不可逆电穿孔（IRE）是一种用于治疗局部晚期胰腺癌的非热消融技术。由于该技术相对较新，IRE 对肿瘤生长的影响尚不明确。我们建立了一种同源小鼠模型，可用于研究 IRE 对胰腺癌的影响。
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摘要
摘要
胰腺癌（PC）是一种每年在美国导致约4万名患者死亡的疾病，已成功逃避多种治疗手段，包括前景广阔的免疫治疗策略。不可逆电穿孔（IRE）是一种非热消融技术，可诱导肿瘤细胞死亡，同时不破坏邻近的胶原结构，因此可在紧邻血管的肿瘤中实施该手术。与热消融技术不同，IRE会引起渐进性的凋亡性细胞死亡以及即刻消融导致的坏死，目前已被用于部分局部进展期胰腺癌患者的临床治疗。像IRE这样非靶向性的消融手术，可在肿瘤微环境中引发多种反应。已有少数研究探讨了IRE对其他类型肿瘤生长的影响，但尚无研究聚焦于胰腺癌。我们建立了一种胰腺癌同源小鼠模型，可在高度可控的条件下对皮下（SQ）和原位移植肿瘤成功实施IRE治疗，便于术后开展多种纵向研究。该动物模型为研究IRE的作用机制以及提高IRE临床疗效的策略提供了可靠的实验体系。
引言
胰腺导管腺癌（PC）预计将在2020年左右成为美国癌症死亡的第二大原因1。绝大多数被诊断为PC的患者最终将死于远处转移性疾病2。PC的微环境以免疫抑制和化疗耐药著称。其促纤维增生性间质中效应性（抗肿瘤）T细胞稀少，而免疫抑制性白细胞显著增多，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）3。这些特征凸显了开发多模式策略以对抗微环境这些效应的必要性。
不可逆电穿孔（IRE）已发展成为一种非热消融肿瘤的方法。与热消融技术不同，IRE不会引起快速的凝固性坏死，而是导致细胞逐渐发生凋亡性死亡4。对于胰腺肿瘤而言，IRE的一个重要优势在于其不受“热沉效应”的影响，因此可在紧邻血管的区域实施5。该技术已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的510(k)批准6，目前正用于经筛选的局部晚期或临界可切除胰腺癌患者的临床治疗。在目前已发表的最大规模胰腺癌IRE治疗病例系列研究中7，接受IRE治疗患者的中位生存期约为仅接受现代化疗而未行手术切除患者的两倍8,9。
多项研究表明，热消融可在其他肿瘤类型中诱导全身免疫反应（详见 Chu 等人et al.10 的综述）。在动物肿瘤模型中，射频消融（RFA）可导致 T 细胞浸润增加11,12，包括肝细胞癌患者体内活化的自然杀伤（NK）细胞增多13,14，以及肺癌患者中免疫抑制性调节性 T 细胞（Tregs）减少15。相比之下，针对不可逆电穿孔（IRE）所引发的免疫反应、微环境变化及损伤反应的研究则少得多16。已有研究显示，在免疫功能健全的小鼠模型中，IRE 可激发全身免疫反应，表现为两周前对原发肿瘤实施 IRE 后，继发性（对侧）肾细胞异体移植瘤的生长受到抑制或完全被阻止17。研究者还观察到，与免疫功能低下小鼠相比，免疫功能健全的小鼠实现肿瘤完全消退所需的电压更低。有假说认为，与热消融引起的凝固性坏死相比，IRE 可能更有利于抗原呈递，但这一假设尚未得到专门研究验证。
