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方法文章

通过细胞光转化追踪斑马鱼胚胎中的心内膜组织运动

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DOI：

10.3791/57290

⸱

2018年2月20日

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在活体斑马鱼胚胎的心内膜细胞中对Kaede荧光蛋白进行光转化的方法，该方法可用于追踪心内膜细胞在房室管及房室心脏瓣膜发育过程中的动态变化。

摘要

在胚胎发育过程中，细胞的行为会发生动态变化，揭示这些变化背后的细胞机制是发育生物学领域的一个基本目标。光转化蛋白的发现与发展极大地促进了我们对这些动态变化的理解，提供了一种光学标记细胞和组织的方法。然而，尽管光转化、延时显微成像以及后续图像分析在揭示脑或眼等器官的细胞动态方面已取得显著成功，但由于心脏在心动周期中快速运动所带来的技术挑战，该方法通常并未应用于发育中的心脏。本实验方案包含两个部分。第一部分描述了一种用于在斑马鱼房室管（AVC）及房室心脏瓣膜发育过程中对内皮细胞（EdCs）进行光转化并随后追踪的方法。该方法通过使用药物暂时停止心脏跳动，以实现精确的光转化。去除药物后，心脏恢复搏动，胚胎继续正常发育，直至在后续发育时间点再次停止心脏跳动，以便对已光转化的EdCs进行高分辨率成像。方案的第二部分介绍了一种图像分析方法，通过将三维结构中的荧光信号映射到二维图谱上，定量测量早期胚胎AVC中光转化或非光转化区域的长度。该方案的两个部分相结合，可用来研究构成斑马鱼AVC和房室心脏瓣膜的细胞的来源与行为，并有望应用于研究影响AVC和/或瓣膜发育的突变体、形态抑制子或经试剂处理的胚胎。

引言

斑马鱼目前是研究细胞和发育过程最重要的脊椎动物模型之一 体内这主要归因于斑马鱼具有光学透明性且易于进行遗传操作，使其成为应用基于基因编码的光敏蛋白技术等光学方法的强有力模型。1在心脏发育研究中，斑马鱼可通过扩散获得足够的氧气，因此即使是没有心跳的突变体也能存活至发育的第一周，从而使得研究人员能够分析发育基因以及异常血流对心脏形态发生的影响，而这类研究在大多数脊椎动物中难以实现2.

斑马鱼心脏管在受精后24小时（hpf）形成。心脏管形成后不久即开始主动搏动。到36 hpf时，出现明显的缩窄区域，将心房与心室分隔开来。该缩窄区域称为房室管（AVC），此区域的细胞形态由扁平状转变为立方状3。斑马鱼房室瓣膜的形态发生始于受精后约48小时。到受精后5天，两个瓣叶已延伸进入AVC区域，在心脏搏动周期中阻止血液从心室倒流回心房4。在AVC及瓣膜形成过程中追踪细胞具有挑战性，因为心脏快速搏动使得通过传统延时显微镜技术难以持续追踪细胞5,6。本实验方案改编自Steed et al., 20167，描述了一种利用Tg(fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8转基因斑马鱼品系的方法，该品系在内皮细胞（包括心内膜细胞）中表达光转化蛋白Kaede。使用药物2,3-丁二酮单肟（BDM）可暂时抑制心脏搏动，从而在36至55 hpf期间精确地对心内膜细胞（EdCs）进行光转化，并在特定发育时间点实现高分辨率成像。已有研究证实，采用该方法光转化的EdCs可在光转化后五天甚至更长时间内与其未转化的邻近细胞清晰区分7。本方案还详细介绍了对48 hpf之前胚胎中光转化EdCs进行图像分析的方法，该方法已成功用于追踪AVC发育过程中的组织运动（Boselli et al.，待发表）9。我们希望读者能发现本方案在研究正常胚胎以及突变体、形态干扰（morphants）或药物处理胚胎中AVC和瓣膜发育过程中的实用性。如需了解斑马鱼发育过程中利用光转化蛋白进行细胞追踪的一般性实验方案，请参阅Lombardo et al., 201210的文章。

