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方法文章

分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

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DOI：

10.3791/57225

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2018年4月27日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Emory College of Arts and Sciences, Emory University

本文内容

摘要

本文介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca2+ 内流的实验方案。针对分离的线粒体，我们详细描述了一种基于酶标仪的 Ca2+ 摄取检测方法，该方法使用对 Ca2+ 敏感的染料钙绿素绿-5N（calcium green-5N）。对于培养细胞，我们描述了一种使用 Ca2+ 染料 Rhod-2/AM 的共聚焦显微镜检测方法。

摘要

线粒体对 Ca2+ 的调控是一项关键功能，可调节多种细胞中的生理及病理生理过程。准确测量线粒体 Ca2+ 的内流与外流，对于明确线粒体 Ca2+ 调控在这些过程中的作用至关重要。本报告中，我们介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca2+ 调控的方法。首先，我们详细描述了一种基于酶标仪的平台，利用 Ca2+ 敏感染料钙绿-5N（calcium green-5N）来检测线粒体 Ca2+ 摄取。该酶标仪检测方法无需特殊设备，且钙绿-5N 染料特别适用于测量从组织中分离的线粒体的 Ca2+ 水平。在本应用中，我们描述了从小鼠心脏组织分离的线粒体中检测其 Ca2+ 摄取的过程；然而，该方法也可用于测量从其他组织（如肝脏、骨骼肌和脑组织）分离的线粒体的 Ca2+ 摄取。其次，我们描述了一种基于共聚焦显微镜的检测方法，利用 Ca2+ 敏感染料 Rhod-2/AM 并结合二维激光扫描显微成像技术，用于测量通透化细胞中的线粒体 Ca2+ 水平。该通透化方案可消除胞质染料的干扰，从而特异性地记录线粒体 Ca2+ 的变化。此外，激光扫描显微镜具有高帧率成像能力，可捕捉线粒体 Ca2+ 在外部溶液中加入不同药物或试剂后发生的快速变化。该方案可用于多种细胞类型的线粒体 Ca2+ 摄取检测，包括原代细胞（如心肌细胞和神经元）以及永生化细胞系。

引言

线粒体是细胞内钙离子（Ca2+）储存和信号传导的关键位点。数十年的研究表明，线粒体具有摄取和隔离Ca2+的能力1,2。然而，线粒体不仅仅是被动的Ca2+储存场所。在线粒体区室中，Ca2+发挥着重要的信号功能，包括调控代谢输出以及激活线粒体介导的细胞死亡通路，这些内容已有综述3。在代谢调控方面，Ca2+可增强三羧酸循环中三种定位于基质的脱氢酶以及呼吸链复合物的活性，从而提高线粒体的能量生成能力4,5。当发生线粒体Ca2+超载或Ca2+稳态失调时，Ca2+会触发线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，导致线粒体内膜通透性增加、膜电位丧失、线粒体功能障碍、肿胀、破裂，最终引发细胞死亡6,7,8,9。因此，线粒体Ca2+信号通过代谢调控和MPTP介导的死亡轴，直接影响细胞的生存与死亡通路。

近年来，随着线粒体Ca2+单向转运体复合物（一种位于线粒体内膜、介导Ca2+进入线粒体基质的主要转运蛋白）的分子组分被陆续鉴定，人们对线粒体Ca2+动态变化的研究兴趣迅速增长10,11,12。这些转运体结构亚基和调控亚基的发现，使得通过遗传学手段靶向调控线粒体Ca2+内流以调节线粒体功能与功能障碍成为可能，并推动了关于单向转运体复合物及线粒体Ca2+内流在疾病中作用的研究13,14,15。事实上，线粒体Ca2+信号已被证实参与多种疾病的病理过程，包括心脏疾病、神经退行性疾病以及癌症16,17,18,19,20。

鉴于线粒体Ca2+信号在代谢和细胞死亡中的基础性作用，以及线粒体Ca2+信号所影响的生物学系统的广泛性，评估线粒体Ca2+内流的方法具有重要意义。毫不奇怪，目前已开发出多种用于检测线粒体Ca2+的技术和工具。这些方法包括利用荧光Ca2+敏感染料21,22，以及靶向线粒体的基因编码Ca2+传感器（如嵌合蛋白cameleon和水母发光蛋白aequorin）23,24。本文旨在介绍可用于测量线粒体Ca2+摄取的不同方法和模型系统。我们展示了两种用于评估线粒体Ca2+内流能力的实验方法。以心脏线粒体为例，我们详细描述了一种基于酶标仪的平台，该方法使用Ca2+敏感染料calcium green-5N来测定线粒体Ca2+摄取，特别适用于分离组织来源的线粒体14。此外，利用培养的NIH 3T3细胞，我们还介绍了一种基于共聚焦显微镜成像的检测方法，通过使用Ca2+敏感染料Rhod-2/AM，在透化细胞中测量线粒体Ca2+25。

