该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。
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本文内容
摘要
摘要
类球体（多细胞聚集体）被认为是模拟人体活体组织的良好模型。尽管类球体培养技术已取得显著进展，但在长期培养过程中，维持和促进其功能（如蛋白质表达和形态发生）仍面临一个关键挑战，即在类球体中构建可灌注的血管网络。本方案介绍了一种在微流控装置中于类球体内整合可灌注血管网络的新方法。为在类球体中诱导可灌注血管网络，利用在类球体内共培养的人肺成纤维细胞所分泌的促血管生成因子，引导血管新生芽体与微通道连接，并延伸至类球体内部。这些新生的血管芽体与类球体中共培养的内皮细胞融合，形成连续的血管网络。该血管网络能够无渗漏地灌注类球体内部。所构建的血管网络可进一步作为营养物质输送和代谢废物清除的通路，模拟血液循环功能 关键词：类球体，血管生成，微流控，三维细胞培养，组织工程，内皮细胞，人肺成纤维细胞，血管网络，灌注 体内该方法为类球体培养提供了一个新平台，可更真实地模拟活体组织。
引言
从单层（二维）培养转向三维培养，是出于对能够模拟活体组织细胞功能的培养模型的需求1,2,3。细胞培养中常用的平面且坚硬的塑料基质并不类似于人体内大多数细胞外环境。事实上，许多研究表明，三维培养能够重现组织特异性的结构、力学和生化信号以及细胞间通讯，而这些特征在传统的二维培养中并未观察到4,5,6,7,8。
多细胞聚集体或球状体是实现这种三维培养最有前景的技术之一9,10细胞分泌细胞外基质（ECM），并在球体中与其他细胞相互作用。尽管其他一些生物工程方法11,12,13<....
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方案
1. 微流控装置模具的制备
- 使用市售软件（Clewin5 或 AutoCAD 2016）设计微流控装置的图案， 等等。有关 Clewin5 的功能，请参见用户手册（http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual）。
注意：设计文件可在 补充文件 1. - 将设计文件传输至微图形发生器，并将涂有正性光刻胶的铬掩模装入设备中。
- 使用微图形发生器在图形区域曝光正性光刻胶。
- 使用显影剂显影正性光刻胶（材料表）并用去离子水（DI 水）冲洗掩膜。
- 使用铬蚀刻剂（材料表），刻蚀掉正性光刻胶被去除后暴露出的铬层。用去离子水冲洗掩模。
- 使用丙酮去除掩模上残留的光刻胶。
注意：透明掩膜可作为铬掩膜的替代品。 - 准备一块洁净的硅片（4 英寸，P(100)），以 3,000 rpm 的转速旋涂六甲基二硅氮烷（HMDS）30 秒。
- 在120 °C下软烘HMDS 5分钟，然后在室温下冷却晶圆5分钟。
- 旋涂负性光刻胶（材料表500 转/分钟下振荡 10 秒，随后 1,200 转/分钟下振荡 30 秒。
注意：旋涂工艺条件应确保在光刻后晶....
