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方法文章

利用Pax7和层粘连蛋白抗体通过免疫荧光鉴定骨骼肌卫星细胞

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DOI：

10.3791/57212

⸱

2018年4月19日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institutes of Health, 2Office of Science and Technology, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

准确鉴定卫星细胞对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文介绍了一种通过基于免疫荧光染色的方法在成年骨骼肌切片上鉴定卫星细胞的实验方案。

摘要

免疫荧光是一种有效的方法，可用于鉴定组织切片中的不同细胞类型。为了研究目标细胞群体，需在组织切片上应用针对特定细胞标志物的抗体。在成年骨骼肌中，卫星细胞（SCs）是参与肌肉修复与再生的干细胞。因此，在不同生理条件下对卫星细胞群体进行可视化和追踪显得尤为重要。在静息状态的骨骼肌中，卫星细胞位于基底膜与肌纤维质膜之间。常用于在肌纤维或细胞培养中鉴定卫星细胞的标志物是成对框蛋白Pax7。本文介绍了一种优化后的骨骼肌切片Pax7免疫荧光实验方案，可最大限度减少非特异性染色和背景信号。此外，还加入了一种识别基底膜蛋白（层粘连蛋白）的抗体，以辅助卫星细胞的鉴定。类似的方法也可用于Pax7与其它目标蛋白抗体的双重或三重标记实验。

引言

骨骼肌由多核肌细胞（称为肌管）组成，这些肌细胞有序排列形成肌纤维，通过收缩产生力量和运动。大多数骨骼肌（除部分颅面肌外）起源于一种暂时性的胚胎结构，称为体节1。成肌前体细胞从上皮性体节中分离出来，转变为成肌细胞。成肌细胞进一步分化为肌细胞，随后融合形成多核的肌管，最终构成多核肌纤维。上述过程称为成肌作用（myogenesis），其特征是基因表达在时间上的精确调控。成肌前体细胞表达Pax3和Pax7，而成肌细胞表达MyoD和/或Myf5，肌细胞则表达肌生成素（myogenin）和肌球蛋白（myosins）2,3。肌肉生长是指肌纤维通过将更多肌核整合到已有纤维中（增生）以及肌纤维体积增大（肥大）而变得更为粗大的过程4。在肌肉生长过程中，存在一类具有干细胞特性的成肌细胞持续来源，这类细胞能够自我更新并分化为成熟细胞。这些细胞因其位于肌纤维质膜（肌纤维的细胞膜）与基底膜之间的特定解剖位置而被称为卫星细胞（satellite cells, SCs）5。在幼年阶段（出生后小鼠的前2–3周），卫星细胞积极参与肌肉生长，但在静息状态的成年肌肉中则处于静止状态6。值得注意的是，当肌肉受到损伤时，这些细胞可被重新激活，并分化为新的肌细胞以修复受损组织7。

干细胞的特性使得对干细胞的研究在基础肌肉生物学以及肌肉疾病治疗中均具有重要意义8因此，过去几十年中，该领域一直是深入研究的热点。在解析干细胞的遗传学和表观遗传学方面已取得巨大进展。9,10分离与鉴定干细胞的技术 原位 在过程中逐步开发并优化11免疫荧光染色可通过使用特异性抗体（如针对Pax7的抗体）实现对卫星细胞（SCs）的鉴定。然而，由于卫星细胞数量稀少且体积微小，加之成年骨骼肌组织具有较强的自发荧光，使得其可视化过程颇具挑战性。本文介绍了一种针对小鼠肌肉组织中Pax7的免疫荧光染色方案，该方案在斑马鱼肌肉染色已有方法的基础上进行了优化。12此外，使用带有不同荧光标记的层粘连蛋白抗体以识别位于干细胞下方的基底膜。该方案在所有经测试的生理条件和发育阶段下均能稳定地实现对Pax7阳性干细胞及成肌前体细胞的可视化观察。

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方案

在本实验方案中，以成年小鼠（2-6个月）的前部后肢肌肉——胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）为例，对其卫星细胞（SCs）进行免疫荧光染色。所有涉及小鼠操作及肌肉组织解剖的步骤均已经过美国国立关节炎、肌骨骼和皮肤病研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准。

