一种用于研究不可逆电穿孔效应的同源性胰腺癌小鼠模型

摘要

不可逆电穿孔（IRE）是一种用于治疗局部晚期胰腺癌的非热消融技术。由于该技术相对较新，IRE 对肿瘤生长的影响尚不明确。我们建立了一种同源小鼠模型，可用于研究 IRE 对胰腺癌的影响。

摘要

胰腺癌（PC）是一种每年在美国导致约4万名患者死亡的疾病，已成功逃避多种治疗手段，包括前景广阔的免疫治疗策略。不可逆电穿孔（IRE）是一种非热消融技术，可诱导肿瘤细胞死亡，同时不破坏邻近的胶原结构，因此可在紧邻血管的肿瘤中实施该手术。与热消融技术不同，IRE会引起渐进性的凋亡性细胞死亡以及即刻消融导致的坏死，目前已被用于部分局部进展期胰腺癌患者的临床治疗。像IRE这样非靶向性的消融手术，可在肿瘤微环境中引发多种反应。已有少数研究探讨了IRE对其他类型肿瘤生长的影响，但尚无研究聚焦于胰腺癌。我们建立了一种胰腺癌同源小鼠模型，可在高度可控的条件下对皮下（SQ）和原位移植肿瘤成功实施IRE治疗，便于术后开展多种纵向研究。该动物模型为研究IRE的作用机制以及提高IRE临床疗效的策略提供了可靠的实验体系。

引言

胰腺导管腺癌（PC）预计将在2020年左右成为美国癌症死亡的第二大原因¹。绝大多数被诊断为PC的患者最终将死于远处转移性疾病²。PC的微环境以免疫抑制和化疗耐药著称。其促纤维增生性间质中效应性（抗肿瘤）T细胞稀少，而免疫抑制性白细胞显著增多，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）³。这些特征凸显了开发多模式策略以对抗微环境这些效应的必要性。

不可逆电穿孔（IRE）已发展成为一种非热消融肿瘤的方法。与热消融技术不同，IRE不会引起快速的凝固性坏死，而是导致细胞逐渐发生凋亡性死亡⁴。对于胰腺肿瘤而言，IRE的一个重要优势在于其不受“热沉效应”的影响，因此可在紧邻血管的区域实施⁵。该技术已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的510(k)批准⁶，目前正用于经筛选的局部晚期或临界可切除胰腺癌患者的临床治疗。在目前已发表的最大规模胰腺癌IRE治疗病例系列研究中⁷，接受IRE治疗患者的中位生存期约为仅接受现代化疗而未行手术切除患者的两倍^8,

方案

根据本方案进行的所有动物实验必须获得相应的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。此处描述的所有操作程序均已获得加州大学圣地亚哥分校IACUC的批准。

1. 获取受体动物

注意：KPC-Luc 4580 细胞系源自一只 LSL-Kras^G12D/+; LSL-Trp53^R172H/+; PDX1^Cre/+; LSL-ROSA26 ^Luc/+ 小鼠（KPC）体内发生的肿瘤，该小鼠是在 C57BL/6 背景上构建的胰腺癌（PC）基因工程模型。该细胞系的优势在于可组成型表达荧光素酶，从而实现对原位模型中肿瘤的监测。然而，只要与其他细胞系与受体小鼠的遗传背景相容，也可使用其他细胞系。

1. 预先确定实验分组及每组动物数量。
2. 根据研究假设和所用细胞系，选择动物的年龄（推荐使用6至10周龄小鼠）和性别。

2. 培养细胞

1. 使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）：营养混合物F12（50:50）培养基（完全生长培养基）培养KPC-Luc 4580细胞。
2. 若为冻存细胞，应在肿瘤植入前4天进行解冻。
3. 在无菌条件下，将细胞置于37 ....