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方案

1. 准备模具并固定琼脂糖

  1. 使用3D打印机或传统机械加工工具，按照图1所示尺寸制作模具。
  2. 用移液器吸取约1.5 mL熔化的1%琼脂糖，加入35 mm塑料制样品托中。将塑料模具放入液态琼脂糖中，注意避免模具与琼脂糖之间产生气泡。将样品托置于4 °C环境中，待琼脂糖凝固（约需5分钟），然后取出塑料模具。
  3. 如需将样品托保存以备后续使用，应先盖上盖子，再用封口膜将样品托和盖子紧密包裹。样品托可倒置（盖子朝下）保存于4 °C，最长可保存5天。
  4. 在样品固定当天，预先准备含0.7%低熔点琼脂糖的1 mL分装液，置于1.5 mL离心管中备用。
    注意：若未用封口膜紧密包裹样品托，随着水分蒸发，琼脂糖孔结构会随时间发生变形。

2. 获取用于光转换的胚胎

  1. 将 Tg(fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) 品系进行品内杂交，并将约 200 个胚胎置于胚胎培养基中，在 28.5 °C 黑暗条件下培养。有关斑马鱼品系杂交的更多细节，请参阅 JoVE 科学教育数据库11。
  2. 受精后 5 小时至 24 小时之前，用 1-苯基-2-硫脲（PTU）处理胚胎以抑制色素形成（胚胎培养基中含 0.003% PTU）。
  3. 光转化开始前约 1 小时，在荧光体视显微镜下筛选胚胎，选择 5 个表现出最强绿色荧光的健康胚胎。建议在观察胚胎时使用低强度光照，以避免胚胎暴露于环境光下，从而防止非特异性细胞中的 Kaede 蛋白发生光转化。

3. 包埋

  1. 配制 10 mL 封片介质：在胚胎培养基中加入 0.02% 三卡因（tricaine）和 50 mM BDM。
  2. 向封片皿中加入 2 mL 封片介质，静置 15–30 分钟，使溶液充分扩散至琼脂糖中。
  3. 在此期间，将 1 mL 的 0.7% 低熔点（LMP）琼脂糖置于 70 °C 金属浴中加热约 5 分钟，使其完全融化。
    1. 待 LMP 琼脂糖稍冷却后，向其中加入 25 µL 的 8 mg/mL 三卡因溶液和 40 µL 的 1 M BDM 溶液。用移液器吹打混匀，然后将试管转移至 38 °C 金属浴中，以维持 LMP 琼脂糖的液态状态。
  4. 在盛有胚胎培养基的培养皿中，于体视显微镜下使用镊子小心去除预先选定的胚胎的卵膜，注意避免损伤胚胎。
  5. 将去膜后的胚胎转移至另一含有 2 mL 封片介质的培养皿中。
    1. 当胚胎心脏停止跳动（约需 5–10 分钟）后，用镊子将胚胎转移至封片皿中，并将其摆放于孔内，使胚胎呈 25 度角倾斜，尾部朝向孔的较深端，卵黄囊朝上。
    2. 当胚胎大致定位后，吸除封片介质，将胚胎包埋于约 200 µL 含三卡因和 BDM 的 0.7% LMP 琼脂糖中，并根据需要调整胚胎位置，向左或向右倾斜以达到理想角度。
  6. 等待 LMP 琼脂糖凝固（约需 5 分钟），然后向皿中加入封片介质。此时胚胎已准备好进行光转化。
    注：三卡因用于麻醉胚胎，BDM 用于停止胚胎心脏跳动。封片介质可于成像前一天配制，但需注意避光保存。
    注：正确摆放胚胎位置至关重要，以确保激光能够清晰地照射到目标细胞。应将胚胎头部置于孔的起始端附近，使激光路径尽可能短，同时便于光转化后取出胚胎。

