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方法文章

分离与 体外 小鼠与人肺泡巨噬细胞的培养

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DOI：

10.3791/57287

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2018年4月20日

 ,  ,  , 
1Norton Thoracic Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center, 2Flow Cytometry Core, St. Joseph's Hospital and Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍用于实验目的从人类和小鼠模型中分离和培养肺泡巨噬细胞的方法学。

摘要

肺泡巨噬细胞是终末分化的、起源于产前阶段的肺组织驻留型巨噬细胞。这类细胞在其较长的生命周期中具有独特性，并在肺部发育与功能，以及对感染和炎症的肺局部反应中发挥重要作用。迄今为止，尚无统一的方法用于从人类和小鼠中鉴定、分离和处理肺泡巨噬细胞。在多种实验条件下对这些重要的天然免疫细胞开展研究亟需一种标准化方法。本文所述方法可被任何实验室便捷采用，是一种简化且高效的肺泡巨噬细胞获取与维持技术，适用于从支气管肺泡灌洗液或肺组织中分离肺泡巨噬细胞并进行后续培养 体外由于肺泡巨噬细胞主要以贴壁细胞的形式存在于肺泡中，本方法的重点在于收获和鉴定前将其从附着部位解离。肺是一个高度血管化的器官，多种髓系和淋巴系来源的细胞在此定居、相互作用，并受到肺微环境的影响。通过使用本文所述的一组表面标志物，研究人员可以简便且明确地区分肺泡巨噬细胞与其他白细胞，并将其纯化用于后续实验。本研究所建立的培养方法适用于人和小鼠肺泡巨噬细胞的培养 体外 生长，并且适用于细胞和分子水平的研究。

引言

肺部微环境是一个独特而复杂的生态系统，具有精细的气道和血管网络。吸入的空气经气管进入，再通过支气管和细支气管的多级分支，最终到达肺泡，在此进行血液与空气之间的气体交换。由于呼吸表面直接与大气接触，因此需要抵御空气中颗粒物和污染物可能带来的有害影响。肺部具备多种物理、化学和免疫屏障以提供保护。其中，吞噬细胞在呼吸表面的分布构成了重要的第一道防御系统。肺泡巨噬细胞（AMs）是肺组织驻留型吞噬细胞的一种，构成了肺部巨噬细胞群体的绝大部分。顾名思义，AMs主要定位于肺泡腔内，以贴壁细胞的形式存在，持续监测周围环境，并与肺泡上皮细胞进行交流1。在稳态肺组织中，肺泡腔内超过95%的吞噬细胞为AMs2，其组成可能因炎症、感染或长期暴露于污染物而发生改变。

肺泡巨噬细胞（AMs）参与多种功能，这些功能可能局限于肺部，或具有全身性重要意义。例如，AMs在肺的发育和最佳功能维持、免疫监视以及细胞碎片、入侵病原体和吸入颗粒的清除过程中起着关键作用3,4,5,6,7。已知靶向耗竭AMs会损害呼吸道病毒和细菌的清除能力4,8。除了作为吞噬细胞和维持肺稳态的第一道防线外，AMs还被证实可作为抗原呈递细胞，参与激活T细胞免疫9，增强鼻内疫苗的有效性10，并在肺移植后影响局限于肺部的自身免疫反应11,12。AMs功能缺陷与肺泡蛋白沉积症（PAP）相关，该疾病由基因突变、恶性肿瘤或感染引起，导致肺表面活性物质清除障碍13,14。目前，AMs移植正被探索作为治疗PAP的一种治疗策略15,16。

已知肺泡巨噬细胞（AMs）起源于胚胎发生阶段，并在一生中持续存在于肺部，不会被循环中的白细胞所替代2,17。尽管在稳态肺组织中几乎检测不到AM的更新，但在某些临床条件下已报道存在不同程度的AM更替，包括流感病毒感染4、骨髓清除性照射18、内毒素暴露19以及老年状态20。目前认为AM通过低水平的增殖实现自我更新17,21，但一些近期研究表明，在实验条件下单核细胞可分化为一群血管内肺巨噬细胞22,23，然而这些新转化的肺巨噬细胞在肺部疾病中的功能仍有待明确。此外，明确AM活化过程中刺激信号的阈值是一个颇具潜力的研究方向，因为肺组织始终试图在炎症信号与免疫调节机制之间维持一种平衡状态。

