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缺血性卒中小鼠模型中使用[11C]DPA-713进行神经炎症的PET成像

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DOI：

10.3791/57243

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2018年6月14日

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1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

本文内容

摘要

通过转位蛋白18 kDa（TSPO）的正电子发射断层扫描（PET）成像，可无创地观察神经炎症在脑部疾病发生与进展过程中的动态作用。本方案描述了在缺血性脑卒中动物模型小鼠中，利用TSPO-PET结合离体（ex vivo）放射自显影技术检测神经炎症的方法。

摘要

神经炎症是缺血性脑卒中后病理级联反应的核心环节。无创性分子影像技术有望深入揭示特定神经免疫相互作用在脑卒中过程中的时间动态及其作用。特别是针对18 kDa转位蛋白（TSPO）的正电子发射断层扫描（PET）成像，TSPO是活化的小胶质细胞及外周髓系细胞的标志物，可为检测和追踪神经炎症提供有效手段 体内. 此处，我们介绍一种利用[11C]N,N-二乙基-2-[2-(4-甲氧基苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]乙酰胺([11C]DPA-713）在远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）小鼠与假手术小鼠中作为有前景的第二代TSPO-PET放射性示踪剂的应用。在dMCAO术后第2天进行磁共振成像（MRI），以确认脑卒中发生并确定梗死部位及体积。在dMCAO术后第6天进行正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）成像，以捕捉脑卒中后TSPO水平升高的峰值时期。通过PET图像定量分析评估[C11通过检测dMCAO小鼠和假手术小鼠脑组织和脾脏中C]DPA-713的水平，评估中枢和外周炎症反应程度。 体内 [11C]DPA-713 脑摄取通过以下方法确认 离体 放射自显影

引言

中风是美国第五大死因，也是导致残疾的主要原因1缺血性卒中占这些病例的绝大多数（约87%），是由于脑部局部血流中断所引起例如， 由血凝块或脂肪沉积物引起。受影响区域的氧气和营养供应随之减少，并引发复杂的病理级联反应，导致脑卒中核心区域（梗死区）以及周围区域的神经元死亡。神经炎症是导致这种损伤过程中的关键环节，常驻脑内免疫细胞（小胶质细胞）和浸润的外周免疫细胞（中性粒细胞、T细胞、B细胞以及单核细胞/巨噬细胞）均被认为参与了这一破坏性级联反应。2,3活化的微胶质细胞和巨噬细胞是这一神经炎症反应的核心，已有研究报道其在缺血性脑卒中后既具有有害作用，也具有有益作用2因此，必须评估 体内 卒中后这些细胞的贡献。

PET 是一种强大的三维分子成像技术，可实现对生物过程的可视化观察 体内 通过使用带有正电子（β+）发射放射性核素标记的特定分子，例如 11C, 13N, 15O 和 18F. 这种非侵入性方法相较于 离体 方法（例如， 免疫组织化学）相比，它能够在活体完整受试者中实时获取分子信息，并支持纵向研究。对TSPO（活化小胶质细胞和外周髓系细胞的标志物）进行PET成像，可提供量化和追踪体内先天免疫细胞反应的方法，可用于评估卒中后的炎症反应以及对治疗干预的响应。TSPO曾被称为外周型苯二氮䓬受体，是一种18 kDa的蛋白质，被认为在胆固醇转运和神经甾体合成中发挥重要作用。4此外，有证据表明TSPO参与神经炎症和神经元存活过程5,6，有报道称，在多种涉及炎症的神经系统疾病（包括中风）中，其表达增加7，痴呆8，帕金森病9 多发性硬化症10TSPO 位于线粒体外膜，在外周组织中高表达，尤其在与类固醇相关的组织中例如， 腺体）以及心脏、肾脏和肺中观察到的中等水平10然而，在健康的大脑中，TSPO 水平较低，且主要局限于胶质细胞。6,11神经元损伤（如中风中所观察到的）发生后，中枢神经系统（CNS）中的TSPO水平会显著升高。这种TSPO的上调可用于成像神经炎症。 体内 表达水平可准确反映炎症的严重程度。因此，本方法的目的是准确量化体内 使用TSPO-PET研究缺血性脑卒中 小鼠模型中神经炎症的贡献

已开发出多种TSPO示踪剂用于神经炎症的PET成像。本文描述了使用[11C]DPA-71312进行TSPO-PET成像的方法，这是一种有前景的第二代TSPO示踪剂，与历史上更常用的[11C]PK1119513相比，其信噪比更高，非特异性结合更低。以dMCAO小鼠卒中模型为例进行该方法的阐述14。该模型涉及颞部开颅术和远端大脑中动脉的永久性结扎，导致体感皮层发生局灶性缺血。由于该模型具有高度可重复的缺血性损伤和较低的死亡率，在临床前卒中研究中具有优势。迄今为止，尚未见在dMCAO啮齿类动物模型中开展TSPO-PET成像研究的报道。然而，既往在小鼠和大鼠中使用大脑中动脉闭塞（MCAO）模型（一种更为严重且变异较大的卒中模型）进行的PET成像研究表明，TSPO表达自卒中后第3天开始升高，并在第7天左右达到峰值15,16,17,18。因此，我们在dMCAO术后第6天进行PET成像，以匹配TSPO表达升高的时间窗。评估了[11C]DPA-713在脑内同侧（梗死侧）和对侧半球的摄取情况。TSPO-PET与结构MRI联合使用，可精确定义梗死区及对侧感兴趣区域（ROI）。本文介绍了基于图谱和基于MRI的两种ROI分析方法，用于计算[11C]DPA-713的摄取。同时评估了脾脏中的放射性示踪剂摄取，以探究各组间外周炎症水平。该方法有望为卒中及其他神经系统疾病中特定神经免疫相互作用的空间-时间动态及其作用提供关键见解。

