛋白质经三轮与乙酸酐-d₆ 孵育，以乙酰化未修饰的赖氨酸残基。随后，乙酰化后的蛋白质使用Glu-C内切蛋白酶进行消化，并通过高pH反相色谱对蛋白酶解肽段进行HPLC分级分离。最后，采用具有可变前体离子窗口宽度的DIA模式，通过LC-MS对肽段进行分析。（B）测定琥珀酰化化学计量比的流程与（A）相同，仅将重同位素酰化试剂替换为琥珀酸酐-d₄。该图改编自Meyer et al.⁴（J. Am. Soc. Mass Spectrom.，开放获取）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：可能获得的数据示例及化学计量计算。（A）含有一个乙酰化赖氨酸的轻标（L）和重标（H）MS1前体离子质量相差3个单位。分别对红色和蓝色标示的轻标和重标同位素峰簇生成提取离子色谱图（XIC）。（B）可通过DIA采集得到的MS2碎片离子XIC进行定量分析，使用包含乙酰化位点的、以红色和蓝色标示的可区分的轻标与重标碎片离子。常见的碎片离子以黑色虚线表示，不包含修饰位点。图改编自Meyer et al.⁴（J. Am. Soc. Mass Spectrom.，开放选择）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：不同占据水平下琥珀酰化蛋白酶解 BSA 肽段的 Skyline 可视化结果。 （A）Skyline 目标树，显示蛋白酶解肽段 LCKsuccVASLRE 及其产生的碎片离子。（B）在不同琥珀酰化占据水平下的 Skyline 提取碎片离子色谱图。排名最高的区分性离子 y₇ 的峰面积随着预琥珀酰化 BSA 输入百分比（实验室自制）的增加而相应增加，分别为 1%、10%、50% 和 100%。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：评估预琥珀酰化BSA的BSA酰化化学计量比。 五种不同重修饰百分比的BSA样品（例如在0、1、10、50和100%的轻修饰比例下，对五种不同BSA样品进行MS2占有率测定。根据五种不同BSA样品在特定轻修饰百分比下获得的最高分差异碎片离子，确定了20种琥珀酰化BSA肽段的位点占有率。例如，分别在0、1、10、50和100%条件下。箱须图显示了20个琥珀酰肽段的分布情况，其中50%的肽段数值位于“箱体”内（第25百分位数至第75百分位数），上须线表示第75百分位数至最大值（第100百分位数）的数值范围，下须线表示第25百分位数至最小值（第0百分位数）的数值范围。（J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice）。测量值的定量数据见于 表 2. 请点击此处以查看该图的放大版本。

时间（分钟）	% A	% B
0.00	100	0
7.27	92	8
45.27	73	27
49.27	69	31
65.27	61	39
72.27	40	60
80.00	10	90
85.00	10	90
86.00	100	0
120.00	100	0
流速：0.7 mL/min
缓冲液 A：水中含 10 mM 甲酸铵，pH 10
缓冲液 B：90% 乙腈和 10% 水中含 10 mM 甲酸铵，pH 10
注：两种流动相的 pH 均用纯氨水调节至 10

表1：离线碱性pH反相高效液相色谱分级的梯度程序。 梯度时间：120 分钟。缓冲液A：水中含10 mM甲酸铵，pH 10。缓冲液B：90%乙腈和10%水中含10 mM甲酸铵，pH 10。

L/L+H 百分比	L/L+H 百分比	L/L+H 百分比	L/L+H 百分比	L/L+H 百分比
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50.9	99.2
1.2	2.3	12.3	49.4	97.6
2.9	3.8	14	48.6	99.5
0.5	1.8	11.7	50.8	99.5
0.2	1.7	11.1	48.3	98.2
0.2	1.2	11	47.5	96.1
0.3	1.6	12.8	51	99.2
3.7	5.2	14.7	51.9	89.5
1.5	1.8	12.5	47.2	91.1
0.8	1.5	11.3	48.4	96.8
0.2	1.6	13.9	49.7	98.9
0.1	1.1	10.7	48.2	98.6
0.2	0.9	10.3	49.4	99.4
0.5	2.5	17.2	52.3	97.5
0.1	3.5	20.8	51	99
0.3	1.9	10.7	49.6	98.2
2	1.7	10.9	47.7	96.3
0.3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12.9	57.9	94.1
0.2	1.4	11.6	48.6	98.8