导致免疫调节功能丧失的生理或病理改变在多种临床情况下均具有重要的评估意义（例如，呼吸道感染、炎症性肺疾病和纤维化性肺疾病）。然而，肺泡巨噬细胞（AMs）正日益被视为肺部健康的重要指标，甚至决定因素11,24。目前尚无统一的方案可用于从人类及临床前小鼠模型中获取、鉴定和/或维持肺泡巨噬细胞。由于缺乏对AM前体细胞和表型的共识，以及详细方法学的缺失，严重阻碍了对AM在肺部健康与疾病中作用的深入解析。本方案提供了一种明确的鉴定、分离及体外培养策略，将显著推动对AM生物学行为的理解，并促进以AM为靶点的诊断与治疗研究。

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方案

本文所述所有方法均已获得圣约瑟夫医院和医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）及机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 从小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中分离肺泡巨噬细胞

  1. 通过腹腔注射给予一只八周龄C57BL/6小鼠氯胺酮（87.5 mg/kg体重）和赛拉嗪（12.5 mg/kg体重）混合麻醉剂进行麻醉。待小鼠达到外科麻醉状态，反射消失且肌肉松弛后，继续后续操作。
  2. 将小鼠置于解剖台上，腹部朝上。在眼睛上涂抹眼科用兽医软膏以防止脱水，并用浸有70%异丙醇的无菌酒精擦拭垫擦拭小鼠整个腹面进行消毒。
  3. 将小鼠固定，使其四肢均被束缚。
  4. 使用显微解剖工具轻柔地打开腹腔。操作时需尽可能扩大暴露面积，同时避免损伤任何内脏器官或形成悬垂组织。
  5. 通过纵隔缓慢切开胸廓，轻柔地打开胸腔。理想情况下，可从一侧到另一侧完全切除肋骨。打开胸腔时必须格外小心，避免损伤肺部的胸膜。
  6. 找到下腔静脉，剪开以放血小鼠。使用吸水棉垫吸去血液。
  7. 向右心室注射10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）（使用10 mL注射器和25G针头），以冲洗循环的血细胞。用吸水棉垫吸收流出的血液。当肺组织完全灌注后，其外观将变得苍白，此时即可进行肺泡灌洗。
  8. 轻轻切开颈部的皮肤和肌肉，暴露气道。仔细切除邻近的肌肉、软骨和脂肪组织，注意不要损伤气管。
  9. 做一个小切口（<在喉部后方的气管上做一个（约2 mm）切口。切口大小应刚好足以插入导管，同时保持气管与喉部相连。将一根1英寸、22G、无针头的导管插入气管，方向朝向肺部。使用丝线编织缝合线（4-0，不可吸收）以方结固定导管。
    注意：应根据小鼠体型修剪导管长度。导管过短或过长均可能导致灌洗过程中发生泄漏和/或气道撕裂。导管长度应确保完全插入后，其尖端仍位于气管内深处，且不进入主支气管。
  10. 连接一个装有冰冻支气管肺泡灌洗缓冲液（Ca2+ 和 Mg2+ 向导管中加入不含钙镁的 PBS 缓冲液（含 1 mM 乙二胺四乙酸，EDTA），缓慢将缓冲液注入肺部，使肺膨胀。保持注射器与导管连接 5 秒钟，然后轻轻回抽活塞，吸取灌洗液，使肺萎陷。将收集的液体置于预置冰上的 15 mL 尖底离心管中。
  11. 重复步骤 1.10 共十次，并收集灌洗液。每次灌洗所用缓冲液体积不得超过 1 mL，以免超过肺容量导致肺组织破裂。
  12. 用 CO 处死小鼠2 根据IACUC批准的方案进行过量麻醉。
  13. 在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 10 mL 支气管肺泡灌洗液 10 分钟。细胞沉淀中含有支气管肺泡灌洗细胞。
    注意： 沉淀物可能非常细小，因此在吸除上清液时需格外小心。
  14. 将支气管肺泡灌洗（BAL）细胞重悬于100 μL流式/分选缓冲液（PBS + 2%热灭活胎牛血清（FBS）+ 1 mM EDTA + 25 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES））中。
  15. 通过加入小鼠Fc阻断剂（克隆号2.4G2，10 μg/mL），冰上孵育20分钟，以阻断抗体与Fc受体的非特异性结合。
  16. 进行抗体染色，并同时设置荧光减一（FMO）对照和单染对照11,25使用细胞分析仪评估BAL细胞（参见 材料表）随后使用适当的分析软件进行单细胞流式细胞术分析（参见 材料表).
  17. 通过荧光激活细胞分选仪分离AMs（参见 材料表) 当肺泡巨噬细胞用于后续实验时，直接加入1 mL小鼠肺泡巨噬细胞培养基中 体外 培养或 体内 细胞转移。或者，将AMs分选至1 mL裂解缓冲液中（参见 材料表加入10 μL/mL β-巯基乙醇用于RNA提取。