方案

所有动物实验均按照斯坦福大学实验室动物护理管理小组（APLAC）的规定进行，该小组已获得实验动物护理评估与认证协会的认证。在本实验前，三个月大的C57BL/6雌性小鼠在无菌条件下按照标准操作流程接受了dMCAO手术14。

1. 结构性磁共振成像（dMCAO 手术后第 2 天）

  1. 打开操作软件（参见 材料清单）并通过创建新检查来设置采集。在序列浏览器中选择定位序列和turborare T2序列，拖动至检查窗口中。
  2. 使用软胶带将呼吸和加热探头固定在小鼠固定床上，并在探头上方放置一条保护性吸水垫，以创建无菌环境。
  3. 将气暖加热器连接至动物床，并打开风扇，使暖风持续为小鼠保温。使用自动监测系统，确保在整个扫描过程中，小鼠的体温和呼吸频率维持在适当水平。
  4. 在诱导室中使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，随后维持于1-2%（2 L/min，100% O₂）2）。确保麻醉室下方的加热垫已开启，以在麻醉过程中保持小鼠体温。麻醉后，为小鼠涂抹眼用润滑剂，以防角膜干燥及角膜溃疡的形成。
    1. 打开连接至MRI扫描仪的麻醉系统（异氟烷1-2%，氧气流量2 L/min，浓度100%），并将动物转移至小鼠固定床。
    2. 将小鼠头部朝下置于咬合杆上，并固定耳杆，确保耳杆不超出床体直径范围。
    3. 将射频线圈滑过小鼠头部，并将线圈和床推入磁体孔内，准确定位于等中心位置。
    4. 获取定位像以在三个维度上观察小鼠位置，并利用该图像定义用于T2 turbo rare序列（TE：33 ms，TR：2,500 ms，平均次数：2，17层，分辨率：0.083 × 0.92 mm，总时间：2分40秒）扫描的成像范围。dMCAO手术可导致体感皮层发生梗死。14因此，需确保该区域在T2加权图像中被覆盖。
    5. 将小鼠从扫描仪中取出，并在加热舱内进行恢复。

2. PET/CT 校准与工作流程设置（dMCAO 手术后第 6 天）

  1. 在扫描仪操作软件中创建一个成像工作流程，包括CT衰减采集、60分钟C-11动态PET采集（350 - 650 keV能级判别，3.438 ns符合时间窗）、直方图（20帧：5帧×15秒，4帧×1分钟，11帧×5分钟；需进行死时间校正）以及3DOSEM-OP重建（2次迭代，18个子集），以生成尺寸为128 × 128 × 159、体素大小为0.776 × 0.776 × 0.96 mm的图像。
  2. 通过界面左上角的CT校准面板执行X射线源预热校准。该校准需每周进行一次，或在系统过去48小时内未使用时于扫描前执行。
  3. 执行暗/亮（D/L）和中心偏移（C/O）校准。
    1. 点击界面左上角的CT校准按钮（X）。
    2. 选择将要运行的CT文件的D/L和C/O校准选项，从机架中取出床板，运行D/L校准。
    3. 将校准工具床板插入扫描仪，并运行C/O校准，确保在界面上将选择从"70 mm palette"切换为"calibration tool"。
  4. 移除校准工具，并重新安装标准PET床板，同时确保将界面上的选择切换回"70 mm palette"。
  5. 使用胶带将一个可容纳4只小鼠的成像床固定在扫描仪平台上，并连接麻醉管路（图1A）。确保异氟烷正在管路中流动，且无任何弯折。
  6. 将床板向前推至视野（FOV）中心位置，关闭CT门，获取CT定位像，以确认床板处于正确位置。
  7. 使用实验室自制的含有已知剂量C-11溶液的模体作为辐射源，对PET/CT扫描仪执行"standard"校准。
    1. 准备一支20 mL注射器，其中装有相当于单只小鼠给药剂量的示踪剂（约250 - 350 µCi/9 - 13 MBq的C-11示踪剂，用生理盐水稀释）。
    2. 使用活度计测量标准源中的放射性活度，并记录测量时间。
    3. 使用与小鼠成像完全相同的参数（如上所述）对标准源进行PET/CT扫描。该步骤需每周执行一次，以生成用于校正PET扫描仪成像数据的校正因子。

3. PET/CT 成像的工作区设置

  1. 使用具有病毒灭活作用的消毒剂（参见材料表）并覆盖所有表面以保护性吸水垫，创建无菌环境。
  2. 确保异氟烷和氧气罐已充分充填。
  3. 准备尾静脉导管：用0.9%氯化钠溶液（无菌生理盐水）填充一支1 mL注射器（配备27.5 G针头），并通过一个27.5 G、24 cm的蝶形导管进行冲洗。在插管前剪除导管的翼片，以确保其不会遮挡尾静脉视野，并便于将小鼠移动至扫描仪时避免导管移位。
  4. 确保工作台上已备齐所有必要设备，包括备用"冲洗"注射器（已填充无菌生理盐水）、眼用润滑剂、乙醇棉片、加热灯、预充生理盐水的导管、手术胶带、组织粘合剂、0.5 mL剂量注射器、剪刀以及用于在成功插入尾静脉后封堵导管的打火机（图1B）。

