准确鉴定卫星细胞对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文介绍了一种通过基于免疫荧光染色的方法在成年骨骼肌切片上鉴定卫星细胞的实验方案。
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方法文章
利用Pax7和层粘连蛋白抗体通过免疫荧光鉴定骨骼肌卫星细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
免疫荧光是一种有效的方法，可用于鉴定组织切片中的不同细胞类型。为了研究目标细胞群体，需在组织切片上应用针对特定细胞标志物的抗体。在成年骨骼肌中，卫星细胞（SCs）是参与肌肉修复与再生的干细胞。因此，在不同生理条件下对卫星细胞群体进行可视化和追踪显得尤为重要。在静息状态的骨骼肌中，卫星细胞位于基底膜与肌纤维质膜之间。常用于在肌纤维或细胞培养中鉴定卫星细胞的标志物是成对框蛋白Pax7。本文介绍了一种优化后的骨骼肌切片Pax7免疫荧光实验方案，可最大限度减少非特异性染色和背景信号。此外，还加入了一种识别基底膜蛋白（层粘连蛋白）的抗体，以辅助卫星细胞的鉴定。类似的方法也可用于Pax7与其它目标蛋白抗体的双重或三重标记实验。
引言
骨骼肌由多核肌细胞（称为肌管）组成，这些肌细胞有序排列形成肌纤维，通过收缩产生力量和运动。大多数骨骼肌（除部分颅面肌外）起源于一种暂时性的胚胎结构，称为体节1。成肌前体细胞从上皮性体节中分离出来，转变为成肌细胞。成肌细胞进一步分化为肌细胞，随后融合形成多核的肌管，最终构成多核肌纤维。上述过程称为成肌作用（myogenesis），其特征是基因表达在时间上的精确调控。成肌前体细胞表达Pax3和Pax7，而成肌细胞表达MyoD和/或Myf5，肌细胞则表达肌生成素（myogenin）和肌球蛋白（myosins）2,3。肌肉生长是指肌纤维通过将更多肌核整合到已有纤维中（增生）以及肌纤维体积增大（肥大）而变得更为粗大的过程4。在肌肉生长过程中，存在一类具有干细胞特性的成肌细胞持续来源，这类细胞能够自我更新并分化为成熟细胞。这些细胞因其位于肌纤维质膜（肌纤维的细胞膜）与基底膜之间的特定解剖位置而被称为卫星细胞（satellite cells, SCs）5。在幼年阶段（出生后小鼠的前2–3周），卫星细胞积极参与肌肉生长，但在静息状态的成年肌肉中则处于静止状态6。值得注意的是，当肌肉受到损伤时，这些细胞可被重新激活，并分化为新的肌细胞以修复受损....
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方案
在本实验方案中，以成年小鼠（2-6个月）的前部后肢肌肉——胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）为例，对其卫星细胞（SCs）进行免疫荧光染色。所有涉及小鼠操作及肌肉组织解剖的步骤均已经过美国国立关节炎、肌骨骼和皮肤病研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准。
1. 从小鼠后肢解剖分离胫骨前肌/趾长伸肌
- 根据美国国立卫生研究院（NIH）动物护理和使用委员会（ACUC）的指南，将小鼠置于充满CO2的安乐死舱内实施安乐死。如有需要，可进行颈椎脱位。
- 将小鼠仰面放置于解剖垫上，用70%乙醇喷洒其腹部皮肤。在小鼠腹部皮肤中央水平切开1-2 cm的切口，然后将切口处皮肤向小鼠足部方向剥离，暴露一侧后肢。
- 使用两把尖头镊子：一把夹住连接胫前肌（TA）/趾长伸肌（EDL）与踝关节的肌腱，另一把用于剪开并剥离覆盖在TA/EDL上的筋膜。筋膜剥离后，用镊子尖端从TA/EDL肌肉下方轻轻滑行，将肌肉从胫骨上分离。
- 用剪刀在仍用镊子夹住肌腱的情况下剪断踝部肌腱。沿TA/EDL的纵轴方向，从踝部向膝部用剪刀修剪肌肉，同时用镊子从踝部一侧提起TA/EDL肌肉。最后剪断膝部侧的肌腱，将完整的TA/EDL肌肉从胫骨上完全分离。
2. 胫骨前肌/趾长伸肌的冷冻包埋
- 在容器中准备液氮浴， 例....
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结果
按照上述步骤，可在荧光显微镜下成功观察到成年静息状态肌肉切片中的卫星细胞（SCs）（图1）。尽管成年肌肉组织在某些类型的肌纤维中具有较强的自发荧光，但明亮的Alexa系列染料能够克服背景噪声，使信号清晰可见（图1A、B；箭头所示）。双光子共聚焦显微镜所获得的图像（图1B）相较于宽场荧光显微镜（图1A）更为清晰。该相同方案在幼年小鼠肌肉组织（图2A）、小鼠胚胎肌肉组织（图2B）以及损伤后的成年肌肉组织（图3）中同样效果良好。在幼年及胚胎肌肉组织中，存在更多被激活的卫星细胞（SCs）（图2.......
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讨论
上述方案基于斑马鱼骨骼肌Pax7/MF20染色的方法12。所用溶液及封闭步骤相同或相似，抗体也完全一致。调整的步骤是根据小鼠肌肉组织和卫星细胞（SCs）的特性而优化的。首先，在抗体混合液中加入了Laminin抗体，以帮助观察并确认卫星细胞的位置。在使用488/555双滤光片时，该方法尤其有助于在显微镜下准确计数卫星细胞数量；这显著增强了由卫星细胞产生的Pax7信号，使其从自发荧光的背景噪声中清晰显现。其次，由于所用Pax7抗体为小鼠来源的抗体，我们增加了一步鼠抗鼠封闭（步骤5.3），以减少小鼠IgG非特异性结合所导致的背景信号。第三，抗原修复步骤（步骤5.2）对于在PFA固定的组织中进行Pax7抗体染色至关重要。
相同的实验方案也应用于较年轻的 小鼠（幼鼠和胚胎）的肌肉组织（图2）。事实上，使用该方案在幼鼠中观察到的卫星细胞（SCs）比在成年小鼠中更易于识别。建议初学者可先在幼鼠肌肉组织上进行卫星细胞染色，以积累经验，再开展成年小鼠组织的实验。每次实验均需设置不加一抗的阴性对.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢美国国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）光学成像部门提供显微镜设备和技术支持。MF20和Pax7抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）资助建立，并由爱荷华大学（The University of Iowa, Iowa City）生物科学系负责维护。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）院内研究计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基丁烷 | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| 最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂 | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab 片段山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x 柠檬酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 单克隆小鼠抗体 (IgG1)（上清液） | 发育研究杂交瘤库 | N/A | |
| 层粘连蛋白多克隆兔抗体 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 单克隆小鼠抗体 (IgG2b)（上清液） | 发育研究杂交瘤库 | N/A | |
| 山羊抗小鼠 IgG1 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| 山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555 标记 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 冷冻切片机 | |||
| Leica DM6000 宽场荧光显微镜 | |||
| Leica DMR 宽场荧光显微镜 | |||
| Zeiss LSM510 共聚焦显微镜 | |||
| Zeiss LSM780 共聚焦显微镜 | |||
| Cuisinart 电子压力锅 |
参考文献
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
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重印与许可