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结果
图1展示了微流控装置的设计图与照片。该装置包含三个平行通道，其中通道2设有类球体培养腔。通道1和通道3用于HUVEC细胞培养，通道2用于放置类球体。各通道之间由梯形微柱分隔，这些微柱在PDMS材料中成型，通过表面张力阻止通道2中的水凝胶渗入通道1和通道3，同时允许类球体与微通道中的HUVEC之间进行物质交换28。
图7a 显示了细胞接种后微流控装置中心区域的情况。第0天拍摄的明场和荧光图像显示，纤维蛋白凝胶仅填充了通道2，未泄漏至通道1和通道3，且人脐静脉内皮细胞（HUVECs）已成功附着于纤维蛋白凝胶的侧壁。明场图像中类球体和微柱均处于清晰对焦状态，表明类球体已正确沉降至装置底部。血管生成芽在第1天开始出现，芽长度随时间逐渐增加（图7b
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讨论
既往研究表明，人肺成纤维细胞（hLFs）可分泌多种促血管生成因子的混合物，例如血管生成素-1、血管生成素、肝细胞生长因子、转化生长因子-α、肿瘤坏死因子以及某些细胞外基质蛋白29,30。该检测方法依赖于hLFs在共培养球体中的促血管生成因子分泌，这也是该技术的局限性所在。因此，为了实现稳定的血管形成，必须将共培养球体置于孔板底部，以缩短共培养球体与第1和第3通道中HUVECs之间的距离。成纤维细胞诱导的血管长度与内皮细胞和成纤维细胞之间的距离呈反比关系31，因此较短的距离更有利于稳定的血管形成。然而，为了在不损伤第1和第3通道的前提下打开一个直径为1 mm的球体孔，第2通道的最小宽度需为1.5 mm。
尽管类球体沉降在孔板底部，但血管根部偶尔会与微柱或微通道脱离（图5）。在这种情况下，任何试剂都无法通过微通道（通道1或通道3）进入血管腔。尽管我们无法完全解决此问题，但我们推测其原因是纤.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究工作得到了日本科学技术振兴机构（CREST JST）（项目编号 JPMJCR14W4）、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（项目编号 25600060、16K16386）、日本文部科学省（MEXT）与科学技术振兴机构（JST）联合资助的创新中心计划（COI Program）、日本医疗研究开发机构（AMED）“聚焦关键评价技术研发项目”以及水户基金会（Mizuho Foundation for the Promotion of Sciences）的支持。微细加工技术得到了京都大学纳米技术枢纽平台（Kyoto University Nano Technology Hub）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| 涂覆有 AZP 1350 的铬掩模 | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| 微图形发生器 | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 显影液 | Rohm and Haas 电子材料 | - | 方案 1.4 中的显影剂 |
| S-Clean | 佐佐木化学 | S-24 | 方案 1.5 中的铬蚀刻剂 |
| 丙酮 | 和光 | 012-00343 | |
| 硅晶圆 | Canosis | SiJ-4 | |
| 旋涂仪 | MIKASA | 1H-D7 | |
| 六甲基二硅氮烷（HMDS） | 东京应化工业 | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | - | 方案 1.9 中的负性光刻胶 |
| 紫外曝光 | 纳米计量技术公司 | LA310s | |
| SU-8 显影液 | MicroChem | Y020100 | 方案 1.13 中负性光刻胶的显影剂 |
| 2-丙醇 | 和光 | 163-04841 | |
| 表面轮廓仪 | Veeco | Veeco Dektak XT-S | |
| （三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷 | Sigma | 448931 | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | 道康宁东丽 | 184W/C | |
| 活检打孔器（1.0 mm） | Kai Industries | BP-10F | |
| 活检打孔器（2.0 mm） | Kai Industries | BP-20F | |
| 等离子体系统 | Femto Science | COVANCE | |
| 盖玻片 | 松浪玻璃 | C024241 | |
| 培养皿 | Iwaki | 1000-035 | |
| 表达 RFP 的人脐静脉内皮细胞 | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| 正常人肺成纤维细胞 | Lonza | CC-2512 | |
| 内皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3162 | |
| 成纤维细胞生长培养基试剂盒 | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | 赛默飞世尔科技 | 11965092 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 和光 | 168-23191 | |
| 含酚红的 0.05 w/v% 胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA•4Na 溶液 | 和光 | 204-16935 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | 宝生物 | T900 | |
| 96 孔板 | 住友电木 | 631-21031 | |
| 1000 µl 吸头 | 日本遗传 | FG-402 | |
| 200 µl 吸头 | 日本遗传 | FG-301 | |
| 10 µl 吸头 | 日本遗传 | 37650 | |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Model 370 | |
| 表达 GFP 的人脐静脉内皮细胞 | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| 来自牛血浆的纤维蛋白原 | Sigma | F8630 | |
| 来自牛肺的抑肽酶 | Sigma | A6279 | |
| 胶原蛋白 I | Corning | 354236 | |
| 来自牛血浆的凝血酶 | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | 方案 5.5 中用于细胞核染色的荧光染料 |
| 多聚甲醛溶液 | 和光 | 163-25983 | |
| 倒置荧光显微镜 | OLYMPUS | IX71 | |
| 数字 CCD 相机 | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| 共聚焦激光扫描生物显微镜 | OLYMPUS | FV1000 | |
| 倒置荧光显微镜 | OLYMPUS | IX-83 | |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma | FD70S |
参考文献
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10),....
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重印与许可