我们利用KPC-Luc 4580细胞系（由北卡罗来纳大学J.J. Yeh惠赠）建立了一种同源小鼠胰腺癌模型，该细胞系来源于一只雄性LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; PDX1Cre/+; LSL-ROSA26Luc/+小鼠体内自发形成的肿瘤，用于研究不可逆电穿孔（IRE）的局部和全身效应18,19。该表达荧光素酶的细胞系具有免疫原性，在免疫功能健全的C57BL/6小鼠中，无论是皮下（SQ）接种还是原位接种，均可稳定成瘤；当经脾脏注射时，可可靠地形成肝转移灶。我们采用可编程方波脉冲发生器，通过双针阵列探针（间距5 mm）或铂金镊形电极，分别对小鼠皮下或原位肿瘤施加电场强度为1,500 V/cm、脉宽为100 µs的电脉冲，以在小型动物中模拟IRE的作用效果。
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方案
根据本方案进行的所有动物实验必须获得相应的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。此处描述的所有操作程序均已获得加州大学圣地亚哥分校IACUC的批准。
1. 获取受体动物
注意：KPC-Luc 4580 细胞系源自一只 LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; PDX1Cre/+; LSL-ROSA26 Luc/+ 小鼠（KPC）体内发生的肿瘤，该小鼠是在 C57BL/6 背景上构建的胰腺癌（PC）基因工程模型。该细胞系的优势在于可组成型表达荧光素酶，从而实现对原位模型中肿瘤的监测。然而，只要与其他细胞系与受体小鼠的遗传背景相容，也可使用其他细胞系。
- 预先确定实验分组及每组动物数量。
- 根据研究假设和所用细胞系，选择动物的年龄（推荐使用6至10周龄小鼠）和性别。
2. 培养细胞
- 使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）：营养混合物F12（50:50）培养基（完全生长培养基）培养KPC-Luc 4580细胞。
- 若为冻存细胞，应在肿瘤植入前4天进行解冻。
- 在无菌条件下，将细胞置于37 °C、5% CO2和95%湿度的环境中培养。
- 在细胞汇合度达到>80%之前，使用0.25%胰蛋白酶在37 °C下消化5分钟，并加入两倍体积的完全生长培养基以中和胰蛋白酶。
注意：若使用汇合度为100%的细胞，或细胞传代次数超过12代，则其在小鼠体内成瘤效率较低。因此，建议在较早传代时、于最佳汇合度下将细胞冻存。 - 使用血细胞计数板对细胞进行计数，若细胞数量足够（每只小鼠0.5–1 × 106个细胞），则可进行肿瘤诱导；若数量不足，则继续传代扩增，直至获得足够数量的细胞。
3. 诱导SQ肿瘤
- 准备所需材料：P1000 和 P100 移液器及吸头、1 mL 注射器、25G 针头、基底膜基质（BMM）、DMEM 基础培养基、1.5 mL 离心管。所有材料在操作结束前均需保持无菌和低温（4 °C）。同时准备好毛发剪和酒精棉片以用于动物处理。
- 将细胞进行胰蛋白酶消化（按步骤 2.4 操作）并计数，然后用冷 DMEM 重悬至浓度为 2 - 4 × 107 个细胞/mL。
- 加入等体积的 100% BMM，使最终细胞悬液中 BMM 浓度为 50%。每只小鼠所需细胞悬液体积应为 50 µL。额外多准备 10%，以补偿注射器死体积及移液误差。
- 将细胞悬液分装至置于冰上的 1.5 mL 离心管中，每管 550 µL。
- 使用固定器或手动方式固定动物（6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠）。
注意：也可使用精密挥发器，以每分钟 2 L 的流速给予含 2.5% 异氟烷的氧气进行麻醉。 - 使用毛发剪剃除注射部位的毛发，注射部位优选腿部上方的侧腹部区域。用酒精棉片对注射部位擦拭两次以消毒。