1. 从小鼠后肢解剖分离胫骨前肌/趾长伸肌

  1. 根据美国国立卫生研究院（NIH）动物护理和使用委员会（ACUC）的指南，将小鼠置于充满CO2的安乐死舱内实施安乐死。如有需要，可进行颈椎脱位。
  2. 将小鼠仰面放置于解剖垫上，用70%乙醇喷洒其腹部皮肤。在小鼠腹部皮肤中央水平切开1-2 cm的切口，然后将切口处皮肤向小鼠足部方向剥离，暴露一侧后肢。
  3. 使用两把尖头镊子：一把夹住连接胫前肌（TA）/趾长伸肌（EDL）与踝关节的肌腱，另一把用于剪开并剥离覆盖在TA/EDL上的筋膜。筋膜剥离后，用镊子尖端从TA/EDL肌肉下方轻轻滑行，将肌肉从胫骨上分离。
  4. 用剪刀在仍用镊子夹住肌腱的情况下剪断踝部肌腱。沿TA/EDL的纵轴方向，从踝部向膝部用剪刀修剪肌肉，同时用镊子从踝部一侧提起TA/EDL肌肉。最后剪断膝部侧的肌腱，将完整的TA/EDL肌肉从胫骨上完全分离。

2. 胫骨前肌/趾长伸肌的冷冻包埋

  1. 在容器中准备液氮浴， 例如，液氮杜瓦瓶。将甲基丁烷倒入一个小的塑料烧杯中（约20 mL），装至半满。然后将烧杯放入液氮浴中冷冻。数分钟后，检查甲基丁烷是否已完全冻结。
    注意：液氮可用一桶干冰替代，但冷冻速度较慢。
  2. 将分离的胫骨前肌/趾长伸肌（TA/EDL）置于小型塑料注射器推杆的平坦表面，用数滴最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂（冷冻介质）完全覆盖。
  3. 将甲基丁烷烧杯从液氮浴中取出，用温热的物体融化其表面例如将覆盖有O.C.T.的TA/EDL连同活塞迅速浸入熔化的甲基丁烷中，以实现组织的速冻。
  4. 用镊子将包埋的组织从柱塞上取下，放入1.5 mL 微离心管中。将管子置于液氮中保存，以便继续处理其他样品。
    注意：包埋的组织可在 -80 °C 长期保存（2 年）或在 -20 °C 短期保存（6 个月）。

3. 冷冻切片

  1. 在冷冻切片机样品架的中央滴加一滴O.C.T.包埋剂。等待O.C.T.包埋剂几乎完全凝固后，迅速将包埋的TA/EDL肌肉组织垂直粘附于O.C.T.上，确保踝端朝下、膝端朝上。
  2. 将样品架安装至冷冻切片机上，以10 µm间隔切片，并将冷冻切片收集到经防冻处理的载玻片上，每张载玻片上放置约4–8个切片。
  3. 在室温下干燥切片至少3小时至过夜。
    注意：尽管将切片在冷冻条件下干燥过夜或更长时间也可接受，但这不可避免地会增加自发荧光。为获得最佳效果，建议干燥0.5小时后立即进行固定和染色步骤。
  4. 将载玻片收集至玻片盒中，可立即使用，或于-80 °C或-20 °C保存以备后续使用。

4. 免疫荧光染色试剂的准备

  1. 准备缓冲液：
    1. 用10x PBS配制2 L的1x磷酸盐缓冲液（PBS）。
    2. 用16% PFA在1x PBS中配制40 mL的4%多聚甲醛（PFA）。
    3. 配制2 L的PBST：含0.1% Triton-100的1x PBS。
    4. 配制50 mL的PBST-B：在PBST中加入2%牛血清白蛋白（BSA）。
    5. 配制10 mL的PBST-B-G：在PBST中加入2% BSA和5%正常山羊血清。
    6. 配制1 mL封闭液：将AffiniPure Fab片段山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体按1:10比例稀释于PBST-B中。
    7. 配制200 mL的1x柠檬酸盐缓冲液。
      注意：上述溶液的体积足以用于至少5张载玻片。应根据载玻片数量和玻片容器的大小调整体积。
  2. 准备抗体染色液：
    1. 一抗（工作浓度）：在PBST-B-G中配制1.2 mL一抗混合液，包含Pax7单克隆小鼠抗体（IgG1）（1–5 µg/mL）、层粘连蛋白多克隆兔抗体（0.5–2 µg/mL）以及MF20单克隆小鼠抗体（IgG2b）（0.5–2.5 µg/mL）。
      注意：MF20单克隆小鼠抗体（IgG2b）为可选。
    2. 二抗（工作浓度）：在PBST-B-G中配制1.2 mL二抗混合液，包含Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG1交叉吸附二抗（0.5–2 µg/mL）、Alexa Fluor Plus 555标记的山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗（0.5–2 µg/mL）以及Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG2b交叉吸附二抗（0.5–2 µg/mL）。
      注意：Alexa Fluor 647为可选。