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方案

本方案中描述的所有方法均已获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会的批准。

注意：第一部分是使用酶标仪测定分离的心脏线粒体中线粒体 Ca2+ 内流的实验步骤。

1. 试剂与溶液

  1. 配制500 mL用于线粒体分离的MS-EGTA缓冲液：225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），用KOH调节pH至7.4。经0.22 μm滤膜除菌后，于4 °C保存。使用前确保MS-EGTA缓冲液已预冷至4 °C。
  2. 配制100 mL KCl缓冲液：125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH2PO4、2 mM MgCl2、40 μM EGTA，用KOH调节pH至7.2。室温保存。
  3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制1 mM钙绿-5N储备液。钙绿-5N储备液可分装后于-20 °C保存。
  4. 配制Ca2+摄取的底物。
    1. 配制1 M丙酮酸钠溶液，pH 7.4。分装后于-20 °C保存。
    2. 配制500 mM苹果酸溶液，pH 7.4。分装后于-20 °C保存。

2. 心脏线粒体的分离

  1. 根据机构标准对小鼠实施安乐死。
    注意：在本机构批准的安乐死方法中，小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，随后通过颈椎脱位处死。
  2. 打开胸腔，沿肋骨两侧剪开，暴露心脏，切除膈肌，并取出心脏组织。
    注意：本方案中，线粒体分离使用成年小鼠完整心脏（约120 mg），足以进行3–4次实验。若从其他富含线粒体的组织（如肝脏）中分离线粒体，可按照本方案使用最多200 mg组织。
  3. 用25 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗组织，确保将心室中的所有血液挤出。
    注意：当从心脏挤出的液体变得清澈时，表明冲洗充分。
  4. 使用一把锋利的剪刀，在5 mL预冷的1× PBS中将心脏剪成小块。
  5. 弃去PBS，将剪碎的心脏组织转移至预冷的7 mL玻璃-聚四氟乙烯Dounce匀浆器中，匀浆器间隙为0.10至0.15 mm。
  6. 加入5 mL预冷的MS-EGTA缓冲液，匀浆至肉眼不可见组织碎片（约11次冲捣）。
    注意：避免过度匀浆，因为实验目标是获得完整且具有功能的线粒体。
  7. 将匀浆液转移至15 mL离心管中。
  8. 在4 °C下以600 × g离心5分钟，沉淀细胞核和未破碎的细胞。
  9. 将上清液转移至新的15 mL离心管中，在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，沉淀线粒体。
  10. 弃去上清液，将线粒体沉淀置于冰上保存。
  11. 使用预冷的MS-EGTA缓冲液洗涤线粒体沉淀两次。每次洗涤时，将线粒体沉淀重悬于5 mL MS-EGTA缓冲液中，在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，然后弃去上清液。
  12. 最后一次洗涤后，弃去上清液，将线粒体重悬于100 μL预冷的MS-EGTA缓冲液中，置于冰上保存。
    注意：线粒体应在1小时内用于实验。
  13. 使用Bradford蛋白测定法测定线粒体蛋白浓度26。

3. 基于酶标仪的线粒体钙离子摄取测量

注意：此处描述的是使用配备注射器的多功能酶标仪分析线粒体 Ca2+ 摄取的实验方案。任何能够在避光条件下以动力学模式读取钙绿-5N 荧光（激发/发射波长为 506/532 nm）并具备自动试剂注射功能的酶标仪均可使用。

  1. 设置酶标仪以每秒一次的频率对钙绿-5N荧光进行动力学检测，总检测时间为1,000秒。同时，设置试剂注射器在30秒、150秒、300秒、480秒和690秒时分别注入5 μL的CaCl2溶液。
    注意：CaCl2注射的时间点由用户自定义，可根据实验需求进行调整。
  2. 用待使用的CaCl2溶液对试剂注射器进行预充。
    注意：CaCl2溶液的浓度由用户自定义，可在后续实验中调整，以滴定诱导MPTP开放所需的Ca2+量。
  3. 将200 μg线粒体加入96孔板的单个孔中。
  4. 向孔中加入适量KCl缓冲液，使线粒体与KCl缓冲液的总体积达到197 μL。
  5. 向线粒体混合物中加入1 μL的1 M丙酮酸和1 μL的500 mM苹果酸。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育2分钟，使线粒体充分活化。
  6. 加入1 μL的1 mM钙绿-5N储备液。通过移液轻轻混匀。
    注意：加入钙绿-5N染料后，应避免反应体系暴露于光线下。
  7. 启动预设的动力学检测程序，监测钙绿-5N荧光信号。