4. 动物准备与插管

  1. 称重小鼠以确定每只小鼠允许注射的最大体积（即， 示踪剂及任何给予的生理盐水总体积不得超过体重的10%。
  2. 在诱导室中使用3%异氟烷麻醉小鼠，并以1-2%（2 L/min，100% O₂）维持麻醉2).
  3. 为每只小鼠涂抹眼用润滑剂，并通过足底反射（脚趾夹捏）确认麻醉效果。必要时调整麻醉深度。
  4. 将小鼠置于带有鼻罩的加热垫上，通过鼻罩以2 L/min的流速输送1-2%异氟烷（100% O₂）2).
  5. 在小鼠麻醉状态下，按照以下方案进行尾静脉插管：
    1. 将小鼠侧放以暴露一侧浅静脉，同时头部保持在鼻罩内。
    2. 使用加热灯加热尾部，注意避免过热或烫伤尾部，然后用酒精棉片擦拭，以扩张静脉并消毒注射部位。
    3. 针尖斜面朝上，与静脉呈锐角对齐。
    4. 轻轻施压以刺破皮肤，并调整针头至与静脉平行。
    5. 轻轻向前推进几毫米，越过针尖斜面，使针头进入静脉。
    6. 通过注入少量生理盐水（10–20 µL）确认导管位置。生理盐水应顺利从注射器排出，且静脉应变得清晰。若遇到任何阻力或回压，表明导管可能未进入静脉，建议重新尝试插管。若观察到凝血现象，应在插管建立及冲洗时使用肝素（每毫升生理盐水中含1,000单位肝素）。
      注意：我们已在目标小鼠品系中评估了使用与不使用肝素的插管效果，由于未观察到凝血现象，插管时仅使用生理盐水。
    7. 使用少量组织胶将导管固定于小鼠尾部，再用手术胶带加固，以确保在将小鼠转移至扫描仪时导管保持固定不动。
    8. 从导管末端取下冲洗注射器，并用打火机封住末端，确保操作者远离异氟烷和乙醇。
    9. 对另外3只小鼠重复上述操作，以便所有4只待扫描小鼠均完成插管并准备就绪。
  6. 打开麻醉气流（2.5% 异氟烷，2 L/分钟，100% 氧气）2将小鼠俯卧位固定于PET/CT扫描仪床面上，确保导管位置正确，每只小鼠头部在鼻罩内保持正直且稳固。使用柔软的外科胶带将每只小鼠的头部和身体固定于床面，注意胶带位置不得限制其呼吸。记录每只小鼠在扫描床中的具体位置，以便后续图像分析时准确定位和分组。
  7. 在整个操作过程中保持小鼠体温（例如， 使用加热灯或热空气泵系统，确保小鼠保持温暖但不过热。通过肉眼观察（若使用开放式支架）或使用呼吸垫的远程监测系统，监测所有小鼠的呼吸频率，并根据需要调整麻醉水平。

5. CT 图像采集

  1. 待动物固定于扫描床上且呼吸稳定后，打开激光十字定位线，移动扫描床，使十字线与四只小鼠的脑部对齐。将扫描床移至采集位置（位置3），尽可能使小鼠脑部靠近视野（FOV）中心。
  2. 获取小鼠的定位像以确认其位置（使用200 mm的视场），必要时通过在界面上拖动视场框来调整位置。点击 "启动工作流程" 在扫描仪软件中启动CT扫描，并确保选择 "显示交互式用户提示" 因此可在示踪剂注射前手动启动PET扫描。

6. [11C]DPA-713 剂量配制

  1. 按照先前所述方法合成[11C]DPA-71312，操作时须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套以及个人手指和身体剂量计，以防护放射性物质。应定期更换手套，防止放射性污染，并在可能的情况下尽量增加与放射源的距离。
  2. 使用镊子小心地将放射性示踪剂小瓶转移至铅屏蔽后方。
  3. 为每只小鼠准备0.5 mL剂量注射器，内含约250–350 µCi/9–13 MBq，体积为100–200 µL，以确保剂量足以支持60分钟的动态PET扫描（给药剂量应根据同位素的半衰期及实验设计的时间线确定，注射体积则需根据小鼠体重调整）。
  4. 使用设置为C-11的剂量校准仪（位于套管插入部位附近）测量放射性活度，并记录测量和注射时间，以便进行衰变校正。在CT扫描即将结束前配制并抽取注射剂量，以减少衰变，确保每只小鼠均能接受预期水平的放射性活度。
  5. 在测量活度及向每只小鼠注射前，须确认剂量注射器中无气泡。

7. PET 采集

  1. 一旦小鼠自动从 CT 转移至 PET，即设置扫描仪后部以进行[11C]DPA-713 注射（图1C将防护性吸水垫放置在 ledge 上，并确保剪刀和打火机已备好。
  2. 用剪刀剪开封闭的导管管路，检查导管内无气泡，通过注入10–20 µL生理盐水冲洗以确认套管仍位于静脉内。将步骤6.4中已量取好剂量的注射器分别注入4根导管中，注意记录每只小鼠所对应的剂量。
  3. 点击 "好的" 当PET扫描准备就绪时，同时启动一个10秒计时器。在扫描仪后方安排两名研究人员，手持剂量注射器，待计时器归零时同时为4只小鼠注射。每根导管用50–100 µL生理盐水冲洗（根据导管管路长度而定）—— 即， 死腔体积）以确保全部剂量进入尾静脉，并再次使用打火机重新封住管路。
  4. 使用剂量校准仪测量注射器中的残留放射性活度（注射器中残留的示踪剂），记录测量数值及测量时间。
  5. 扫描完成后，使用水平方向将PET床归位至初始位置 "首页" 运动控制面板上的按钮。将小鼠从扫描仪中取出，并小心移除导管。轻轻按压插管部位，以防止过度出血。
  6. 使用剂量校准仪按照之前所述方法测量导管中的残留活性。
  7. 若需使小鼠苏醒，务必在温暖的环境中进行（例如， 将小鼠置于底部带有加热垫或内含温水手套的盒子中，以促进其恢复。若计划实施安乐死，应将小鼠放入含有异氟烷的诱导室中，使其在经灌注安乐死前保持麻醉状态。
  8. 要重建数据，请打开后处理管理软件（参见 材料表），该程序将使用从 lst 文件生成的直方图数据自动重建每个扫描。