2. 小鼠肺部AMs的分离，单细胞悬液制备

  1. 通过腹腔注射给予一只8周龄C57BL/6小鼠氯胺酮（87.5 mg/kg体重）和赛拉嗪（12.5 mg/kg体重）混合物进行麻醉。当小鼠达到外科麻醉深度，反射消失且肌肉松弛时，继续后续操作。
  2. 将小鼠置于解剖台上，腹部朝上。在眼睛上涂抹眼科用兽医软膏以防止脱水，并用浸透70%异丙醇的无菌酒精棉片擦拭小鼠整个腹部表面进行消毒。
  3. 将小鼠固定，使其四肢均被束缚。
  4. 使用显微解剖工具轻柔地打开腹腔。操作时需尽可能扩大暴露面积，同时避免损伤任何内脏器官或形成悬垂组织。
  5. 通过纵隔缓慢切开胸廓，轻柔地打开胸腔。理想情况下，可从一侧到另一侧完全切除肋骨。打开胸腔时必须格外小心，避免损伤肺部的胸膜。
  6. 找到下腔静脉，剪开以放血小鼠。使用吸水棉垫吸取血液。
  7. 用10 mL注射器和25G针头将10 mL冰冷的PBS注入右心室，以冲洗循环的血细胞。完全灌注后，肺组织将变得苍白，即可进行取材。
  8. 用剪刀切断气管、血管和韧带，将肺组织剥离并置于含有5 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的15 mL圆锥形离心管中。置于冰上保存，直至进行下一步操作。
  9. 用 CO 处死小鼠2 根据IACUC批准的方案进行过量麻醉。
  10. 将灌注后的肺组织转移至含有 3 mL DMEM 的无菌无热原 60 mm 培养皿中。借助解剖镊子分离出气道及其他可能存在的坚硬非肺组织。用手术刀将肺组织切碎 <1 mm 大小
  11. 加入 300 µg/mL Liberase TL 和 5 U/mL DNase I，用移液器吹打混匀，37°C 培养箱中孵育 25 分钟。孵育 10 分钟后，轻轻吹打混匀一次。
  12. 将解离的肺组织通过安装在50 mL锥形管上的100 µm细胞筛。使用1 mL注射器活塞的尾端在滤网上碾压细胞团块。用20 mL洗涤缓冲液（PBS + 2% 热灭活FBS + 2 mM EDTA）冲洗滤网。
  13. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 20 mL 洗涤缓冲液中。
  14. 重复步骤 2.12 和 2.13 两次，每次更换滤膜和离心管。将滤膜预先在洗涤缓冲液中浸泡超过五分钟可提高 AM 产量。向细胞沉淀中加入 100 μL 流式/分选缓冲液，制备单细胞悬液。
  15. 通过加入小鼠Fc阻断剂（克隆号2.4G2，10 μg/mL），冰上孵育20分钟，以阻断抗体与Fc受体的非特异性结合。
  16. 进行抗体染色，并设置FMO对照和单染对照11,25使用细胞分析仪评估肺细胞（参见 材料表）随后通过分析软件进行单细胞流式细胞术分析。
  17. 使用细胞分选仪对AMs进行分选（参见 材料表) 当肺泡巨噬细胞用于后续实验时，直接加入1 mL小鼠肺泡巨噬细胞培养基中 体外 培养或 体内 细胞转移。或者，将肺泡巨噬细胞分选至含有10 μL/mL β-巯基乙醇的1 mL裂解缓冲液中，用于RNA提取。