4. 试剂与溶液

注意：第二部分为培养细胞中线粒体 Ca2+ 共聚焦成像的实验步骤

  1. 配制台氏液（130 mM NaCl、4 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES，用 KOH 调节 pH 至 7.2）。4 °C 保存，使用前恢复至室温。
  2. 配制洗涤液（100 mM 醋酸钾、15 mM KCl、5 mM KH2PO4、5 mM Mg-ATP、0.35 mM EGTA、0.12 mM CaCl2、0.75 mM MgCl2、10 mM 磷酸肌酸、10 mM HEPES，用 KOH 调节 pH 至 7.2）。4 °C 保存，使用前恢复至室温。
  3. 配制透化溶液，即在洗涤液中加入 0.005% 皂苷。每日新鲜配制。
  4. 配制无 Ca2+ 内液（100 mM 醋酸钾、15 mM KCl、0.35 mM EGTA、0.75 mM MgCl2、10 mM HEPES，用 KOH 调节 pH 至 7.2）。4 °C 保存，使用前恢复至室温。
  5. 配制含 Ca2+ 的内液。向上述内液中加入 CaCl2，使游离 Ca2+ 浓度达到所需水平。所需 CaCl2 的添加量可通过 MaxChelator 程序（maxchelator.stanford.edu）计算。
  6. 用 DMSO 配制 1 mM Rhod-2/AM 储存液，-20 °C 保存，直至使用。
  7. 用 DMSO 配制 1 mM MitoTracker Green 储存液，-20 °C 保存，直至使用。

5. 用于成像的细胞接种

  1. 洗涤 22 x 22 cm2 用100%乙醇清洗玻璃盖玻片，并让盖玻片自然晾干。
  2. 将玻璃盖玻片放入6孔组织培养板的各个孔中。
    注意：盖玻片可用层粘连蛋白、多聚-L-赖氨酸或类似的基质包被，以促进细胞贴附。
  3. 用胰蛋白酶消化细胞，并接种到盖玻片上，使成像当天细胞汇合度约为70%。

6. 使用 Rhod-2/AM 和 MitoTracker Green 负载细胞

  1. 配制 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 工作液。向 1 mL Tyrode 溶液中加入 20 μL 的 1 mM Rhod-2/AM 储存液、0.2 μL 的 1 mM MitoTracker Green 储存液以及 2.5 μL 的 20% Pluronic F-127。工作液中 Rhod-2 的终浓度为 20 µM，MitoTracker Green 的终浓度为 200 nM。
  2. 轻柔地从盖玻片上移除培养基。
    注意：在加入染料溶液前无需洗涤步骤。
  3. 以滴加方式将 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 溶液滴加至盖玻片上，直至刚好覆盖盖玻片（每张盖玻片约需 3–4 滴）。
  4. 在避光条件下于室温孵育 30 分钟，使细胞充分负载染料。
  5. 进行 Rhod-2/AM 的去酯化处理。轻柔地移除 Rhod-2/AM-MitoTracker Green 溶液，更换为新鲜的室温 Tyrode 溶液，并在避光条件下于室温继续孵育 30 分钟。