8. 脑放射自显影

  1. 实验前，将数字放射自显影胶片暴露于白光下10–15分钟以擦除，随后置于无放射性环境中待用。
  2. 为每只小鼠准备0.5 mL剂量的注射器，内含约1.0–1.5 mCi/37–56 MBq，以确保剂量足以用于放射自显影。
  3. 使用剂量校准仪在注射前测量剂量注射器中的放射性活度，以获得准确的活度读数。
  4. 按照先前所述进行插管，并立即在适合放射性物质注射的部位对小鼠进行注射。
  5. 注射后移除导管并测量残留放射性。
  6. 将小鼠置于加热的麻醉诱导舱内，以确保其在灌注和安乐死前持续保持麻醉状态。
  7. 在小鼠深度麻醉状态下实施安乐死（持续吸入 4% 异氟烷，100% 氧气流速 2 L/min）2) 通过 PBS 灌注和双侧开胸术，在[给药/刺激]后 30 分钟11C]DPA-713 注射
    1. 打开腹腔，切开膈肌以暴露心脏。
    2. 将蝶形导管输液针插入心脏的左心室，并剪开右心房和下腔静脉。
    3. 使用20 mL注射器缓慢灌注PBS（约20–30 mL）。
  8. 使用镊子和剪刀小心地将脑组织从颅骨中取出。
  9. 将脑组织置于装有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中，确保脑组织在模具内水平且居中放置，嗅球朝向模具上的凹槽位置（以便在脑组织从模具取出后提供解剖标志和方向参考）。
  10. 将模具置于干冰上10–15分钟，或直至OCT变得不透明。
  11. 立即将每个模具放入设定为 -18 °C 的冷冻切片机中，固定前平衡 10 分钟。
  12. 剥离冷冻模具，使用少量新鲜OCT将脑组织固定在切片机平台上 "胶水".
  13. 将已固定的脑组织留在切片机中冷冻2分钟。
  14. 切开脑组织，直至暴露卒中部位（即， ROI）。使用MR图像定位每只动物脑内的梗死区域。对于dMCAO模型，梗死区域应始终位于体感皮层；然而，梗死范围的长度可能略有差异。
  15. 将涵盖梗死区域的脑组织进行切片，取20 µm厚的切片置于已标记相应小鼠编号的载玻片上。
  16. 打开自显影胶片盒，在胶片盒底部铺上一张保鲜膜。将载玻片组织面向上放置于胶片盒内的保鲜膜上，并记录每张载玻片的位置。可选步骤：拍摄载玻片排列位置的照片，以辅助后续分析。
  17. 在收集最后一片脑切片后等待约 2 分钟，使其干燥并黏附于载玻片上，然后轻轻在上方覆盖一层保鲜膜，并小心地将数字放射自显影胶片（白色面向下）放置于载玻片上方。
  18. 紧密关闭暗盒，置于 -20 °C 冰箱中，使切片在胶片上充分曝光（约 5–10 个半衰期）。
  19. 使用磷屏成像仪扫描胶片，曝光后生成数字图像以供后续分析。

