柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌 Candidatus liberibacter spp. 的常规 PCR 特异性与准确性检测

摘要

柑橘黄龙病是一种对全球柑橘作物具有严重破坏性的病害。本文介绍一种简单的方法，通过提取柑橘叶片组织的基因组DNA并进行PCR检测，准确且精确地鉴定引起柑橘黄龙病的病原体Candidatus liberibacter spp.

摘要

柑橘黄龙病，又称柑橘黄化病，是一种在全球范围内严重危害柑橘种植园的毁灭性病害。该病可导致叶片出现不对称的黄斑、叶脉黄化、落叶、根系腐烂，最终致使柑橘植株死亡。感病植株生长受阻，并在非正常花期开花。这些花朵极少结果，即使结果，所产果实也通常个头小、味道苦涩、形状不规则，商品价值低。该病害由亚洲柑橘木虱传播。 Diaphorina citri 并通过嫁接感染的柑橘组织进行传播。该病原体在柑橘植株体内的潜伏期较长且具有变异性，有时可达数年，之后症状才开始显现。尝试培养该病原体 体外 由于病原体在感染的柑橘组织中浓度较低且分布不均，或因为难以模拟适合该病原体生长的环境条件，此前的培养尝试均未成功。由于该病害潜伏期较长，且研究人员无法对病原体进行体外培养，因此在病害扩散之前极难被识别。结果往往是该病突然暴发，导致柑橘种植户整季收成被彻底摧毁。本文介绍了一种准确且特异性检测柑橘黄龙病病原体的方法， 候选属 使用基因组DNA提取试剂盒和PCR检测韧皮部杆菌属（liberibacter spp.）。该方法简便、高效、成本低，且适用于定量分析。该方法可应用于任何柑橘组织，但其效果可能受限于组织中病原体的含量。尽管如此，该方法能使柑橘种植户更早地识别受感染的柑橘植株，从而在这一破坏性病害进一步扩散之前有效遏制其传播。

引言

柑橘黄化病，又称黄龙病，已导致大量柑橘树死亡。一个典型的例子是美国佛罗里达州，据预测，该病将使佛罗里达州的橙子产量从1997—1998产季的2.44亿箱下降至2016—2017产季的7000万箱，降幅达70%¹。佛罗里达州超过90%的柑橘树已被感染²，据估计，佛罗里达州柑橘产业每年因柑橘病害造成的损失约为10亿美元，其中柑橘黄化病起着主要作用³。柑橘黄化病主要由入侵性害虫亚洲柑橘木虱 Diaphorina citri 传播，也可通过嫁接感染组织进行传播。 该病害会导致叶脉黄化、叶片出现不对称的黄斑、过早落叶、枝条枯死、根系腐烂，并最终导致植株死亡。尤为重要的是，该病害会使柑橘植株在非正常季节开花，而这些花极少能结果。受感染柑橘植株所结出的果实未成熟、呈绿色，且味道苦涩⁴。

本方法的目的是准确且精确地鉴定出生活在受感染柑橘树木韧皮部内的运动细菌Candidatus liberibacter spp.，该细菌是柑橘黄化病的致病因子⁵。从整片叶片组织中提取基因组DNA，其中含有活细菌。提取的基因组DNA用作常规PCR的模板，使用与该细菌16S rDNA序列互补的寡核苷酸来扩增该序列。同时使用与柑橘FBOX基因互补的寡核苷酸作为内部扩增对照。我们选择该方法是因为其在先前的研究中已被证明是成功的⁶。

该方法具有明显的优势，即操作简单、成本相对较低，且可在任何常规配置的生物化学实验室中进行。此外，由于该病原体难以培养⁷，且能够在无症状宿主内长期存活并繁殖⁸，PCR 仍是检测该病原体最准确、最精确的方法。已有多种不同的专业 PCR 检测方法成功用于该病原体的检测；然而，常规 PCR 仍是实现准确且特异性检测的最简单方法，尤其适用于无症状宿主的检测⁸。

