本文介绍用于实验目的从人类和小鼠模型中分离和培养肺泡巨噬细胞的方法学。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肺泡巨噬细胞是终末分化的、起源于产前阶段的肺组织驻留型巨噬细胞。这类细胞在其较长的生命周期中具有独特性，并在肺部发育与功能，以及对感染和炎症的肺局部反应中发挥重要作用。迄今为止，尚无统一的方法用于从人类和小鼠中鉴定、分离和处理肺泡巨噬细胞。在多种实验条件下对这些重要的天然免疫细胞开展研究亟需一种标准化方法。本文所述方法可被任何实验室便捷采用，是一种简化且高效的肺泡巨噬细胞获取与维持技术，适用于从支气管肺泡灌洗液或肺组织中分离肺泡巨噬细胞并进行后续培养 体外由于肺泡巨噬细胞主要以贴壁细胞的形式存在于肺泡中，本方法的重点在于收获和鉴定前将其从附着部位解离。肺是一个高度血管化的器官，多种髓系和淋巴系来源的细胞在此定居、相互作用，并受到肺微环境的影响。通过使用本文所述的一组表面标志物，研究人员可以简便且明确地区分肺泡巨噬细胞与其他白细胞，并将其纯化用于后续实验。本研究所建立的培养方法适用于人和小鼠肺泡巨噬细胞的培养 体外 生长，并且适用于细胞和分子水平的研究。
引言
肺部微环境是一个独特而复杂的生态系统，具有精细的气道和血管网络。吸入的空气经气管进入，再通过支气管和细支气管的多级分支，最终到达肺泡，在此进行血液与空气之间的气体交换。由于呼吸表面直接与大气接触，因此需要抵御空气中颗粒物和污染物可能带来的有害影响。肺部具备多种物理、化学和免疫屏障以提供保护。其中，吞噬细胞在呼吸表面的分布构成了重要的第一道防御系统。肺泡巨噬细胞（AMs）是肺组织驻留型吞噬细胞的一种，构成了肺部巨噬细胞群体的绝大部分。顾名思义，AMs主要定位于肺泡腔内，以贴壁细胞的形式存在，持续监测周围环境，并与肺泡上皮细胞进行交流1。在稳态肺组织中，肺泡腔内超过95%的吞噬细胞为AMs2，其组成可能因炎症、感染或长期暴露于污染物而发生改变。
肺泡巨噬细胞（AMs）参与多种功能，这些功能可能局限于肺部，或具有全身性重要意义。例如，AMs在肺的发育和最佳功能维持、免疫监视以及细胞碎片、入侵病原体和吸入颗粒的清除过程中起着关键作用3,4,5,6,7。已知靶向耗竭AM....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均已获得圣约瑟夫医院和医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）及机构审查委员会（IRB）的批准。
1. 从小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中分离肺泡巨噬细胞
- 通过腹腔注射给予一只八周龄C57BL/6小鼠氯胺酮（87.5 mg/kg体重）和赛拉嗪（12.5 mg/kg体重）混合麻醉剂进行麻醉。待小鼠达到外科麻醉状态，反射消失且肌肉松弛后，继续后续操作。
- 将小鼠置于解剖台上，腹部朝上。在眼睛上涂抹眼科用兽医软膏以防止脱水，并用浸有70%异丙醇的无菌酒精擦拭垫擦拭小鼠整个腹面进行消毒。
- 将小鼠固定，使其四肢均被束缚。
- 使用显微解剖工具轻柔地打开腹腔。操作时需尽可能扩大暴露面积，同时避免损伤任何内脏器官或形成悬垂组织。
- 通过纵隔缓慢切开胸廓，轻柔地打开胸腔。理想情况下，可从一侧到另一侧完全切除肋骨。打开胸腔时必须格外小心，避免损伤肺部的胸膜。
- 找到下腔静脉，剪开以放血小鼠。使用吸水棉垫吸去血液。
- 向右心室注射10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）（使用10 mL注射器和25G针头），以冲洗循环的血细胞。用吸水棉垫吸收流出的血液。当肺组织完全灌注后，其外观将变得苍白，此时即可进行肺泡灌洗。
- 轻轻切开颈部的皮肤和肌肉，暴露气道。仔细切除邻近的肌肉、软骨和脂肪组织，注意不要损伤气管。
- 做一....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
用于鉴定小鼠肺泡巨噬细胞（AMs）的流式细胞术分析方法如图1所示。该方法包括分析一组最低限度的表面标志物，以区分肺泡巨噬细胞与其他肺内常驻或浸润的吞噬细胞。需通过差异分析，将肺泡巨噬细胞与肺间质巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、单核细胞以及肺内单核细胞来源的肺巨噬细胞明确区分开来。以下表面标志物组合可用于快速区分这些细胞类型：肺泡巨噬细胞（AMs）为 CD45+、CD11c+、Siglec-F+、CD64+、I-Ab+/-、F4/80-、CD11b-；间质巨噬细胞为 CD45+、CD11b+、I-Ab+、CD64+、CD24-；CD11b+ 树突状细.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