9. 动态 PET 图像分析

  1. 开源图像分析软件（参见 材料表）并点击 "开放数据" 图标以加载CT图像（作为源图像）和 "附加数据" 加载动态 PET 的图标（作为参考）。
  2. 通过下拉菜单中的时间序列操作符对数据进行可视化质量控制：选择参考"参考文献"）和 "全球" 并为颜色标尺设置合适的最小值和最大值。逐帧观察动态PET数据，验证放射性摄取情况，并检查扫描过程中是否存在任何运动干扰。
  3. 使用平均 PET 图像 "算术运算符".
    1. 选择 "平均值已选定"，取消选择 "参考文献"，并确保输入1（"Inp1"），输入2（"Inp2"）和输入星（"Inp*"- 包含扫描中的其余PET帧）被选中以生成所有PET帧的平均值。
    2. 前往 "数据管理员" 选项卡（DM），并将平均图像向上拖动至 "输入1" 用于可视化显示的位置。通过点击自动计算来重新分配颜色标尺 "最小-最大" 工具
  4. 使用平均 PET 文件对 CT 进行配准 "自动3D" 功能在 "重新定向/配准" 下拉菜单
    1. 选择 "参考文献" 和 "Inp1"，并选择 "刚性", "快速", "Inp1 至 Ref" 配准。在所有三个维度中目视检查配准效果，必要时进行手动调整。 "手动3D" 使用选项卡 "翻译" 和 "旋转" 功能。
    2. 当对配准结果满意时，选择 "Inp2" 和 "Inp*"，然后通过点击对勾将设置应用于所有PET帧。在DM中右键单击CT和PET文件，并另存为原始数据。
  5. 一次处理一只小鼠的脑组织，以CT为指导进行脑部分析：选择 "裁剪" 从下拉菜单中选择并拖动图像边界，裁剪小鼠脑干以下的头部。使用 "手动三维重定向" 功能如上所述，以确保颅骨在所有维度上均保持平直。
  6. 使用DICOM格式加载该小鼠的MR图像 "附加数据" 界面左上角的按钮。使用以下方法移动 MR "手动三维重定向" 并将其拟合到CT图像中的颅骨上（确保所有模态图像方向一致）。
  7. 在MR图像上使用工具绘制卒中感兴趣区域（ROI） "3D ROI 工具".
    1. 在可视化控制器选项卡（VC）中取消选中PET可视化，关闭其显示，仅使用MR和CT图像绘制感兴趣区域（ROI）。
    2. 点击 "添加 ROI" 单击按钮以创建新的感兴趣区域（ROI）并为其命名 "梗死". 选择 "样条工具"，左键单击绘制感兴趣区域（ROI）边界，右键单击闭合该区域。
    3. 对包含卒中区域的所有切片重复此操作，确保在感兴趣区域（ROI）中不包含任何颅骨部分，最佳做法是在颅骨边界与卒中ROI之间保留一个体素的间隙。
  8. 使用梗死体积生成对侧感兴趣区域。
    1. 创建一个新的感兴趣区域并为其标注 "对侧". 右键单击梗死 ROI 并选择 "输出". 拖动 ROI 至位置 2（"Inp1").
    2. 仅有 "Inp1" 选定后，使用左右翻转功能 "操作员" 功能在 "重定向/配准" 菜单。勾选 "感兴趣区域" 选择框，选择 "仅查看"，并手动将新的 ROI 移动到对侧相同区域。选择 "算术" 操作者并对新划定的ROI进行2倍的标量乘法，以实现对各ROI的独立定量分析。
    3. 返回 3D ROI 工具。前往 "专家与实验" 标签，然后单击 "导入 ROI" 按钮。在对话框中选择 Inp1，以将新体积加载为对侧 ROI。
  9. 右键单击平均 PET 图像，卸载该图像并重新开启 PET。使用以下方法生成定量摄取结果： "导出结果" 3D ROI 工具中的图标。
  10. 如有需要，可进行额外的裂脑分析（即， 使用Vivoquant软件的3D小鼠脑图谱插件模块实现左右脑半球区域的自动ROI生成。
    1. 重新加载已配准的PET/CT图像。
    2. 通过点击导入小鼠脑图谱 "高级模块" 菜单并选择3D脑图谱工具。选择 "所有区域 左/右" 在 "高级设置" 并单击 "运行" 导入3D图谱。
    3. 以颅骨为边界，手动将图谱与大脑对齐。
    4. 重新运行图谱生成，确保 "导入3D ROI" 检查以生成所有14个左侧和右侧半球感兴趣区域（延髓、小脑、中脑、脑桥、皮层、海马、丘脑、下丘脑、纹状体、苍白球、嗅球、胼胝体和白质）的结果电子表格。
  11. 使用扫描仪操作软件（见材料表）量化脾脏中的示踪剂摄取量。
    1. 通过在数据库中选中 PET 和 CT 图像文件并点击加载 "常规分析".
    2. 点击注册标签，然后通过点击对 PET 和 CT 图像进行联合注册 "刚性配准" 图标。
    3. 点击 ROI 定量分析标签，然后点击 "创建感兴趣区域" 图标并将其命名为脾脏。
    4. 选择 "球体" 使用CT文件作为参考，绘制脾脏感兴趣区域（ROI），确保不与肾脏摄取区域重叠（利用PET图像和信号避免肾脏溢出效应）。
    5. 编辑 ROI 以保持动物间 ROI 体积的一致性。
  12. 计算用于摄取归一化的标准校正值。
    1. 从标准扫描中加载 PET/CT 数据，并使用圆柱形感兴趣区域（ROI）圈定 20 mL 注射器 "手动三维感兴趣区域" 工具
    2. 使用电子表格图标获取标准品中的放射性活度水平。
    3. 使用该 nCi/cc 结果以及标准品原始记录的放射性活度（即将剂量校准器测得的标准品放射性活度（单位：nCi/cc）与PET图像计算出的标准品放射性活度相除，以建立PET摄取值的校正因子。即，用剂量校准器记录的标准品放射性活度除以PET图像计算得到的放射性活度。
  13. 使用各小鼠的给药活度和测量时间，将数据衰变校正至PET扫描时的时间点即 计算PET扫描开始时的剂量活度。
  14. 对残余值重复上述操作，并从衰变校正后的剂量中减去，以计算每只动物实际接收到的放射性活度。
  15. 在应用此衰减校正后，还需应用标准校正，以确保数据处于正确的活性水平。确保这些校正应用于手动绘制的感兴趣区域（ROI）结果，以及与dMCAO定位相关的脑图谱ROI数据中的相关脑区即， 皮层、海马和纹状体
  16. 使用以下公式计算所有感兴趣区域（ROI）的 %ID/g：%ID/g =（ROI 放射性活度，单位 nCi/cc / 衰变校正后的给药剂量，单位 nCi/cc）× 100。利用绘图软件将 %ID/g 对时间作图，为每个 ROI 生成时间-放射性活度曲线。
  17. 使用扫描仪软件进行最终图像可视化和图例生成。根据每只小鼠在扫描时所接受的衰变校正剂量对图像进行归一化处理，确保所有图像均处于相同的 %ID/g 标度。
    注意：这是为了能够准确比较来自不同小鼠的图像和/或在不同日期进行的研究所获得的图像