7. 线粒体Rhod-2/AM与MitoTracker Green荧光的共聚焦成像

  1. 将盖玻片转移至显微镜成像室，并向室内加入洗涤液。
  2. 在40倍相衬观察细胞的设置下，调节焦距直至细胞清晰可见并处于焦点。
  3. 对负载Rhod-2/AM和MitoTracker green的细胞进行质膜透化处理，以去除细胞质中定位的Rhod-2，同时保留线粒体中定位的染料。
    1. 从盖玻片上移除洗涤液。
    2. 加入透化溶液，处理约1分钟。
    3. 在整个透化过程中，目视监测质膜形态变化。透化后的细胞表面将变得粗糙。
    4. 当透化完成后，立即移除透化溶液，并替换为无Ca2+内液。
  4. 同时采集Rhod-2荧光（使用559 nm激光激发，收集575–675 nm波长范围的发射光）和MitoTracker green荧光（使用488 nm激光激发，收集505–525 nm波长范围的发射光）。聚焦于显示Rhod-2与MitoTracker green明显共定位的透化细胞。
  5. 降低显微镜激光强度和增益设置，使线粒体Rhod-2荧光信号微弱但可见。
  6. 选择合适的帧率和时间进程，以获取二维扫描图像，具体参数应根据实验需求确定。建议帧率至少为30帧/秒，以准确捕捉线粒体Ca2+变化的动力学过程。
  7. 在不扰动细胞或显微镜焦距的情况下，移除无Ca2+内液。
  8. 开始图像采集。
  9. 在10秒时间点，通过手动或灌流系统加入含Ca2+的内液。
  10. 在图像采集软件中选择感兴趣区域（ROIs），使其覆盖图像中线粒体Rhod-2与MitoTracker green信号共定位的区域。
    注：从记录的每个时间点获取各ROI的任意荧光强度（F）值。对这些值进行背景扣除后，归一化至初始荧光强度（加Ca2+前的荧光值，F0），并以F/F0随时间变化的形式绘图，用于数据展示及线粒体Ca2+变化幅度的定量分析。

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结果

图1 显示线粒体 Ca2+ 使用基于酶标仪平台和Ca的分离心脏线粒体摄取测量2+ 染料钙绿-5N。在对照条件下（图1A），将心脏线粒体悬浮于含钙绿素绿-5N的KCl缓冲液中，随后依次施加CaCl₂脉冲刺激2 (5 μL 0.6 mM CaCl2 溶液）分别在 30 s、150 s、300 s、480 s 和 690 s 时间点加入。CaCl₂ 添加的时间和次数2 用户可根据需要调整添加量，以确保线粒体完全摄取所添加的 Ca2+ 在后续添加之前。在此检测中，钙绿-5N 信号的增加反映了缓冲液中 Ca²⁺ 浓度的升高2+ 水平。由于线粒体可摄取 Ca2+，Ca2+ 从缓冲液中移除后，钙绿-5N荧光减弱。重要的是，在第三次添加Ca时2+，钙绿-...

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讨论

本文介绍了两种不同的方法来测量线粒体 Ca2+ 内流。基于酶标仪的钙绿素-5N 方法用于监测线粒体外 Ca2+ 水平，是一种适用于分离线粒体的 Ca2+ 摄取检测方法。尽管我们展示的是从小鼠心脏线粒体分离得到的代表性结果，但该方法也可轻松适用于从富含线粒体的组织（如肝脏、骨骼肌和脑组织）中分离的线粒体。此外，对于缺乏传统用于 Ca2+ 测量的专用设备（如荧光分光光度计）的实验室而言，酶标仪系统可能是一个理想选择。然而，与荧光分光光度计相比，酶标仪扫描时间窗口有限，且需要预先编程试剂添加步骤，这可能是该技术的不足之处；但考虑到荧光分光光度计的成本和可及性，这一劣势可能被抵消。通过调整试剂加样器中 Ca2+ 的浓度，可测定线粒体在触发线粒体通透性转换孔（MPTP）开放前所能螯合的 Ca2+ 量（即线粒体 Ca2+ 容量）。

我们所描述的用于线粒体Ca²⁺测定的Rhod-2/AM共聚焦成像方案2+ 适用于培养细胞，...

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披露

作者无披露信息需要报告。

致谢

本工作获得了美国心脏协会（J.Q.K.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
奥林巴斯 FV1000 激光扫描共聚焦显微镜OlympusFV1000
配备注射器的 Synergy Neo2 多功能微孔板读板仪Biotek
组织匀浆器Kimble886000-0022
22 × 22 mm 盖玻片Corning2850-22
96 孔板Corning3628
6 孔板Corning3506
Calcium Green-5NInvitrogenC3737
MitoTracker green FMInvitrogenM7514
Rhod-2, AMInvitrogenR1244
DMSOInvitrogenD12345
Pluronic F-127InvitrogenP3000MP
D-甘露醇SigmaM9546
蔗糖EMD Millipore8510
HEPESSigmaH3375
EGTASigmaE8145
氯化钾FisherBP366-500
磷酸二氢钾SigmaP0662
氯化镁SigmaM2670
丙酮酸钠SigmaP2256
L-苹果酸SigmaM1125
氯化钙SigmaC4901
乙酸钾FisherBP364-500
三磷酸腺苷镁盐（Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt）SigmaA9187
磷酸肌酸二钠盐SigmaP7936
皂苷SigmaS7900
Ru360Calbiochem557440

参考文献

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