5. 免疫荧光染色步骤

  1. 用PFA复水并固定冷冻切片。
    1. 从载玻片盒中取出几张TA/EDL冷冻切片载玻片。将载玻片置于载片托盘中，在室温下使其回暖。
    2. 使用液体阻断笔（PAP笔）在载玻片上画出包含所有冷冻切片的区域。该圆圈可防止溶液从载玻片上流走。
    3. 将托盘移至实验室通风橱内。在画好的区域内向载玻片上加入300–500 µL的4% PFA，在室温下固定10分钟。随后在载片容器中用1×PBS至少清洗3次，每次5分钟。
      注意：PFA具有毒性且属于危险废物，操作时应小心，并将其弃置于危险废物容器中。
  2. 抗原修复
    1. 在另一个载片容器中加入200 mL柠檬酸盐缓冲液。
    2. 将载玻片转移至该容器中，再将容器连同载玻片一起放入压力锅中，在高压模式下加热10分钟。
    3. 用流水冷却容器10分钟。将所有载玻片转移至盛有PBST（200 mL）的新容器中，用PBST至少清洗3次，每次5分钟。
  3. 封闭
    1. 在放置载玻片的托盘中加入吸水湿润的擦镜纸（kimwipes），以创造湿润环境，防止载玻片干燥。
    2. 将载玻片放回托盘，每张载玻片上加200 µL封闭液。用盖子盖住托盘，室温下封闭30分钟。
      注意：Pax7抗体为小鼠单克隆抗体，因此在小鼠肌肉组织中会出现小鼠IgG的非特异性结合，导致背景信号较高。使用AffiniPure Fab片段山羊抗小鼠IgG（H+L）可阻断小鼠对小鼠的非特异性结合。
  4. 孵育一抗。
    1. 在载片容器中用PBST清洗载玻片一次，然后将载玻片放回染色托盘。
    2. 每张载玻片上加200 µL一抗混合液，盖上托盘盖，在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。
      注意：4 °C过夜孵育效果最佳，但室温孵育也可获得满意结果。可在一抗混合液中加入肌球蛋白MF20抗体，实现三重标记（Pax7、Laminin、MF20）。MF20可标记已分化的肌纤维。此步骤同时作为另一轮封闭步骤，使用PBST-B-G以减少下一步中二抗（山羊抗体）可能产生的非特异性结合。
  5. 孵育二抗。
    1. 在室温下用PBST至少清洗一抗3次，每次5分钟。
    2. 每张载玻片上加200 µL二抗混合液，在室温下孵育至少1小时。
      注意：对于Pax7+Laminin染色，使用山羊抗小鼠IgG1 Alexa 488和山羊抗兔Alexa 555；
      对于Pax7+Laminin+MF20三重染色，在混合液中额外加入山羊抗小鼠IgG2b Alexa 647。
    3. 用PBST至少清洗二抗3次，每次5分钟。
  6. DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）复染与封片
    1. 在载片容器中用PBST稀释DAPI（1:20,000），例如，将10 µL DAPI加入200 mL PBST中。
    2. 将载玻片置于DAPI溶液中染色3分钟。
    3. 用PBST清洗DAPI至少5次，每次5分钟。
    4. 用封片剂封片，并加盖盖玻片。
      注意：DAPI具有毒性和危害性，操作时应小心，并弃置于危险废物瓶中。