10. 放射自显影图像分析

  1. 在 ImageJ 软件中打开数字图像（.gel 文件）。调整亮度和对比度以对图像进行视觉阈值设定，并应用适当的色彩查找表"lookup table"。
    注意：Royal 色彩最准确地模拟了 PET 中使用的颜色标尺。
  2. 使用 ROI 管理器手动绘制围绕梗死区域及相应对侧区域的感兴趣区域（ROI）。
  3. 使用测量功能量化每个 ROI 的平均像素强度，并导出结果。使用统计软件进行绘图。

结果

通过磁共振成像（MRI）确认小鼠脑卒中模型建立成功，并同时对4只小鼠进行[11C]DPA-713正电子发射断层扫描（PET）。在手动绘制脑部感兴趣区域（ROI）并进行半自动分割脑图谱分析之前，先将PET、CT和MR图像进行配准，以研究示踪剂在同侧和对侧脑区的摄取情况（图2）。

PET/CT 图像和时间-放射性曲线（TACs—放射性示踪剂活性随时间变化）显示，同侧半球与对侧半球相比，[11C]DPA-713 摄取增加（图 3A）。通过对 50–60 分钟时间段的动态 PET 脑图像进行定量分析，采用手动绘制感兴趣区（ROI）的方法发现，在 dMCAO 小鼠中，同侧（梗死）半球的示踪剂摄取（% ID/g）显著高于对侧半球，但在假手术小鼠中无此差异（图 3B）。在 dMCAO 小鼠与假手术小鼠之间，也观察到同侧半球摄取增加。使用图谱法时，同侧与对侧半球之间未观察到显著差异，这可能是由于图谱中的 ROI 范围大于梗死区域（通常局限于体感皮层），从而稀释了信号。然而，所有 ROI 均观察到 dMCAO 小鼠的整体摄取高于假手术小鼠，这与既往使用 MCAO 模型小鼠的研究结果一致，表明梗死区以外区域的 TSPO 表达增加19。无论是采用哪种方法，dMCAO 小鼠的同侧/对侧比值均高于假手术小鼠；但使用脑图谱法时，该差异仅在皮层中具有统计学意义，而 ROI 法因组内变异较大导致显著性降低。通过增加每组小鼠数量可能克服此问题。对脾脏中 [11C]DPA-713 摄取的定量分析显示，各组之间无显著差异（图 4）。

脑部dMCAO小鼠PET成像结果通过离体高分辨率数字放射自显影技术得到验证（图5）。在梗死组织中观察到[11C]DPA-713摄取增加，而周围健康脑组织中信号可忽略不计。对这些图像的定量分析显示，dMCAO小鼠患侧与对侧的摄取比值范围为1.4至2.09。

手术准备设置，包括注射器和手术工具，并配有成像设备。
图1： PET 扫描仪和工作区设置。 所有工作区域均覆盖保护性吸水垫，以创建无菌环境。(A) 校准完成后，将一个可同时成像4只小鼠的3D打印小鼠床固定在扫描仪中，并将4只小鼠的鼻罩连接至麻醉系统。(B) PET 成像所需设备需提前准备就绪，包括装有生理盐水的27.5 G 导管、眼用润滑剂、乙醇棉片、加热灯、手术胶带、组织粘合剂、0.5 mL 剂量注射器、剪刀和打火机。(C) 用于放射性示踪剂注射时，将装有生理盐水的冲洗注射器和剪刀置于扫描仪后方。请点击此处查看该图的放大版本。

共配准工作流程，PET/CT 到 MRI，示意图，脑图谱拟合，ROI 手动绘制。
图 2：同侧/对侧 ROI 及左右半球分割脑图谱 PET 图像分析流程。 使用图像分析软件，通过手动绘制感兴趣区域（ROI）以及半自动化的三维半脑分割图谱方法，测定同侧和对侧 ROI 中的示踪剂摄取。首先进行自动的三维 PET/CT 配准，随后在 CT 图像中定义的小鼠颅骨范围内，手动配准脑部 MRI。使用 3D ROI 工具，参照 MRI 上的梗死区域，手动绘制同侧（红色）和对侧（绿色）ROI。在半脑分割方法中，载入三维左右分割的小鼠脑图谱，并根据 CT 图像定义的颅骨范围进行拟合。用于定量分析的该三维小鼠脑图谱中的脑 ROI 包括：左侧皮层（深灰色）、左侧海马（矢车菊蓝）、左侧纹状体（深粉色）、右侧皮层（番茄红）、右侧海马（绿色）和右侧纹状体（青色）。各区域中 [11C]DPA-713 的摄取值以 nCi/cc 表示，并通过归一化至每只小鼠扫描时的衰变校正剂量，进一步转换为 %ID/g。 请点击此处查看该图的放大版本。

dMCAO与假手术组的PET/CT成像及图谱分析；包含ROI和脑图谱方法的结果。
图3：dMCAO与假手术小鼠中[11C]DPA-713脑摄取的代表性体内成像结果。(A) 动态PET/CT图像及时间-放射性曲线（TACs）显示，接受dMCAO手术的小鼠（n = 3）同侧皮层中[11C]DPA-713摄取增加，假手术组小鼠（n = 3）仅有轻微升高；dMCAO小鼠在梗死侧与对侧脑组织间的注射剂量百分比（%ID/g）差异显著更大。(B) PET定量分析（50–60 min总和）结果显示，采用ROI方法在同侧ROI区域，以及采用半脑分割脑图谱方法在皮层（Ctx）区域，放射性摄取均显著升高；而在海马（HC）或纹状体（Str）中未发现显著差异。两种分析方法均显示同侧与对侧比值升高，但仅在采用脑图谱方法分析皮层（Ctx）时具有统计学显著性。* (p <0.05)，*** (p <0.001) 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光成像 dMCAO 与假手术组；脾脏摄取水平以 %ID/g 条形图比较；科学分析。
图 4： dMCAO 小鼠与假手术小鼠中 [11C]DPA-713 脾脏摄取的代表性 体内 成像结果。(A) [11C]DPA-713 动态 PET/CT 图像显示 dMCAO（n = 3）和假手术组（n = 3）小鼠的脾脏感兴趣区域（ROIs）。(B) 定量结果显示，dMCAO 小鼠与假手术小鼠之间的脾脏摄取无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

