分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

摘要

本文介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca²⁺ 内流的实验方案。针对分离的线粒体，我们详细描述了一种基于酶标仪的 Ca²⁺ 摄取检测方法，该方法使用对 Ca²⁺ 敏感的染料钙绿素绿-5N（calcium green-5N）。对于培养细胞，我们描述了一种使用 Ca²⁺ 染料 Rhod-2/AM 的共聚焦显微镜检测方法。

摘要

线粒体对 Ca²⁺ 的调控是一项关键功能，可调节多种细胞中的生理及病理生理过程。准确测量线粒体 Ca²⁺ 的内流与外流，对于明确线粒体 Ca²⁺ 调控在这些过程中的作用至关重要。本报告中，我们介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca²⁺ 调控的方法。首先，我们详细描述了一种基于酶标仪的平台，利用 Ca²⁺ 敏感染料钙绿-5N（calcium green-5N）来检测线粒体 Ca²⁺ 摄取。该酶标仪检测方法无需特殊设备，且钙绿-5N 染料特别适用于测量从组织中分离的线粒体的 Ca²⁺ 水平。在本应用中，我们描述了从小鼠心脏组织分离的线粒体中检测其 Ca²⁺ 摄取的过程；然而，该方法也可用于测量从其他组织（如肝脏、骨骼肌和脑组织）分离的线粒体的 Ca²⁺ 摄取。其次，我们描述了一种基于共聚焦显微镜的检测方法，利用 Ca²⁺ 敏感染料 Rhod-2/AM 并结合二维激光扫描显微成像技术，用于测量通透化细胞中的线粒体 Ca²⁺ 水平。该通透化方案可消除胞质染料的干扰，从而特异性地记录线粒体 Ca²⁺ 的变化。此外，激光扫描显微镜具有高帧率成像能力，可捕捉线粒体 Ca²⁺ 在外部溶液中加入不同药物或试剂后发生的快速变化。该方案可用于多种细胞类型的线粒体 Ca²⁺ 摄取检测，包括原代细胞（如心肌细胞和神经元）以及永生化细胞系。

引言

线粒体是细胞内钙离子（Ca²⁺）储存和信号传导的关键位点。数十年的研究表明，线粒体具有摄取和隔离Ca²⁺的能力^1,2。然而，线粒体不仅仅是被动的Ca²⁺储存场所。在线粒体区室中，Ca²⁺发挥着重要的信号功能，包括调控代谢输出以及激活线粒体介导的细胞死亡通路，这些内容已有综述³。在代谢调控方面，Ca²⁺可增强三羧酸循环中三种定位于基质的脱氢酶以及呼吸链复合物的活性，从而提高线粒体的能量生成能力^4,5。当发生线粒体Ca²⁺超载或Ca²⁺稳态失调时，Ca²⁺会触发线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，导致线粒体内膜通透性增加、膜电位丧失、线粒体功能障碍、肿胀、破裂，最终引发细胞死亡^6,7,8,9。因此，线粒体Ca²⁺

方案

本方案中描述的所有方法均已获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会的批准。

注意：第一部分是使用酶标仪测定分离的心脏线粒体中线粒体 Ca²⁺ 内流的实验步骤。

1. 试剂与溶液

1. 配制500 mL用于线粒体分离的MS-EGTA缓冲液：225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），用KOH调节pH至7.4。经0.22 μm滤膜除菌后，于4 °C保存。使用前确保MS-EGTA缓冲液已预冷至4 °C。
2. 配制100 mL KCl缓冲液：125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH₂PO₄、2 mM MgCl₂、40 μM EGTA，用KOH调节pH至7.2。室温保存。
3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制1 mM钙绿-5N储备液。钙绿-5N储备液可分装后于-20 °C保存。
4. 配制Ca²⁺摄取的底物。
   1. 配制1 M丙酮酸钠溶液，pH 7.4。分装后于-20 °C保存。
   2. 配制500 mM苹果酸溶液，pH 7.4。分装后于-20 °C保存。

结果

图1 显示线粒体 Ca²⁺ 使用基于酶标仪平台和Ca的分离心脏线粒体摄取测量²⁺ 染料钙绿-5N。在对照条件下（图1A），将心脏线粒体悬浮于含钙绿素绿-5N的KCl缓冲液中，随后依次施加CaCl₂脉冲刺激₂ (5 μL 0.6 mM CaCl₂ 溶液）分别在 30 s、150 s、300 s、480 s 和 690 s 时间点加入。CaCl₂ 添加的时间和次数₂ 用户可根据需要调整添加量，以确保线粒体完全摄取所添加的 Ca²⁺ 在后续添加之前。在此检测中，钙绿-5N 信号的增加反映了缓冲液中 Ca²⁺ 浓度的升高²⁺ 水平。由于线粒体可摄取 Ca²⁺，Ca²⁺ 从缓冲液中移除后，钙绿-5N荧光减弱。重要的是，在第三次添加Ca时²⁺，钙绿-.......

讨论

本文介绍了两种不同的方法来测量线粒体 Ca²⁺ 内流。基于酶标仪的钙绿素-5N 方法用于监测线粒体外 Ca²⁺ 水平，是一种适用于分离线粒体的 Ca²⁺ 摄取检测方法。尽管我们展示的是从小鼠心脏线粒体分离得到的代表性结果，但该方法也可轻松适用于从富含线粒体的组织（如肝脏、骨骼肌和脑组织）中分离的线粒体。此外，对于缺乏传统用于 Ca²⁺ 测量的专用设备（如荧光分光光度计）的实验室而言，酶标仪系统可能是一个理想选择。然而，与荧光分光光度计相比，酶标仪扫描时间窗口有限，且需要预先编程试剂添加步骤，这可能是该技术的不足之处；但考虑到荧光分光光度计的成本和可及性，这一劣势可能被抵消。通过调整试剂加样器中 Ca²⁺ 的浓度，可测定线粒体在触发线粒体通透性转换孔（MPTP）开放前所能螯合的 Ca²⁺ 量（即线粒体 Ca²⁺ 容量）。

我们所描述的用于线粒体Ca²⁺测定的Rhod-2/AM共聚焦成像方案²⁺ 适用于培养细胞，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
奥林巴斯 FV1000 激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
配备注射器的 Synergy Neo2 多功能微孔板读板仪	Biotek
组织匀浆器	Kimble	886000-0022
22 × 22 mm 盖玻片	Corning	2850-22
96 孔板	Corning	3628
6 孔板	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-甘露醇	Sigma	M9546
蔗糖	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
氯化钾	Fisher	BP366-500
磷酸二氢钾	Sigma	P0662
氯化镁	Sigma	M2670
丙酮酸钠	Sigma	P2256
L-苹果酸	Sigma	M1125
氯化钙	Sigma	C4901
乙酸钾	Fisher	BP364-500
三磷酸腺苷镁盐（Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt）	Sigma	A9187
磷酸肌酸二钠盐	Sigma	P7936
皂苷	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440