3. 从人支气管肺泡灌洗液中分离肺泡巨噬细胞

  1. 将人支气管肺泡灌洗液（BAL 液）在 4 °C 条件下从临床科室转运至实验室。
  2. 在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 10–50 mL BAL 液 10 分钟。细胞沉淀中含有 BAL 细胞11。
  3. 用 20 mL 洗涤缓冲液（PBS + 2% 热灭活 FBS + 2 mM EDTA）重悬沉淀，并在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟。
  4. 将 BAL 细胞重悬于 100 μL 流式/分选缓冲液（PBS + 2% 热灭活 FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES）中。
  5. 加入人源 Fc 封闭抗体（克隆号 Fc1.3070，25 μg/mL），冰上孵育 20 分钟，以阻断抗体与 Fc 受体的非特异性结合。
  6. 进行抗体染色，并设置 FMO 和单染对照11,24。使用细胞分析仪（见材料表）检测 BAL 细胞，随后通过分析软件进行单细胞流式细胞术分析。
  7. 使用细胞分选仪（见材料表）直接将肺泡巨噬细胞（AMs）分选至 1 mL 人 AM 培养基或含 10 μL/mL β-巯基乙醇的 1 mL 裂解缓冲液中。

4. 体外 肺泡巨噬细胞的培养

  1. 细胞分选后，于 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟收集细胞。
  2. 将人肺泡巨噬细胞（AMs）重悬于 1 mL 人 AM 培养基中 [RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、20% L-929 细胞培养上清液（作为巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，终浓度为 100 U/mL）、1 mM 丙酮酸钠、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）以及 1× 青霉素/链霉素（可选）]。同样，将小鼠 AMs 重悬于 1 mL 小鼠 AM 培养基中 [DMEM 培养基，添加 10% FBS、20% L-929 培养上清液（作为 M-CSF 来源，终浓度为 100 U/mL）、1 mM 丙酮酸钠、10 mM HEPES 以及 1× 青霉素/链霉素（可选）]。
  3. 使用细胞计数仪对拒染台盼蓝的活细胞进行计数，并将活细胞浓度调整至 1 × 106/mL。
    注意：理想情况下，可从 8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠收集的支气管肺泡灌洗液（BAL）中分离出最多 5 × 105 个 AMs。从小鼠肺组织消化液中获得的 AMs 产量存在差异，可能略低于 BAL 液中的产量。人 BAL 液中 AMs 的产量取决于 BAL 液体积、灌洗过程中使用的生理盐水总体积以及患者的临床状况。
  4. 根据细胞得率和实验需求，将细胞接种至腔室载玻片、培养皿或培养瓶中。理想情况下，在 T25 培养瓶中以每瓶 10 mL 培养基接种细胞密度为 1 × 105/mL 的 AMs。
  5. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育。
    注意：AMs 以贴壁方式生长，增殖极为缓慢（倍增时间 >7 天）。
  6. 接种后 24 小时，AMs 应已贴壁，此时轻柔更换培养基不会导致细胞脱落。从培养容器一端吸除旧培养基，并补充预热至 37 °C 的新鲜培养基。
    注意：此时细胞可用于评估 AMs 的生理特性或刺激物的作用效果。在腔室载玻片上培养的 AMs 可方便地使用特异性抗体进行染色，适用于显微镜观察。如需进行流式细胞术分析，应使用非酶解细胞解离液孵育后收获 AMs。
  7. 吸除培养基，加入足以覆盖培养表面的解离液（约每 T25 培养瓶 2 mL），于 37 °C 孵育 5 至 10 分钟。无需刮取，也不建议机械刮取细胞。轻轻敲击容器侧壁，加入 1 至 2 mL 流式/分选缓冲液，轻柔吹打数次，使大部分贴壁细胞脱落。
  8. 对于 RNA 研究，直接在培养皿中加入裂解缓冲液裂解细胞。

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结果

用于鉴定小鼠肺泡巨噬细胞（AMs）的流式细胞术分析方法如图1所示。该方法包括分析一组最低限度的表面标志物，以区分肺泡巨噬细胞与其他肺内常驻或浸润的吞噬细胞。需通过差异分析，将肺泡巨噬细胞与肺间质巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、单核细胞以及肺内单核细胞来源的肺巨噬细胞明确区分开来。以下表面标志物组合可用于快速区分这些细胞类型：肺泡巨噬细胞（AMs）为 CD45+、CD11c+、Siglec-F+、CD64+、I-Ab+/-、F4/80-、CD11b-；间质巨噬细胞为 CD45+、CD11b+、I-Ab+、CD64+、CD24-；CD11b+ 树突状细...