方案

1. 使用基因组提取试剂盒从植物组织中分离基因组DNA

1. 使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一整片新鲜叶片，获取柑橘叶片组织，并将叶片放入干净的塑料密封袋中。
   注意：采集后应尽快将装有叶片组织的袋子置于4 °C冰箱中或放入装有冰块的保温容器中，以避免组织变质。
2. 向研钵和研杵中加入少量液氮进行预冷。在预冷过程中，用剪刀剪取一小片叶片组织，大小约为1平方英寸。将剪下的组织放入研钵中，使其迅速冻结。如有需要，可补充更多液氮。
   注意：操作液氮时应始终佩戴隔热手套。
3. 使用研钵快速将植物组织研磨成细粉。持续研磨直至液氮完全蒸发，留下细腻的绿色粉末。
4. 将金属刮勺在液氮中短暂冷却10 - 15秒，然后用刮勺将研磨好的组织从研钵中转移至1.5 mL微量离心管中。
5. 使用1000 µL移液器加入600 µL核裂解液（见材料表），涡旋混匀1 - 3秒，随后在65 °C水浴中孵育15分钟。
6. 使用10 µL移液器向裂解液中加入3 µL RNase溶液，轻轻颠倒离心管2 - 5次以混匀，然后在37 °C培养箱中孵育15分钟。
   注意：继续下一步操作前，需让混合物冷却至室温。
7. 加入200 µL蛋白质沉淀液，高速涡旋20秒，然后在13,000 x g条件下离心3分钟，形成坚实的沉淀。在样品离心的同时，向一个新的1.5 mL微量离心管中加入600 µL室温异丙醇。
8. 使用1000 µL移液器小心吸取离心后的上清液，将其转移至含有异丙醇的新1.5 mL微量离心管中。此时可弃去沉淀。
   注意：为避免蛋白质污染上清液，应在沉淀上方保留极微量的上清液。
9. 轻轻颠倒离心管，直至DNA以丝状团块形式可见，然后在室温下以13,000 x g离心1分钟。
10. 倒掉上清液，向沉淀中加入600 µL 70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次以洗涤DNA，然后在13,000 x g条件下离心1分钟。
11. 小心吸除乙醇，保留松散的DNA沉淀，然后打开离心管并倒置放置于吸水纸上。在室温下空气干燥15分钟。
12. 向干燥的DNA沉淀中加入100 µL DNA重悬液，然后将DNA样品置于65 °C水浴中孵育1小时，期间通过轻弹管壁定期混匀。
13. 取1 µL纯化水加入微量比色皿中，插入分光光度计作为空白对照。将1 µL样品加入微量比色皿并插入分光光度计，测定DNA浓度。DNA浓度（ng/µL）可按以下公式计算：(A₂₆₀ - A₃₂₀) × 稀释倍数 × 50 ng/µL。
    注意：此处可暂停实验流程。样品可在4 °C条件下保存。

2. 对基因组DNA样本进行PCR

1. 在50 µL PCR管中加入10 µL 2x PCR预混液（见材料表）、1 µL上游引物（10 pM/µL）、1 µL下游引物（10 pM/µL）（引物序列见表2）、100 ng从样品中提取的基因组DNA，以及纯水（加至终体积20 µL），轻轻弹击混匀，并短暂离心。
2. 将PCR管放入热循环仪中，按相应程序运行（见表1）。
   注意：此步骤可暂停。如需暂停，反应完成后可将样品在4 °C保存。