4. 光转化

  1. 在配备405 nm、488 nm和561 nm激光源的直立共聚焦显微镜（如Leica SP8）上，使用透射白光（明场）和物镜（如Leica HCX IRAPO L，25×，数值孔径0.95）定位胚胎心脏。使用561 nm激光检测红色Kaede荧光即，DPSS 561 激光，强度约 5%，检测器设置为 589–728 nm）。然后使用 488 nm 激光观察心内膜即，30 mW多线氩离子激光器，强度约为5%，检测器设置为502-556 nm。
  2. 进入 "荧光漂白恢复" 在显微镜采集软件中选择相应模式。488 nm 和 561 nm 激光器的激光功率均设置为约 1%。
  3. 聚焦于目标层面，选取一个感兴趣区域（ROI），然后使用405 nm激光二极管（激光功率25%）对ROI扫描三次以实现细胞的光转化。若ROI内Kaede光转化不充分，可再次用405 nm激光对该区域重复扫描三次。对所有ROI重复此步骤。
  4. 返回到 "TCS SP8" 在软件中设置为z轴层扫模式，依次使用561 nm和488 nm激光获取z-stack图像。务必选择“双向”选项以提高成像速度。
    注意：每个胚胎的光转化和成像所需时间各不相同。已知心跳对正常心脏瓣膜发育至关重要，因此应避免心脏停止跳动超过30分钟，即使这意味着您可能没有足够时间完成全部5个胚胎的光转化。
    注意：在光转换过程中，请使用PMT检测器；光转换完成后，建议使用设定为“计数”模式的混合检测器。这是因为混合检测器灵敏度更高，能够获得更高质量的图像，但容易因过度曝光而受损。

5. 卸载光转换胚胎

  1. 光转化后，使用玻璃移液管轻轻按压胚胎头部上方，以打破LMP琼脂糖，然后轻柔地吸取胚胎。
    1. 将胚胎从玻璃移液管中排出至含有含PTU胚胎培养基的35 mm培养皿中（以洗去含BDM的培养基）。
    2. 将胚胎转移至6孔板的某一孔中，孔内含有含PTU的胚胎培养基。在此步骤中，务必记录每个胚胎放入的具体孔位，因为这对于后续发育阶段中光转化细胞位置的对应关系至关重要。
  2. 现在胚胎已从含BDM的培养基中移出，其心脏应在约5分钟后开始重新跳动。将胚胎放回28.5 °C避光环境中，使其继续正常发育。

6. 在胚胎发育后期成像光转化细胞

  1. 在目标发育阶段，停止心脏跳动，并将胚胎重新包埋，操作步骤与本方案第3步相同，但重要区别在于必须将胚胎置于单独标记的培养皿中，并用BDM处理，以便追踪各个胚胎。
  2. 对于62 hpf以内的胚胎，使用561 nm和488 nm激光分别采集心内膜的红色和绿色荧光信号的z轴层扫图像。对于62 hpf以上的胚胎，则使用设置为940 nm的多光子激光器成像绿色Kaede，而非使用488 nm激光。

7. 48 hpf 以下胚胎的图像分析

注意：由于房室管（AVC）具有复杂的三维结构，其组织运动可能难以分析。为了量化房室管中两个非光转化区域之间光转化区域的长度，或两个光转化区域之间非光转化区域的长度，可将三维结构投射到二维图谱上进行分析。可在48 hpf之前获取光转化胚胎图像，并使用以下方法进行分析。