表2：20种蛋白水解琥珀酰化肽段中BSA赖氨酸琥珀酰化占有率的定量分析。 琥珀酰化肽段来源于市售的预琥珀酰化BSA，其琥珀酰化程度已知（例如，0、1%、10%、50%和100%）。针对这20种蛋白水解BSA肽段中的每一种，均选用排名最高且具有区分性的MS2碎片离子来计算赖氨酸琥珀酰化（Ksucc）占有率，以L/(L+H)的百分比表示。

讨论

本方案提供了一种新颖且精确的方法，用于定量位点特异性的赖氨酸乙酰化和琥珀酰化占有率，可应用于整个蛋白质组。该方法依赖于内源性轻肽和外源性重肽的测定，其中后者由合成产生 体外 使用氘代乙酸酐对蛋白质进行定量化学酰化d₆ 或琥珀酸酐-d₄ (图1）。类似方法利用稳定同位素标记天然未修饰的赖氨酸残基，并基于前体离子信号进行位点占据率定量¹² 或DDA采集中的碎片离子^13,14本方案在样品制备过程中采用多个步骤以提高酰化效率，并将化学标记扩展至琥珀酰化。使用数据非依赖采集（DIA）模式进行数据采集，可获得整个可检测质量范围内前体离子和二级碎片离子的强度，从而减少碎片离子干扰。通过Skyline软件及实验室自主开发的自定义脚本进行分析与定量，可实现对含有多个赖氨酸残基或单个位点存在多种酰化修饰的肽段的位点占有率计算。

在本实验方案的样品制备阶段，有几个关键步骤需要严格遵循。由于整个方案依赖于对所有赖氨酸残基进行高效的化学修饰，因此该步骤至关重要。酸酐会与游离的氨基发生反应，因此必须避免蛋白裂解液中含有氨基的缓冲液或污染物分子。此外，在化学全酰化步骤中，每次与酸酐试剂孵育后，需确保将反应混合物的 pH 重新调回 pH 8，因为该反应会使体系酸化，并可能导致 O-酰化副反应的发生。另外，在酶解前，应将含有 8 M 尿素的反应体系稀释至约 0.8 M 尿素，并检查 pH 是否处于最佳范围内，这对于内肽酶 Glu-C 的最佳活性至关重要。本方案的另一个关键环节是数据采集步骤，以及引入了DIA工作流程，该流程可克服DDA数据采样中的不一致性问题，并实现基于MS2片段离子水平的定量分析。DIA方法的一个主要优势在于降低了干扰信号的影响，而这类干扰在对MS1前体离子信号进行定量时通常更为显著且更具问题性（如先前一些文献所指出的）。

在制备高度复杂的样品时，可对实验流程进行多种改进。可在离线碱性pH反相高效液相色谱（HPLC）分级后减少合并的组分数目，以降低后续LC/MS分析样品的复杂性。此外，也可在检测过程中采用更长的色谱梯度，以实现更佳的肽段分离效果。或者，可使用多种蛋白酶对样品进行消化，从而产生更多种类的切割肽段，并提高对蛋白质赖氨酸残基的覆盖度。可采用含有特定乙酰化或琥珀酰化比例的商用BSA进行预实验和条件优化。