6. 荧光显微镜

注意：上述免疫荧光染色方案可使用宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜对施万细胞（SCs）进行可视化观察。初学者可能在识别施万细胞时遇到困难。以下是一些推荐步骤，可能有所帮助。

  1. 使用 DAPI 通道和低倍物镜观察载玻片上的切片。
  2. 将放大倍数从低倍切换至高倍。为观察卫星细胞（SCs），至少需要使用 20X 物镜。
  3. 使用 488（FITC）/555（Rhodamine）双滤光片同时观察 Pax7 和层粘连蛋白（Laminin）信号，以识别卫星细胞。在此设置下，Pax7 染色信号与背景噪声的对比度更佳。
  4. 快速在 FITC 和 DAPI 通道之间切换，以准确识别卫星细胞。所有卫星细胞均应为 Pax7/DAPI 阳性。

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结果

按照上述步骤，可在荧光显微镜下成功观察到成年静息状态肌肉切片中的卫星细胞（SCs）（图1）。尽管成年肌肉组织在某些类型的肌纤维中具有较强的自发荧光，但明亮的Alexa系列染料能够克服背景噪声，使信号清晰可见（图1A、B；箭头所示）。双光子共聚焦显微镜所获得的图像（图1B）相较于宽场荧光显微镜（图1A）更为清晰。该相同方案在幼年小鼠肌肉组织（图2A）、小鼠胚胎肌肉组织（图2B）以及损伤后的成年肌肉组织（图3）中同样效果良好。在幼年及胚胎肌肉组织中，存在更多被激活的卫星细胞（SCs）（图2...

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讨论

上述方案基于斑马鱼骨骼肌Pax7/MF20染色的方法12。所用溶液及封闭步骤相同或相似，抗体也完全一致。调整的步骤是根据小鼠肌肉组织和卫星细胞（SCs）的特性而优化的。首先，在抗体混合液中加入了Laminin抗体，以帮助观察并确认卫星细胞的位置。在使用488/555双滤光片时，该方法尤其有助于在显微镜下准确计数卫星细胞数量；这显著增强了由卫星细胞产生的Pax7信号，使其从自发荧光的背景噪声中清晰显现。其次，由于所用Pax7抗体为小鼠来源的抗体，我们增加了一步鼠抗鼠封闭（步骤5.3），以减少小鼠IgG非特异性结合所导致的背景信号。第三，抗原修复步骤（步骤5.2）对于在PFA固定的组织中进行Pax7抗体染色至关重要。

相同的实验方案也应用于较年轻的 小鼠（幼鼠和胚胎）的肌肉组织（图2）。事实上，使用该方案在幼鼠中观察到的卫星细胞（SCs）比在成年小鼠中更易于识别。建议初学者可先在幼鼠肌肉组织上进行卫星细胞染色，以积累经验，再开展成年小鼠组织的实验。每次实验均需设置不加一抗的阴性对...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢美国国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）光学成像部门提供显微镜设备和技术支持。MF20和Pax7抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）资助建立，并由爱荷华大学（The University of Iowa, Iowa City）生物科学系负责维护。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）院内研究计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甲基丁烷Sigma-AldrichM32631
最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂Electron Microscopy Sciences62550-01
10x PBSGibco, Themo Fisher70011-044
16% PFATED PELLA50-00-0
Triton-100Sigma-AldrichT8787
正常山羊血清Thermo Fisher0 1-6201
AffiniPure Fab 片段山羊抗小鼠 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-007-003
20x 柠檬酸盐缓冲液Thermo Fisher00 500
Pax7 单克隆小鼠抗体 (IgG1)（上清液）发育研究杂交瘤库N/A
层粘连蛋白多克隆兔抗体Sigma-AldrichL9393
MF20 单克隆小鼠抗体 (IgG2b)（上清液）发育研究杂交瘤库N/A
山羊抗小鼠 IgG1 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记Thermo FisherA-21121
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记Thermo FisherA-21242
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555 标记Thermo FisherA32732
Leica CM1860 冷冻切片机
Leica DM6000 宽场荧光显微镜
Leica DMR 宽场荧光显微镜
Zeiss LSM510 共聚焦显微镜
Zeiss LSM780 共聚焦显微镜
Cuisinart 电子压力锅

参考文献

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  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).

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