肺泡巨噬细胞是长期存活的肺驻留巨噬细胞，自出生时开始定植于肺部，并持续终生26. 它们在肺生理学中的作用7 和病理学12 及其预测肺部自身免疫的潜力24 已被识别。由于肺泡巨噬细胞（AMs）在肺部具有长期存在特性11,27 并且因为它们参与了免疫反应的激活和进展11,24，它们在其他慢性炎症性和纤维化肺部疾病中的作用仍需进一步评估。历史上，肺泡巨噬细胞（AMs）的身份曾存在混淆，常被错误鉴定。随着近期表型标志物的采用25,28，现在可以将人和小鼠的肺泡巨噬细胞与其他肺部吞噬细胞区分开来（例如，.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Clare Prendergast在稿件编辑方面的协助。DKN由Flinn基金会的研究资助（#2095）支持，TM由美国国立卫生研究院资助（R01HL056643和R01HL092514）支持。DKN开发了实验方法，设计了研究并撰写了稿件；OM协助动物实验和临床样本的获取；SB协助流式细胞术分析和细胞分选；TM监督了研究工作并对稿件进行了审阅。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 非酶细胞解离液 | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet 眼膏 | Dechra | 620300 | |
| 22G 导管 | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 不可吸收丝线缝合线 | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-031-CM | |
| 小鼠 Fc 封闭抗体 | BD Biosciences | 553142 | |
| 裂解缓冲液（PureLink RNA 试剂盒） | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| β-巯基乙醇 | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II 细胞分选仪 | BD Biosciences | 644832 | |
| 氯胺酮 （Ketathesia） | Henry Schein | 56344 | |
| 赛拉嗪 （AnaSed） | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm 细胞筛 | Corning | 352360 | |
| 人 Fc 封闭抗体 | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 细胞系 | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 丙酮酸钠 | Corning | 25-000-CI | |
| T25 组织培养瓶 | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm 培养皿 | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL 锥形管 | Corning | 352097 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa 细胞分析仪 | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | 分析软件 |
| 抗 CD45（小鼠） | Biolegend | 147709 | 克隆 I3/2.3，FITC 标记 |
| 抗 CD11b（小鼠） | Biolegend | 101228 | 克隆 M1/70，PerCP/Cy5.5 标记 |
| 抗 CD11c（小鼠） | BD Biosciences | 565452 | 克隆 N418，BV 421 标记 |
| 抗 I-Ab（小鼠） | Biolegend | 116420 | 克隆 AF6-120.1，PE/Cy7 标记 |
| 抗 Siglec-F（小鼠） | BD Biosciences | 562757 | 克隆 E50-2440，PE-CF594 标记 |
| 抗 Siglec-H（小鼠） | Biolegend | 129605 | 克隆 551，PE 标记 |
| 抗 F4/80（小鼠） | Biolegend | 123118 | 克隆 BM8，APC/Cy7 标记 |
| 抗 Ly-6C（小鼠） | Biolegend | 128035 | 克隆 HK1.4，BV605 标记 |
| 抗 CD64（小鼠） | Biolegend | 139311 | 克隆 X54-5/7.1，BV711 标记 |
| 抗 CD24（小鼠） | BD Biosciences | 563115 | 克隆 M1/69，BV510 标记 |
| 抗 CD103（小鼠） | BD Biosciences | 745305 | 克隆 OX-62，BV650 标记 |
| 抗 CD317（小鼠） | Biolegend | 127015 | 克隆 927，APC 标记 |
| 抗 CXCR1（小鼠） | Biolegend | 149029 | 克隆 SA011F11，BV785 标记 |
| 抗 CD45（人） | Biolegend | 304017 | 克隆 HI30，AF488 标记 |
| 抗 CD11b（人） | Biolegend | 101216 | 克隆 M1/70，PE/Cy7 标记 |
| 抗 HLA-DR（人） | Biolegend | 307618 | 克隆 L243，APC/Cy7 标记 |
| 抗 CD169（人） | Biolegend | 346008 | 克隆 7-239，APC 标记 |
| 抗 CD206（人） | Biolegend | 321106 | 克隆 15-2，PE 标记 |
| 抗 CD163（人） | Biolegend | 333612 | 克隆 GHI/61，BV421 标记 |
参考文献
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