核成像，放射性热图，示意图，高低活性区域，科学数据可视化。
图5：代表性放射自显影结果。 数字化放射自显影图像显示，同侧半脑的[11C]DPA-713摄取量较对侧半脑增加。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案介绍了一种利用[11C]DPA-713-PET。TSPO-PET 是目前研究最广泛的用于可视化和量化神经炎症的成像生物标志物 体内 迄今为止，TSPO 在脑内胶质细胞中的表达于炎症期间上调，从而允许对神经炎症进行无创检测与定量。此外，该技术具有高度可转化性，使其成为临床与临床前研究中的重要工具。本方案及代表性结果强调了使用 [11C]DPA-713 PET 用于检测和监测卒中及其他神经系统疾病中的神经炎症改变 体内.

本研究采用3月龄C57BL/6雌性小鼠进行远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）手术。选择该模型的原因在于其可产生高度可重复的、局限于体感皮层的梗死灶，相较于其他脑卒中模型（例如，大脑中动脉闭塞（MCAO）线栓法），该模型能建立变异性较低的永久性局灶性缺血模型14。脑卒中模型的正电子发射断层扫描（PET）成像具有优势，即可通过同一只动物对侧半球内的感兴趣区域（ROI）作为脑内自身参考区域。由于手术本身可能引发一定程度的炎症反应，因此在实验设计中必须纳入接受假手术的小鼠作为对照，假手术组仅进行开颅和脑膜操作而不闭塞动脉。仅开颅操作即可导致下方神经组织受损，并可能引入病原体，从而引发与脑卒中无关的免疫反应20。因此，假手术后出现一定程度的炎症反应是预期之内的，应与dMCAO组平行评估，以排除信号仅源于手术本身的可能性。为避免在dMCAO队列分析中混入非脑卒中引起的手术相关炎症，必须进行MR成像以确认脑卒中手术成功并形成梗死灶。MRI还可提供结构参考框架，这对于准确勾画梗死区及对侧半球的感兴趣区域（ROI）至关重要。此外，精确的图像处理，包括图像配准和ROI定义，也是确保定量结果可靠所必需的。

在使用碳-11标记的放射性示踪剂进行PET和自显影研究时，必须牢记一些额外的限制条件。必须充分考虑碳-11的短半衰期（20.33分钟），其使用通常仅限于拥有现场回旋加速器的研究机构。应提前确定合适的放射性物质运输路线、给药剂量和数据采集时间点，并制定详细的实验流程计划，以确保团队能够快速高效地开展工作。本研究的设计和设置旨在同时对4只小鼠进行成像，以提高使用碳-11示踪剂时可获得的数据产出量。理想情况下，当碳-11示踪剂送达成像设施时，所有小鼠应已完成插管并正在进行CT扫描，以确保在注射前放射性示踪剂的衰减最小化。该逐步操作方案最好由至少3名研究人员组成的团队来执行，以便快速完成插管、剂量测量、示踪剂注射、PET扫描以及在显著放射性衰变发生前完成脑组织切片。同时启动4只小鼠的PET扫描和注射操作需要两人协作完成。在注射前立即开始PET数据采集的原因是为了准确且完整地捕捉示踪剂在血液及感兴趣区域中的药代动力学和药效动力学分布过程。许多步骤可能需要经过严格培训和反复练习，以确保实验顺利进行。特别是本方案依赖于对C57BL/6小鼠成功实施尾静脉插管，由于其尾部毛发颜色较深，操作本身可能存在困难；若在脑卒中发生后进行成像，或对同一批小鼠在多个时间点进行成像，则难度可能进一步增加。

PET成像的另一个注意事项是需仔细记录放射性示踪剂的剂量以及残留活性的测量值，包括测量的确切时间。这对于在扫描时对注射剂量进行准确的衰变校正至关重要，并用于获得示踪剂摄取量的精确测量结果即， % ID/g) 计算每个 ROI 的数值。为确保图像分析的准确性，必须知晓每只小鼠在扫描时所含放射性物质的精确活度。因此，建议将扫描仪计算机与活度计的时钟同步，以避免使用半衰期较短的同位素（如 C-11）时产生误差。

准确的PET图像定量也可能受到扫描仪及其设置准确性的限制。因此，为了确保PET/CT图像的准确量化，对扫描仪的CT和PET两部分均进行质量控制检查至关重要。CT质量控制检查包括X射线源预热、暗场/亮场校准以及中心偏移校准。这些校准用于测量并校正系统噪声，必须在数据采集前按照扫描仪制造商的建议执行。PET扫描仪也应进行相应的校准。这通常涉及对一个"标准/PET模体"进行扫描，该模体内含有已知放射性活度浓度的物质。在制备标准品时，最好使用与研究中相同的放射性核素、与单只小鼠给药剂量相当的活度、体积接近小鼠体液量，并采用与动物成像相同的采集参数。本方案中使用一个装有用水稀释的放射性示踪剂的20 mL注射器作为标准品，随后的PET成像结果将用于根据校准探测器测得的实际剂量计算校正因子。该校正因子可应用于实验中获取的成像数据，以确保对PET图像中感兴趣区域的示踪剂摄取量进行准确量化。此方法不仅考虑了放射性核素的正电子射程，还计入了扫描当天存在的任何背景放射性活度。由于活度计是生成该校正因子的关键组成部分，因此必须按照制造商的指导定期对其进行校准。