- 用 1 mL 冷注射器吸取 250 µL 细胞悬液（最终浓度为 1 - 2 × 107 个细胞/mL），通过上下推动活塞排除任何气泡。将 25G 针头连接至注射器，并确保针头内部完全充满液体。
- 将针头以约 30° 角小心刺入侧腹部皮下，注意避免穿刺腹腔或肢体肌肉组织。
- 将针头放平至与身体平行，并抚平皮肤皱褶。缓慢注射 50 µL 细胞悬液。注射后保持针头在原位 10 秒，使 BMM 凝固，防止液体外漏。
- 保持针头平行，缓慢拔出，避免横向移动。用酒精棉片轻轻清洁注射部位，然后将小鼠放回饲养笼中。
注意：若小鼠在操作过程中接受了麻醉，需持续观察直至其恢复翻正反射。 - 使用游标卡尺定期监测肿瘤生长情况，直至肿瘤直径达到 5 mm。
4. 原位肿瘤的诱导
- 准备所需的材料。将手术器械如剪刀、手术刀、持针器、尖头和钝头镊子进行高压灭菌。备好无菌缝线（可吸收6-0和不可吸收4-0）、酒精棉片、毛发剪、脱毛膏、眼用润滑剂、棉纱布、10%聚维酮碘溶液、手术铺巾、加热垫、丁丙诺啡及麻醉剂。
- 使用缓慢充入CO₂的方法处死一只携带皮下KPC肿瘤的供体小鼠（ preferably 采用原位模型所需相同背景的小鼠）2 腔室。在原位移植前，于BSL-2生物安全柜中使用无菌镊子和显微剪刀，在无菌条件下小心切除SQ肿瘤。切除过程中注意避免穿刺腹腔，并立即用两次更换的无菌PBS清洗肿瘤。
- 使用无菌手术刀将切除的肿瘤切成约1 mm大小的组织块3 将组织块置于含有冷的无菌DMEM基础培养基的培养皿中，并在冰上保存直至移植。
- 术前30分钟，皮下注射0.05–1 mg/kg布托啡诺镇痛剂给受体小鼠。
- 使用精密挥发器将异氟烷（2 - 3%）与氧气（2 L/min）混合，对受体小鼠进行麻醉（或使用其他麻醉剂）。整个操作过程中，将小鼠置于37 °C加热垫上。在眼睛表面涂抹润滑剂，防止角膜干燥。通过观察是否缺乏惊跳反射初步判断麻醉深度，并通过轻捏脚趾无足底反射来确认达到外科手术麻醉平面。在整个手术过程中维持麻醉状态。
- 将小鼠仰卧放置，轻轻翻转至其右侧，使左侧腹部暴露。使用脱毛膏去除小鼠腹部毛发，并用纱布擦拭清洁，以确保切口后无游离毛发进入腹腔。用10%聚维碘酮溶液和酒精棉片交替擦拭左侧腹部3个循环，进行皮肤消毒，为手术做准备。
- 使用无菌手术刀，在肋骨下方、腹中线左侧1厘米处、脾脏稍偏内侧的位置，于皮肤上做一个1.5厘米长的横向或斜向切口。随后，沿与表层切口一致的方向，切开腹壁肌肉组织。
- 使用平头镊子找到脾脏，并轻柔地将其从腹腔内移出。用无菌棉签牵拉脾脏，找到附着于脾脏底部的胰腺尾部。
- 用平头镊子将胰腺尾部向外侧牵拉。
- 用无菌精细缝合针（6-0）的针尖从供体小鼠身上拾取一块精细切碎的肿瘤组织，并使用无菌镊子进行定位。
- 在轻柔地将胰腺尾部/身体向侧方牵拉的同时，将含有肿瘤组织碎片的缝线针插入胰腺尾部。缓慢地将缝线穿过组织，使肿瘤碎片紧贴胰腺尾部。根据碎片相对于组织的方位，再施加一到两针附加缝线。
- 将针头完全从组织中移除，保持胰腺/脾脏外置于体外额外60秒，同时检查是否有出血或渗漏迹象。随后，用钝头镊子将其轻柔地还纳至腹腔内。
- 使用6-0可吸收缝线连续或间断缝合腹壁肌层，然后使用3-0至6-0不可吸收缝线间断缝合皮肤。此时停止麻醉。
- 让小鼠放回其饲养笼中恢复，并自由获取食物和水。将笼子置于加热垫上以促进恢复。监测呼吸、灌注等生命体征 等等， 在恢复过程中。
- 确认小鼠恢复后出现翻正反射迹象，然后将鼠笼放回常规饲养环境。
- 术后8-12小时给予布托啡诺0.05-0.1 mg/kg，之后根据疼痛指征每8-12小时给药一次。
- 使用以下方法监测肿瘤生长 体内 生物发光成像系统（参见 材料表).
