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方法文章

舌部细胞外基质的制备及舌鳞状细胞癌的重建 体外

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DOI：

10.3791/57235

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2018年6月20日

 ,  , 
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

本文内容

摘要

本文展示了一种高效脱细胞化制备舌细胞外基质（TEM）的方法。该TEM可作为功能性支架，用于在静态或搅拌培养条件下构建舌鳞状细胞癌（TSCC）模型。

摘要

为了构建一种有效且逼真的舌鳞状细胞癌（TSCC）模型 体外，这些方法旨在制备脱细胞舌细胞外基质（TEM），以提供用于舌鳞状细胞癌（TSCC）构建的功能性支架。TEM 提供了一种 体外 细胞生长、分化和迁移的微环境。脱细胞基质中保留的天然细胞外基质（ECM）微结构和生化成分可为细胞锚定提供组织特异性的微环境。通过脱氧核糖核酸酶（DNase）消化结合一系列有机或无机预处理，可实现组织工程基质（TEM）的制备。该方案操作简便，脱细胞效率高。TEM在静态或搅拌培养条件下对TSCC细胞均表现出良好的细胞相容性，可用于构建TSCC模型。实验中还采用自制生物反应器实现持续搅拌条件下的细胞培养。利用TEM重建的TSCC组织表现出与临床TSCC组织病理学特征相似的特性，提示其在TSCC研究中具有应用潜力。

引言

舌头具有多种重要功能，例如吞咽、发音和味觉。因此，舌功能受损会显著影响患者的生活质量1。口腔中最常见的恶性肿瘤是舌鳞状细胞癌（TSCC），通常发生于饮酒或吸烟的人群中2。

近年来，在舌鳞状细胞癌的基础研究方面进展甚微。有效 体外 研究模型仍然是最大的问题之一。因此，细胞外基质（ECM）成为一种潜在的解决方案。由于ECM是由高度有序的基质成分组成的复杂网络结构，具有类似ECM结构和组成的支架材料将适用于癌症研究。去细胞化ECM能够完美地为同源细胞提供微环境 体外，这恰恰是细胞外基质（ECM）最显著的优势。

通过使用去污剂和酶进行脱细胞处理，可去除组织中的细胞成分而保留细胞外基质（ECM）。脱细胞基质中包含多种ECM成分，如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，可为培养的细胞提供类似天然组织的微环境，促进细胞的存活、增殖和分化3。此外，由于ECM中不含细胞成分，其用于移植时的免疫原性可降至最低水平。

迄今为止，脱细胞ECM的制备方法已在多种组织和器官中进行尝试，如心脏4,5,6,7、肝脏8,9,10,11、肺12,13,14,15,16,17和肾脏18,19,20。然而，据我们所知，目前尚未见有关舌组织类似研究的报道。

本研究通过一系列物理、化学和酶处理方法，高效且低成本地制备了脱细胞舌细胞外基质（TEM），并利用该TEM用于重建舌鳞状细胞癌模型 体外，展示了TSCC行为与发展的合适模拟。TEM具有良好的生物相容性，并能引导细胞归巢至组织特异性微环境，表明TEM在TSCC研究中具有重要潜力3该方案为研究舌鳞状细胞癌发病机制或临床治疗的科研人员提供了一种选择。

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方案

所有动物实验均依照动物福利法、机构指南进行，并经中山大学实验动物福利与使用委员会批准。

1. 透射电镜样品制备

  1. 通过颈椎脱位处死小鼠，并使用无菌手术剪和镊子取出舌头。
  2. 将舌头浸入75%乙醇中3分钟，然后将每条舌头放入含有1 mL 10 mM无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管（EP管）中。
    注意：后续所有步骤中PBS的浓度均与此步骤相同。
  3. 冻融法细胞裂解：将装有舌头的EP管在-80 °C冷冻1小时，然后在室温下解冻45分钟，重复3个循环。
  4. 使用手术针将每条舌头穿在一段外科缝线上，并用一小块无菌锡箔包裹缝线末端。在含有75%乙醇的3.5 cm或6 cm培养皿中无菌条件下进行操作。
    注意：每段外科缝线的适宜长度约为20 cm，每块锡箔的适宜尺寸约为0.3 cm2（1 cm × 0.3 cm）。舌头应靠近锡箔端穿入。
  5. 在3.5 cm或6 cm培养皿中用3 mL无菌PBS冲洗每条舌头30秒。该操作需在无菌条件下进行。
  6. 用超纯水洗涤 舌头：向一个盛有250 mL无菌超纯水的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头连同搅拌子一起放入瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
    注意：考虑到缝线可能缠绕，每瓶最多可放入5条舌头。缝线末端的锡箔用于防止舌头滑脱。通过调节瓶内缝线长度，使舌头距离瓶底约2 cm。此注意事项同样适用于步骤1.8、1.10、1.12和1.16。
  7. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
  8. 用NaCl洗涤 舌头：向一个盛有250 mL无菌1 M NaCl的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
  9. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
  10. 使用Triton X-100进行细胞裂解：向一个盛有250 mL无菌PBS中含2% Triton X-100的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
  11. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌48小时。
  12. 用CaCl2/MgCl2洗涤 舌头：向一个盛有250 mL无菌5 mM CaCl2/MgCl2的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
  13. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
  14. DNase消化：向每个EP管中加入1 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS），再分别向HBSS中加入DNase，使其终浓度为300 µM。将每条舌头转移至各自的EP管中，使部分缝线留在管外。该操作需在无菌条件下进行。
    注意：确保此前步骤中留在瓶内的缝线部分在此步骤中仍留在EP管内，此前留在瓶外的缝线部分也应继续留在管外。
  15. 将装有舌头的EP管在37 °C孵育24小时。
  16. 用PBS洗涤 舌头：向一个盛有250 mL无菌PBS的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
  17. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
  18. 将制备好的脱细胞舌基质（TEM）保存在无菌PBS中，4 °C储存备用。

