本文展示了一种高效脱细胞化制备舌细胞外基质（TEM）的方法。该TEM可作为功能性支架，用于在静态或搅拌培养条件下构建舌鳞状细胞癌（TSCC）模型。
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本文内容
摘要
摘要
为了构建一种有效且逼真的舌鳞状细胞癌（TSCC）模型 体外，这些方法旨在制备脱细胞舌细胞外基质（TEM），以提供用于舌鳞状细胞癌（TSCC）构建的功能性支架。TEM 提供了一种 体外 细胞生长、分化和迁移的微环境。脱细胞基质中保留的天然细胞外基质（ECM）微结构和生化成分可为细胞锚定提供组织特异性的微环境。通过脱氧核糖核酸酶（DNase）消化结合一系列有机或无机预处理，可实现组织工程基质（TEM）的制备。该方案操作简便，脱细胞效率高。TEM在静态或搅拌培养条件下对TSCC细胞均表现出良好的细胞相容性，可用于构建TSCC模型。实验中还采用自制生物反应器实现持续搅拌条件下的细胞培养。利用TEM重建的TSCC组织表现出与临床TSCC组织病理学特征相似的特性，提示其在TSCC研究中具有应用潜力。
引言
舌头具有多种重要功能，例如吞咽、发音和味觉。因此，舌功能受损会显著影响患者的生活质量1。口腔中最常见的恶性肿瘤是舌鳞状细胞癌（TSCC），通常发生于饮酒或吸烟的人群中2。
近年来，在舌鳞状细胞癌的基础研究方面进展甚微。有效 体外 研究模型仍然是最大的问题之一。因此，细胞外基质（ECM）成为一种潜在的解决方案。由于ECM是由高度有序的基质成分组成的复杂网络结构，具有类似ECM结构和组成的支架材料将适用于癌症研究。去细胞化ECM能够完美地为同源细胞提供微环境 体外，这恰恰是细胞外基质（ECM）最显著的优势。
通过使用去污剂和酶进行脱细胞处理，可去除组织中的细胞成分而保留细胞外基质（ECM）。脱细胞基质中包含多种ECM成分，如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，可为培养的细胞提供类似天然组织的微环境，促进细胞的存活、增殖和分化3。此外，由于ECM中不含细胞成分，其用于移植时的免疫原性可降至最低水平。
迄今为止，脱细胞ECM的制备方法已在多种组织和器官中进行尝试，如心脏4,5....
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方案
所有动物实验均依照动物福利法、机构指南进行，并经中山大学实验动物福利与使用委员会批准。
1. 透射电镜样品制备
- 通过颈椎脱位处死小鼠，并使用无菌手术剪和镊子取出舌头。
- 将舌头浸入75%乙醇中3分钟，然后将每条舌头放入含有1 mL 10 mM无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管（EP管）中。
注意：后续所有步骤中PBS的浓度均与此步骤相同。 - 冻融法细胞裂解：将装有舌头的EP管在-80 °C冷冻1小时，然后在室温下解冻45分钟，重复3个循环。
- 使用手术针将每条舌头穿在一段外科缝线上，并用一小块无菌锡箔包裹缝线末端。在含有75%乙醇的3.5 cm或6 cm培养皿中无菌条件下进行操作。
注意：每段外科缝线的适宜长度约为20 cm，每块锡箔的适宜尺寸约为0.3 cm2（1 cm × 0.3 cm）。舌头应靠近锡箔端穿入。 - 在3.5 cm或6 cm培养皿中用3 mL无菌PBS冲洗每条舌头30秒。该操作需在无菌条件下进行。
- 用超纯水洗涤 舌头：向一个盛有250 mL无菌超纯水的广口瓶中加入氨苄青霉素，使其终浓度为90 µg/mL。将舌头连同搅拌子一起放入瓶中，拧紧瓶盖，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
注意：考虑到缝线可能缠绕，每瓶最多可放入5条舌头。缝线末端的锡箔用于防....
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结果
本实验方案在制备透射电镜（TEM）样品方面表现出高效性和适用性。与天然舌组织相比，TEM显示了完美的脱细胞效果。苏木精-伊红（HE）染色结果（图1A-B）证实了脱细胞的有效性。HE染色结果显示，TEM中细胞核染色完全消失（图1B）。此外，根据前期研究中的DNA含量定量分析表明，DNA几乎已从TEM中完全去除3。该方案在去除细胞成分的同时，对组织完整性造成的损伤极少（图1B）。
采用透射电镜（TEM）和自制微型生物反应器对舌鳞状细胞癌（TSCC）进行三维重建（图2
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讨论
一种成熟的脱细胞ECM制备方案应在几乎完全去除组织中细胞成分的同时，保留天然ECM的组成21。尽管目前报道的脱细胞方案多依赖通过血管灌注以对流方式清除细胞物质，但本研究采用了机械振荡法，这是一种传统上简单且成本较低的方法22,23,24,25,26。此外，由于舌组织富含舌肌而大口径血管较少，因此该方案相较于上述其他方法更适用于舌组织。
此外，该透射电镜样本制备方案采用适当强度的脱细胞处理，避免了高强度脱细胞方法（如十二烷基硫酸钠（SDS）处理）可能引起的基底膜破坏或溶解3。同时，该方案在大鼠和猪的舌组织中也有效（数据未显示），表明该方法可普遍适用于多种物种的舌组织<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（31371390）、国家高技术研究发展计划项目（2014AA020702）以及广东省科学技术计划项目（2016B030231001）提供的研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57-BL/6J 小鼠 | 中山大学实验动物中心 | ||
| 乙醇 | 广州化学试剂厂 | HB15-GR-2.5L | |
| 氯化钠 | 生工生物 | A501218 | |
| 氯化钾 | 生工生物 | A100395 | |
| 磷酸氢二钠 | 广州化学试剂厂 | BE14-GR-500G | |
| 磷酸二氢钾 | 生工生物 | A501211 | |
| 1.5 mL EP 管 | Axygen | MCT-150-A | |
| 超低温冰箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 3.5 cm 细胞培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 153066 | |
| 6 cm 细胞培养皿 | Greiner | 628160 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| 硫酸镁 | 生工生物 | A601988 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| 外科缝合线 | 上海金环 | ||
| 250 mL 广口瓶 | SHUNIU | 1407 | |
| 磁力搅拌器 | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 培养箱 | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL 注射器 | 湖南平安 | ||
| 50 mL 离心管 | Greiner | 227270 | |
| Cal27 细胞 | 中国科学院上海细胞库 | 舌鳞状细胞癌细胞系 | |
| U2OS 细胞 | 中国科学院上海细胞库 | 人骨肉瘤细胞系 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes 游离酸 | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C 冰箱 | 海尔 | ||
| 纯水仪 | ELGA | ||
| 血细胞计数板 | BLAU | 717805 |
参考文献
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al.
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重印与许可