- 从原位移植后的第4天开始，通过成像监测肿瘤生长，每周进行两次成像。
- 成像当天，在成像前10分钟，对已麻醉（2–3%异氟烷，氧气流速2 L/min）的受体小鼠进行腹腔注射，给予30 mg/kg的D-荧光素钠。
- 使用无发射滤光片、曝光时间至少5秒的发光成像模式，在具备无自发荧光加热载物台的发光成像仪中对小鼠进行荧光素酶活性成像，成像过程中持续维持小鼠麻醉状态。
5. SQ 肿瘤的不可逆电穿孔治疗
- 准备所需材料：方波电穿孔仪、安全脚踏开关、电极（阵列针式与镊式电极）及适配器。同时准备好无菌缝线（不可吸收4-0）、酒精棉片、毛发剪、脱毛膏、眼用润滑剂、棉纱布、布托啡诺及麻醉剂。
- 使用气体灭菌法对镊式或阵列针式电极进行灭菌。不建议采用高压蒸汽灭菌法。在不同动物之间使用玻璃珠灭菌器对电极进行灭菌。
- 在手术前30分钟，向荷瘤小鼠给予布托啡诺0.05–0.1 mg/kg。
- 当皮下（SQ）肿瘤植入物直径达到5 mm时，按照步骤4.4–4.5成功诱导小鼠麻醉。
- 将麻醉后的小鼠侧放，以便接触 flank 部位的皮下肿瘤。使用毛发剪去除局部毛发，并用酒精棉片清洁皮肤。
- 针对皮下肿瘤，使用2针阵列电极。用镊子提起肿瘤正下方的皮肤，将电极平行于身体方向穿入皮肤，注意避免刺入腹膜腔。电极穿透皮肤后，应调整位置使其夹持肿瘤两侧。
- 设置电穿孔仪参数：输出100 µs脉冲，频率1 Hz，场强1,500 V/cm，共150个脉冲。通过脚踏开关施加脉冲。每10个脉冲之间间隔10 s，以利于热量消散并确认电极位置正确。
注意：若未使用麻痹剂，小鼠在接受不可逆电穿孔（IRE）时会出现肌肉收缩，可能导致电极移位，除非手动固定。 - 完成全部剂量施加后（总时间不应超过200 s）取出电极。记录电穿孔仪上显示的实际输出电压。按照步骤4.14–4.16让小鼠在IRE后恢复。
6. 原位肿瘤的不可逆电穿孔治疗
注意：原位肿瘤的不可逆电穿孔治疗涉及对同一只小鼠进行第二次存活手术，因此在开始前需要获得当地IACUC的特殊批准。
- 准备所需材料：将手术器械（如剪刀、手术刀、持针器、尖头镊子和平头镊子）进行高压灭菌。同时将以下物品置于附近：无菌缝合线（可吸收6-0和不可吸收4-0）、酒精棉片、毛发剪、脱毛膏、眼用润滑剂、棉纱布、10%聚维酮碘溶液、手术巾、加热垫、方波电穿孔仪、安全脚踏开关、电极及其适配器、丁丙诺啡和麻醉剂。
- 通过原位肿瘤生长情况评估小鼠 体内 通过腹腔注射 30 mg/kg 的 D-荧光素酶底物进行成像（见步骤 4.17）。
注意：原位肿瘤在植入后8至10天最适合进行不可逆电穿孔（IRE）治疗，此时肿瘤在荧光素酶发光成像中清晰可见，且仍局限于胰腺内（参见 代表性结果). - 按照步骤 4.4 - 4.9 定位移植的肿瘤。如果肿瘤不易找到，可使用钝头镊子轻轻移动胃和脾脏以辨认肿瘤。
- 用钝头镊子将肿瘤外置，并用镊式电极的铂金电极紧密夹住肿瘤。按照步骤5.7中预设的程序，使用方波电穿孔仪通过脚踏开关控制，以每组10次脉冲的方式施加电穿孔脉冲。
- IRE 处理后至少将肿瘤外置 60 秒，以监测是否有出血迹象。随后将肿瘤重新放回腹腔，按前述步骤（4.13–4.16）缝合切口，并持续监测小鼠直至其恢复。
- 使用IRE监测对肿瘤生长的影响 体内 按照第4.17步进行荧光素酶成像。
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结果
我们按照上述步骤操作，在5至6周龄的野生型C57BL/6小鼠皮下接种1×106个细胞与50% BMM混合物，成功构建SQ肿瘤模型。当肿瘤直径达到5至6 mm时，处死其中部分小鼠，取出肿瘤组织，并将其原位移植至受体C57BL/6小鼠体内。如图1所示的时间线，于移植后第10天进行IRE处理。其余携带SQ肿瘤的小鼠也接受IRE处理。
在SQ肿瘤中，IRE的电压和脉冲持续时间分别保持恒定在1,500 V/cm和 100 µs，但脉冲数量不同。 图2 结果显示，少数小鼠的SQ肿瘤在接受150次IRE脉冲后完全消退，而75次脉冲的效果较差。总体而言，9只小鼠中有4只在接受150次IRE脉冲后出现肿瘤完全消退。IRE治疗后1周对肿瘤组织进行组织学分析，发现存在大范围的中央肿瘤坏死区域，而未治疗的对照组肿瘤中未见此类现...