2. 舌鳞状细胞癌的三维（3D）重建

  1. 静态TSCC模型构建
    1. 接种 1.0 × 106 将单个TSCC细胞（Cal27）接种至3.5 cm培养皿中，加入3 mL含10%胎牛血清（FBS）、90 µg/mL氨苄青霉素和90 µg/mL卡那霉素的DMEM/F12培养基。
    2. 在37 °C条件下培养Cal27细胞2至3天，确保细胞覆盖培养皿底部至少60%的面积。
    3. 将TEM加入培养皿中的Cal27单层细胞中。
    4. 将培养皿放入 CO₂ 培养箱中2 37 °C 培养箱中培养 28 天。
    5. 在细胞培养过程中，每天更换一次培养基。CO2 培养箱中的浓度为5%。
  2. 搅拌式TSCC模型构建
    1. 自制搅拌式微型生物反应器的制备
      1. 从10 mL注射器中取出活塞芯。
      2. 在杆的下端附近挖一个直径为1厘米的孔，并将搅拌子放入孔中。
      3. 在塑料广口瓶瓶盖中心挖一个直径为0.5 cm的孔，将活塞杆穿过瓶盖。
      4. 将50 mL离心管切去一半，并将其焊接在瓶盖外侧。
      5. 用绑好鱼钩的鱼线缠绕鱼竿，将鱼钩固定在鱼竿上。
        注意：每根鱼竿最多可安装4个鱼钩。
      6. 使用前将自制的复合物进行高压灭菌。
        注意：请勿对塑料广口瓶进行高压灭菌。细胞培养时应使用新的无菌塑料广口瓶。
  3. 动态细胞培养
    1. 接种 1.0 × 106 在自制的微型生物反应器中加入单个Cal27细胞。加入150 mL含有10%胎牛血清、90 µg/mL氨苄青霉素和90 µg/mL卡那霉素的DF12培养基。
    2. 使用连接在杆上的鱼钩将TEM装载到微型生物反应器上。
    3. 拧紧瓶盖，将迷你生物反应器置于磁力搅拌器上，在 CO₂ 氛围下以 200 rpm 转速启动迷你生物反应器。2 37 °C 培养箱中培养 7 至 14 天。
      注意：CO的浓度2 在 CO2 培养箱中的二氧化碳浓度为5%。

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结果

本实验方案在制备透射电镜（TEM）样品方面表现出高效性和适用性。与天然舌组织相比，TEM显示了完美的脱细胞效果。苏木精-伊红（HE）染色结果（图1A-B）证实了脱细胞的有效性。HE染色结果显示，TEM中细胞核染色完全消失（图1B）。此外，根据前期研究中的DNA含量定量分析表明，DNA几乎已从TEM中完全去除3。该方案在去除细胞成分的同时，对组织完整性造成的损伤极少（图1B）。

采用透射电镜（TEM）和自制微型生物反应器对舌鳞状细胞癌（TSCC）进行三维重建（图2

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讨论

一种成熟的脱细胞ECM制备方案应在几乎完全去除组织中细胞成分的同时，保留天然ECM的组成21。尽管目前报道的脱细胞方案多依赖通过血管灌注以对流方式清除细胞物质，但本研究采用了机械振荡法，这是一种传统上简单且成本较低的方法22,23,24,25,26。此外，由于舌组织富含舌肌而大口径血管较少，因此该方案相较于上述其他方法更适用于舌组织。

此外，该透射电镜样本制备方案采用适当强度的脱细胞处理，避免了高强度脱细胞方法（如十二烷基硫酸钠（SDS）处理）可能引起的基底膜破坏或溶解3。同时，该方案在大鼠和猪的舌组织中也有效（数据未显示），表明该方法可普遍适用于多种物种的舌组织<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（31371390）、国家高技术研究发展计划项目（2014AA020702）以及广东省科学技术计划项目（2016B030231001）提供的研究资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57-BL/6J 小鼠中山大学实验动物中心
乙醇广州化学试剂厂HB15-GR-2.5L
氯化钠生工生物A501218
氯化钾生工生物A100395
磷酸氢二钠广州化学试剂厂BE14-GR-500G
磷酸二氢钾 生工生物A501211
1.5 mL EP 管AxygenMCT-150-A
超低温冰箱 赛默飞世尔科技
3.5 cm 细胞培养皿赛默飞世尔科技153066
6 cm 细胞培养皿Greiner628160
曲拉通 X-100Sigma-AldrichV900502
氯化钙Sigma-Aldrich746495
氯化镁Sigma-Aldrich449164
脱氧核糖核酸酶（DNase）Sigma-AldrichD5025
硫酸镁生工生物A601988
葡萄糖Sigma-Aldrich158968
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9393
卡那霉素Sigma-AldrichPHR1487
外科缝合线上海金环
250 mL 广口瓶SHUNIU1407
磁力搅拌器AS ONE1-4602-32
CO2 培养箱SHEL LABSCO5A
10 mL 注射器湖南平安
50 mL 离心管Greiner227270
Cal27 细胞中国科学院上海细胞库舌鳞状细胞癌细胞系
U2OS 细胞中国科学院上海细胞库人骨肉瘤细胞系
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
丙酮酸钠Sigma-AldrichP5280
Hepes 游离酸BBIA600264
FBSHycloneSH30084.03
4 °C 冰箱海尔
纯水仪ELGA
血细胞计数板BLAU717805

参考文献

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