当进行 离体 放射自显影中，注射后选择安乐死的最佳时间点至关重要，以确保目标区域具有较高的信噪比。注射后30分钟被选为[11C]DPA-713 自动放射显影，基于动态 PET 成像期间获取的数据即， 的 体内 以动态TACs为指导，同时考虑到C-11的半衰期较短，以及脑组织取出后切片和曝光所需的时间。鉴于此，[11C]DPA-713 自放射显影必须在另一组小鼠上进行，以便注射更高剂量的[11C]DPA-713 剂量及麻醉状态下灌注和处死的时间点为30分钟。进行小规模 体内 在开展研究前对3-4只小鼠进行PET初步研究 离体 放射自显影将有助于确定放射自显影的最佳时间点。另一个需要考虑的因素是 离体 自显影技术中，一个需要考虑的问题是：在注射后是否让小鼠苏醒，还是持续保持其麻醉状态直至安乐死。保持小鼠处于麻醉状态可模拟扫描时的条件，确保放射性示踪剂的分布或排泄动力学不受苏醒过程的影响。此外，这种方法避免了小鼠苏醒后再进行麻醉所造成的额外应激。最后，一个有益的补充是 离体 该方案是通过免疫组织化学染色（在放射性衰变后）评估用于自显影的脑切片中的局部损伤，以获得梗死部位和体积的高分辨率图像。

由于使用碳-11标记示踪剂存在局限性，本方案可轻松修改为适用于氟-18（半衰期109.77分钟）标记的TSPO示踪剂，后者可能更适用于无现场回旋加速器的实验场所。此外，本方案描述了四只小鼠同步成像的设置。尽管在使用碳-11示踪剂时，这种高通量方法最为理想，但本方案也可根据使用单只小鼠成像床的实验需求进行调整。对本方案所述技术进行周密规划和持续培训，将有助于利用[11C]DPA-713，可广泛应用于探究神经炎症在其他啮齿类动物神经系统疾病模型中的发病机制及进展作用。此外，该技术还可用于评估 体内 对靶向小胶质细胞/巨噬细胞的免疫调节治疗的反应

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Buckwalter实验室（特别是Todd Peterson博士）提供了小鼠模型并实施了dMCAO和假手术。此外，作者感谢Invicro公司的Thomas Liguori在VivoQuant图像分析软件方面提供的技术协助，感谢斯坦福大学SCi3小动物成像中心的Tim Doyle博士、Laura Pisani博士和Frezghi Habte博士在本成像方案开发过程中提供的建议与帮助，以及感谢放射化学设施（特别是Jun Park博士）在[11C]DPA-713合成过程中给予的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
西门子 Inveon PET/CT 扫描仪西门子版本 4.2
MRI 扫描仪瓦里安7 特斯拉
ParaVision 软件布鲁克版本 6.0.1MRI 操作软件
VivoQuant 软件InVicro版本 2.5图像分析软件
Inveon 研究工作区软件西门子版本 4.2扫描仪操作软件。包含 microQView 后处理管理软件
剂量校准仪CapintechCRC-15 PET
Typhoon 磷屏成像仪 9410GE 医疗8149-30-9410
蝶形导管SAI Infusion TechnologiesBFL-2427.5 G 针头
1 mL 注射器BD
胰岛素注射器BD3294610.5 mL 带针胰岛素注射器
20 mL 注射器 VWRBD302831BD 带刻度滑动接头注射器
组织胶Santa Cruz Animal Healthsc-3619313 mL
加热灯Fluker270025.5" 带夹具和开关的爬行动物加热灯
0.9% 无菌生理盐水辉瑞00409-4888-10注射用 0.9% 氯化钠，10 mL
眼润滑剂Watson RugbyPV926977人工泪液润滑眼膏，1/8 盎司
Chux 吸水垫赛默飞世尔科技1420662一次性吸水垫
虹膜剪世界精密仪器公司503708-1211.5 cm，直型，12 件装
手术胶带3M Durapore1538-01/2" × 10 码卷，丝质，低致敏性
小鼠 PET 床自制4 只小鼠 PET 床
打火机BicUDP2WMDC
异氟烷Henry ScheinNDC 11695-6776-2Isothesia，吸入性麻醉剂，250 mL
氧气PraxairUN1072压缩气体
自显影暗盒Cole-ParmerEW-21700-34铝制，8" × 10"
自显影胶片GE 生命科学28-9564-78存储磷屏 BAS-IP SR 2025 E 超高分辨率，20 × 25 cm，仅屏幕
切片机刀片赛默飞世尔科技30-508-35MB35 Premier 一次性刀片，34° 切割角
切片机MicromHM 550
显微镜载玻片费舍尔科技12-550-15Superfrost™ Plus 显微镜载玻片
OCT 包埋液VWR25608-930用于 -10°C (14°F) 及以下温度冷冻切片的水溶性甘醇和树脂配方
冷冻模具Poly sciences18646A-1一次性石蜡模具
保鲜膜Saran25700001300
消毒剂Virkon S

参考文献

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TSPO PET
缺血性卒中小鼠模型中使用[11C]DPA-713进行神经炎症的PET成像
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