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讨论
在本研究中，我们建立了一种可用于研究不可逆电穿孔（IRE）对肿瘤生长影响的免疫健全小鼠胰腺癌（PC）模型。目前，IRE仅被用作少数经过数月术前治疗后无远处疾病进展的局部晚期PC患者的非热消融技术。因此，其应用受到限制，因为大多数局部晚期PC患者会发展为远处转移性疾病20。该模型将为采用多种扩展治疗参数及联合治疗方案评估IRE对PC作用的研究提供基础。
在实验方案中需要考虑的最重要因素是进行不可逆电穿孔（IRE）时肿瘤的大小。目前适用于小鼠模型的商用探针，其电极间距（5 - 10 mm）存在限制。因此，当肿瘤明显大于电极间距时，将导致消融不完全。对于皮下（SQ）肿瘤，建议使用双针阵列电极而非镊式电极，因为肿瘤周围皮肤会增加镊式电极中电流流动的阻力。虽然可通过在同一肿瘤内以不同深度和角度进行多次IRE操作来克服双针阵列电极的尺寸限制，但这种方法难以实现对肿瘤的均匀治疗。另一种方法是，对于较大的肿瘤（最大达10 mm），可在肿瘤下方的皮肤上做一个略长于肿瘤直径的切口，然后用镊子翻转覆盖的皮肤，将肿瘤经切口外置。随后可使用镊式电极对...
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披露
作者没有相关的财务披露。
致谢
RRW 已获得由圣地亚哥 C3 Padres Pedal the Cause 资助的协作转化研究基金（#PTC2017）对本工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ECM 830 方波电穿孔仪 | 哈佛仪器公司 | BTX # 45-0002 (58018-004) | |
| 2针阵列电极 | 哈佛仪器公司 | 45-0167 | |
| 安全脚踏开关 | 哈佛仪器 | 45-0211 | |
| 铂金镊子电极 | 哈佛仪器 | 45-0486 | |
| DMEM-F12 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11320-033 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 10437028 | |
| 胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| Matrigel | 康宁 | 354230 | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| 布托啡诺 | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-荧光素 | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum 体内成像系统 | Perkin Elmer | 124262 | |
| 小鼠品系 C57BL/6J | 杰克逊实验室 | 000664/Black 6 | |
| 细胞系（KPC-Luc 4580） | 北卡罗来纳大学J.J. Yeh实验室 | ||
| BD Precisionglide 注射器针头 | Sigma-Aldrich公司 | Z192406 | |
| 酒精棉片（70%异丙醇） | BD | 326895 | |
| 数显卡尺 | 赛默飞世尔科技 | 14-648-17 | |
| 一次性无菌手术刀 | VWR | 21909 | |
| 棉签 | VWR | 89198 | |
| 缝合针，45 厘米，6-0 规格 | 哈佛仪器公司 | 72-3308 | |
| 缝合针，45 厘米，4-0 号 | 哈佛仪器公司 | 72-3314 | |
| 聚维酮碘 10% | BD | 29900-404 | |
| 一次性暖贴 | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| 小鼠毛发剪 | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| 手术铺巾 | 哈佛仪器 | 59-7421 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 10010023 |
参考文献
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