该方案的一个局限性在于，由于未考虑其他赖氨酸修饰（如甲基化或泛素化），可能导致位点 occupancy 的轻微高估。 等等。，在同一位置⁴根据轻链和重链酰基化修饰峰面积计算得出的 L/(L+H) 值，位点占有率基于以下假设：赖氨酸位点的总修饰水平仅由内源性的“轻”酰基化（L）和化学标记的“重”酰基化（H）组成。然而，该位点实际的总酰基化占有率 体内 可能还包括乙酰化和/或琥珀酰化以外的其他修饰。此外，所购试剂乙酸酐的报道同位素纯度d₆ （99%）和丁二酸酐-d₄ (>98%）可能导致内源性酰化水平被轻微高估，最多达2%（琥珀酰化）或1%（乙酰化）⁴这些轻微的高估结果共同导致了对占据率低于1%的位点进行定量时的困难。完全化学酰化肽段与天然酰化肽段之间丰度的巨大差异也会导致潜在的位点占据率定量误差，特别是对于内源性酰化程度较低的肽段。²⁷. Weinert 的一项近期研究 等.²⁷ 发现完全全乙酰化肽段之间丰度差异的降低可减少定量误差²⁷.

采用本方案获得的化学计量学定量结果可精确定位特定蛋白质中的重要酰化热点，并为后续生物学实验（如对特定关注位点进行定点突变）提出假设。该方案还可揭示低酰化化学计量比位点的协同效应，这些位点可能对蛋白质结构稳定性及局部细胞环境产生间接或细微的影响。此外，将本方案应用于检测乙酰化、琥珀酰化以及其他可能的赖氨酸酰化修饰（超出乙酰化范围），将独特地揭示在不同生物学条件下蛋白质动态酰化效应的机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸酐水溶液-d6	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	175641-1G	1% 同位素纯度
琥珀酸酐-d4	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	293741	2% 同位素纯度
测序级谷氨酸特异性蛋白酶 Glu-C	罗氏，美国印第安纳州印第安纳波利斯（通过Sigma）	10791156001	1:50 蛋白酶与底物蛋白比例（质量比）
Oasis HLB 固相萃取（SPE）小柱	Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德	WAT 094225
高效液相色谱级乙腈	Burdick 和 Jackson，美国密歇根州马斯基根	BJAH015-4
HPLC级水	Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国	BJAH365-4
碘乙酰胺	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	I1149-25G
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D9779-5G
质谱用 FLUKA 甲酸（FA）	Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒	C988C27	~98%
尿素	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	PI29700
牛血清白蛋白（BSA）	Pierce，罗克福德，伊利诺伊州，美国	88341
三乙基碳酸氢铵（TEAB）	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T7408-100ML
无水二甲基亚砜（DMSO）	Alfa Aesar，特克斯伯里，马萨诸塞州，美国	43998
氢氧化钠（NaOH）	EMDMillipore，美国马萨诸塞州伯灵顿	SX0590
50% 羟胺水溶液	Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	438227-50ML
LC-MS级水	Burdick 和 Jackson，美国密歇根州马斯基根	BJLC365-4
LC-MS乙腈	Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国	BJLC015-4
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG，德国汉堡	T1317-1EA
赛默飞世尔科技 Savant SPD131DDA SpeedVac 浓缩仪	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	SPD131DDA-115
Waters 1525 二元高效液相色谱泵系统	Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德	WAT022939
Waters 2487 双波长紫外检测器	Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德	WAT081110
Waters 717plus 自动进样器	Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德	186001878
安捷伦 Zorbax 300Extend C18 色谱柱	安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉	770995-902
Labconco 冷冻干燥系统 Freezone 4.5 冻干机	Labconco，美国密苏里州堪萨斯城	7751000
保留索引保留时间（iRT）归一化肽标准品	Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D 高效液相色谱系统	美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex LLC，Eksigent 分部	型号# 845
正交四极杆飞行时间（QqTOF）TripleTOF 5600 质谱仪	美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司	每份报价
正交四极杆飞行时间（QqTOF）TripleTOF 6600 质谱仪	美国马萨诸塞州弗雷明汉市 Sciex 公司	按报价
C18 预柱芯片（200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL 芯片，3 μ米，300 Å)	美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司	804-00006
SWATH 2.0 插件集成至 PeakView 2.2	美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司	软件下载 Sciex
Spectronaut	Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦	Sw-3001
C18-CL芯片（75 µm × 15 cm ChromXP, 3 µ米，300 Å)	Sciex LLC，美国马萨诸塞州弗雷明汉	804-00001