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讨论

肺泡巨噬细胞是长期存活的肺驻留巨噬细胞，自出生时开始定植于肺部，并持续终生26. 它们在肺生理学中的作用7 和病理学12 及其预测肺部自身免疫的潜力24 已被识别。由于肺泡巨噬细胞（AMs）在肺部具有长期存在特性11,27 并且因为它们参与了免疫反应的激活和进展11,24，它们在其他慢性炎症性和纤维化肺部疾病中的作用仍需进一步评估。历史上，肺泡巨噬细胞（AMs）的身份曾存在混淆，常被错误鉴定。随着近期表型标志物的采用25,28，现在可以将人和小鼠的肺泡巨噬细胞与其他肺部吞噬细胞区分开来（例如，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Clare Prendergast在稿件编辑方面的协助。DKN由Flinn基金会的研究资助（#2095）支持，TM由美国国立卫生研究院资助（R01HL056643和R01HL092514）支持。DKN开发了实验方法，设计了研究并撰写了稿件；OM协助动物实验和临床样本的获取；SB协助流式细胞术分析和细胞分选；TM监督了研究工作并对稿件进行了审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
非酶细胞解离液Millipore-SigmaC5789
Puralube Vet 眼膏Dechra620300
22G 导管 Terumo Medical ProductsSR-OX2225CA
4-0 不可吸收丝线缝合线 Kent ScientificSUT-15-2
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 Corning21-031-CM
小鼠 Fc 封闭抗体 BD Biosciences553142
裂解缓冲液（PureLink RNA 试剂盒）Thermo Fisher Scientific 12183018A
β-巯基乙醇 Millipore-SigmaM6250 
FACSAria II 细胞分选仪 BD Biosciences644832
氯胺酮 （Ketathesia）Henry Schein56344
赛拉嗪 （AnaSed）Akorn139-236
RPMI 1640Corning10-040-CM
DMEMCorning10-017-CM
Liberase TL Millipore-Sigma5401020001
DNase IMillipore-SigmaAMPD1-1KT
100μm 细胞筛 Corning352360
人 Fc 封闭抗体BD Biosciences564220
EDTACorning46-034-CI
Countess II 自动细胞计数仪Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
台盼蓝溶液Thermo Fisher Scientific 15250061
HEPESCorning25-060-CI
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150H
L-929 细胞系American Type Culture CollectionATCC, CCL-1
青霉素/链霉素 Corning30-002-CI
丙酮酸钠Corning25-000-CI
T25 组织培养瓶Thermo Fisher Scientific 156367
60 mm 培养皿 Millipore-SigmaCLS3261
15 mL 锥形管 Corning352097
50 mL 锥形管 Corning352098
LSRFortessa 细胞分析仪BD Biosciences657669
FlowJoFlowJov10.4分析软件
抗 CD45（小鼠）Biolegend147709克隆 I3/2.3，FITC 标记
抗 CD11b（小鼠）Biolegend101228克隆 M1/70，PerCP/Cy5.5 标记
抗 CD11c（小鼠）BD Biosciences565452克隆 N418，BV 421 标记
抗 I-Ab（小鼠）Biolegend116420克隆 AF6-120.1，PE/Cy7 标记
抗 Siglec-F（小鼠）BD Biosciences562757克隆 E50-2440，PE-CF594 标记
抗 Siglec-H（小鼠）Biolegend129605克隆 551，PE 标记
抗 F4/80（小鼠）Biolegend123118克隆 BM8，APC/Cy7 标记
抗 Ly-6C（小鼠）Biolegend128035克隆 HK1.4，BV605 标记
抗 CD64（小鼠）Biolegend139311克隆 X54-5/7.1，BV711 标记
抗 CD24（小鼠）BD Biosciences563115克隆 M1/69，BV510 标记
抗 CD103（小鼠）BD Biosciences745305克隆 OX-62，BV650 标记
抗 CD317（小鼠）Biolegend127015克隆 927，APC 标记
抗 CXCR1（小鼠）Biolegend149029克隆 SA011F11，BV785 标记
抗 CD45（人）Biolegend304017克隆 HI30，AF488 标记
抗 CD11b（人）Biolegend101216克隆 M1/70，PE/Cy7 标记
抗 HLA-DR（人）Biolegend307618克隆 L243，APC/Cy7 标记
抗 CD169（人）Biolegend346008克隆 7-239，APC 标记
抗 CD206（人）Biolegend321106克隆 15-2，PE 标记
抗 CD163（人）Biolegend333612克隆 GHI/61，BV421 标记

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