3. 在琼脂糖凝胶中电泳扩增的DNA

1. 称取 0.4 g 琼脂糖粉末，加入洁净的 200 mL 锥形瓶中，并加入 1x TAE 缓冲液至总体积达 50 mL。
2. 在微波炉中高火加热 1.5 分钟，每隔 30 秒摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。
   注意：操作液态琼脂糖时应佩戴隔热手套，以防烫伤。
3. 向液态琼脂糖中加入 2.5 µL 的 10 mg/mL 溴化乙锭溶液，轻轻振荡混匀，然后将液体琼脂糖倒入水平凝胶模具中。倾倒后立即插入标准的 12 齿凝胶梳。
4. 室温下静置冷却 20 分钟，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子，将凝胶放入盛有 1x TAE 缓冲液的水平电泳槽中。
5. 使用微量移液器将全部扩增后的 DNA 样品加入加样孔中。另选一个加样孔加入 5 µL DNA 分子量标记物（见材料表）。
6. 在恒定 90 V 条件下电泳 35 分钟，随后取出凝胶并置于紫外透射仪中。
7. 在 302 nm 紫外光照射下拍摄并分析凝胶条带模式。

结果

阳性结果应出现对应于 500 bp 的清晰条带，用于检测Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, 和/或出现对应于 700 bp 的清晰条带，用于检测位于 16S 核糖体 β 操纵子中的插入序列 Laa2/Laj5⁹。内部扩增对照条带必须在 400 bp 处出现，该条带对应于柑橘 FBOX 基因的扩增¹⁰，且必须可见，结果方可视为有效（图 1 和 图 2）。当 500 bp 和 700 bp 条带均未出现，而 400 bp 条带存在时，判定为阴性结果。对健康样本进行 PCR 扩增时，可能在 700 bp 和 400 bp 附近出现一些非特异...

讨论

必须严格遵循所有步骤，以获得最佳实验条件。本演示中使用了完整的叶片组织；然而，理论上该方案可经修改后适用于任何类型的植物组织。此前，研究人员曾从叶脉组织而非完整叶片组织中提取基因组DNA，并获得了类似的结果¹¹。如果柑橘FBOX基因对应的条带未能出现，则结果无效，操作过程中可能存在一种或多种技术性错误。常见错误包括：使用被污染或未正确灭菌的水、微量移液器吸头或微量离心管；在PCR反应体系或基因组DNA提取过程中遗漏一种或多种必要组分；未维持正确的PCR仪循环条件；使用过期的试剂或其他成分；未向琼脂糖凝胶中添加溴化乙锭或其他DNA染料；对扩增后的DNA进行电泳时电压过高或时间过长；以及使用陈旧或配制不当的TAE缓冲液，或直接用水代替TAE缓冲液填充电泳槽。

引物 LAA2_F 和 LAJ5_R 选自先前的研究，因其在鉴定Candidatus Liberibacter asiaticum 和 africanum 方面具有成功应用。这些引物可扩增核糖体亚基基因 rplA 和 rp...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒	Promega	A1120	细胞核裂解液、RNase、蛋白质沉淀液和 DNA 重悬液的来源
液氮	Air Products	N/A
配备控制面板的 Mastercycler pro	Eppendorf	6321000019
1250 W 微波炉	Panasonic	N/A
5424 台式离心机	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 数字水浴锅	Fisher scientific	15-462-15Q
金属刮勺	Sigma-Aldrich	Z283274
研钵和研杵	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE 涡旋混合器	Corning	6775
2-丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
无菌 10 μL 吸头	TipOne	1161-3730
无菌 200 μL 吸头	TipOne	1163-1730
无菌 1250 μL 吸头	TipOne	1161-1750
可调体积移液器套装	VWR	75788-460
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E1510
琼脂糖	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
乙酸	Fisher Chemical	A38-212
Tris 碱	Sigma-Aldrich	10708976001
μ比色皿	Eppendorf	6138000018
可堆叠制胶托盘和梳子	Carolina	213655
PowerPac Basic 电源供应器	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT 电泳系统	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic 分光光度计	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR 管	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR 预混液	Promega	M7122
正向引物	Thermo Fisher Scientific	N/A
反向引物	Thermo Fisher Scientific	N/A
PCR 级水	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+ 凝胶成像系统	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA 标准分子量标记	Thermo Fisher Scientific	10787018