结果

我们按照上述步骤操作，在5至6周龄的野生型C57BL/6小鼠皮下接种1×10⁶个细胞与50% BMM混合物，成功构建SQ肿瘤模型。当肿瘤直径达到5至6 mm时，处死其中部分小鼠，取出肿瘤组织，并将其原位移植至受体C57BL/6小鼠体内。如图1所示的时间线，于移植后第10天进行IRE处理。其余携带SQ肿瘤的小鼠也接受IRE处理。

在SQ肿瘤中，IRE的电压和脉冲持续时间分别保持恒定在1,500 V/cm和 100 µs，但脉冲数量不同。 图2 结果显示，少数小鼠的SQ肿瘤在接受150次IRE脉冲后完全消退，而75次脉冲的效果较差。总体而言，9只小鼠中有4只在接受150次IRE脉冲后出现肿瘤完全消退。IRE治疗后1周对肿瘤组织进行组织学分析，发现存在大范围的中央肿瘤坏死区域，而未治疗的对照组肿瘤中未见此类现.......

讨论

在本研究中，我们建立了一种可用于研究不可逆电穿孔（IRE）对肿瘤生长影响的免疫健全小鼠胰腺癌（PC）模型。目前，IRE仅被用作少数经过数月术前治疗后无远处疾病进展的局部晚期PC患者的非热消融技术。因此，其应用受到限制，因为大多数局部晚期PC患者会发展为远处转移性疾病²⁰。该模型将为采用多种扩展治疗参数及联合治疗方案评估IRE对PC作用的研究提供基础。

在实验方案中需要考虑的最重要因素是进行不可逆电穿孔（IRE）时肿瘤的大小。目前适用于小鼠模型的商用探针，其电极间距（5 - 10 mm）存在限制。因此，当肿瘤明显大于电极间距时，将导致消融不完全。对于皮下（SQ）肿瘤，建议使用双针阵列电极而非镊式电极，因为肿瘤周围皮肤会增加镊式电极中电流流动的阻力。虽然可通过在同一肿瘤内以不同深度和角度进行多次IRE操作来克服双针阵列电极的尺寸限制，但这种方法难以实现对肿瘤的均匀治疗。另一种方法是，对于较大的肿瘤（最大达10 mm），可在肿瘤下方的皮肤上做一个略长于肿瘤直径的切口，然后用镊子翻转覆盖的皮肤，将肿瘤经切口外置。随后可使用镊式电极对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 方波电穿孔仪	哈佛仪器公司	BTX # 45-0002 (58018-004)
2针阵列电极	哈佛仪器公司	45-0167
安全脚踏开关	哈佛仪器	45-0211
铂金镊子电极	哈佛仪器	45-0486
DMEM-F12 培养基	赛默飞世尔科技	11320-033
胎牛血清	赛默飞世尔科技	10437028
胰蛋白酶	赛默飞世尔科技	25200056
Matrigel	康宁	354230
异氟烷	Sigma-Aldrich, Inc.	792632
Lacrilube	Fisher Scientific	19090646
布托啡诺	Fisher Scientific	NC1292810
D-荧光素	Perkin Elmer	122799
IVIS  Spectrum 体内成像系统	Perkin Elmer	124262
小鼠品系 C57BL/6J	杰克逊实验室	000664/Black 6
细胞系（KPC-Luc 4580）	北卡罗来纳大学J.J. Yeh实验室
BD Precisionglide 注射器针头	Sigma-Aldrich公司	Z192406
酒精棉片（70%异丙醇）	BD	326895
数显卡尺	赛默飞世尔科技	14-648-17
一次性无菌手术刀	VWR	21909
棉签	VWR	89198
缝合针，45 厘米，6-0 规格	哈佛仪器公司	72-3308
缝合针，45 厘米，4-0 号	哈佛仪器公司	72-3314
聚维酮碘 10%	BD	29900-404
一次性暖贴	KENT SCIENTIFIC CORP.	TP-3E
小鼠毛发剪	KENT SCIENTIFIC CORP.	CL8787
手术铺巾	哈佛仪器	59-7421
磷酸盐缓冲液	赛默飞世尔科技	10010023