  1. 将采集的图像导入 MATLAB 或任何类似软件中。
  2. 手动划定感兴趣区域（ROI）， 即 心内膜，并应用掩模以去除该区域外的信号。
  3. 对图像应用强度阈值，以识别心内膜上的点，并将其在三维空间中绘制出来。使用软件中的擦除命令，手动删除心房和心室上无关的点，从而分离出房室管（AVC）最狭窄且最笔直部分对应的点。
  4. 使用圆柱体拟合由此获得的代表AVC的点。
  5. 定义一个参考系以比较多个样本。例如，采用房室管（AVC）点的质心作为参考系的原点，并将拟合圆柱体的轴线作为 z 轴。
    1. 确保正的 z 坐标始终对应心脏的同一侧（心室侧或心房侧）。
    2. 将房室连接点投影到 x-y 平面，并用椭圆对其进行拟合。
    3. 将心内膜点绕 z 轴旋转，使椭圆的长轴与参考系的 y 轴平行，且 y 值为正的一侧对应于胚胎视角下房室管（AVC）的内侧。
  6. 为了分割房室管（AVC），需通过旋转半平面 {y=0, x<0} 所获得的若干平面来切割三维数据集。>z 方向上的 0。
    1. 将邻近像素的强度投影到这些平面上，并以一致的方式定义内皮层。例如，在房室管（AVC）处从心房侧到心室侧沿内皮层厚度的一半位置手动绘制一条线。
    2. 使用样条工具箱，通过三维样条插值代表内皮的线条上的点，以曲面形式表示房室管（AVC）。
      注意：切割平面的数量既决定了分割的准确性，也影响此步骤的时间消耗。通常情况下，8 个平面足以获得良好的结果。
  7. 使用柱面坐标系定义AVC表面每个点的方位角位置。
    1. 在每个方位角位置，通过计算连续点之间在AVC表面的弧长，沿AVC表面定义一条参数曲线。
    2. 对于每条参数曲线，将曲线上距离主动脉瓣环中心最近的点定义为零点。因此，主动脉瓣环上的各点可由其方位角位置及在参数曲线上的位置完全描述。
  8. 利用点的参数位置将房室瓣（AVC）展开为二维图像。
  9. 通过二值化处理光转换通道与非光转换通道的强度比值图像，确定待量化区域的边缘。如有必要，手动校正结果。
  10. 计算边缘之间的弧长，以确定组织长度随方位位置的变化函数。

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结果

在48 hpf时进行光转化并在80 hpf时再次成像的胚胎示例见图2、视频1和2。将Kaede暴露于405 nm光下可使其蛋白不可逆地从绿色荧光形式转化为红色荧光形式，从而能够追踪被标记为绿色或红色的细胞在其不同颜色邻近细胞中的行为，以研究瓣膜形成过程。可以看出，在48 hpf时房室管（AVC）中少数被光转化的细胞随后发生增殖，并主要位于瓣叶的一侧。

在心房和心室中对内皮细胞进行光转化后，应用所述图像分析方法在36小时受精后胚胎中可获得的结果示例如图3所示。对房室管（AVC）的分割可实现其三维结构的参数化，随后将其投影为二维图像以便于可视化和分析。该方法可用于量化两个光转化区域之间的距离。通过在不同发育时间点重复此过程，可研究细胞向房室管迁移的情况（Boselli <...

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讨论

光转化时机：尽管在96 hpf时Kaede在EdC中仍能强烈表达，但需注意的是，随着胚胎的发育，激光在到达房室管（AVC）之前会发生更明显的散射，使得Kaede的局限性光转化变得更加困难。在55 hpf之后的胚胎阶段，心室和心房的扩张意味着用于光转化的紫光激光束在到达AVC细胞之前，必须先穿过心房或心室。因此，在55 hpf之后，若要对AVC中的EdC进行光转化，也必然同时对心房和心室中的其他EdC进行光转化。

BDM 与 tricaine：准确的 EdCs 光转化需要暂时停止心脏跳动。BDM（2,3-丁二酮单肟）是一种电-收缩去耦联剂，已知可有效抑制心肌收缩12。我们未观察到经过该处理方案的胚胎与正常生长且未为成像而停止心跳的胚胎在形态学上存在差异。然而，药物处理可能影响正常发育的风险仍然存在13。高浓度的 tricaine 也可用于暂时停止心脏跳动14。我们发现，将胚胎置于含有 0.32% trica...

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致谢

我们感谢Anne-Laure Duchemin、Denise Duchemin、Nathalie Faggianelli和Basile Gurchenkov在设计和制作本方案所述模具过程中提供的帮助。本工作得到了法国医学研究基金会（FRM，项目号DEQ20140329553）、法国国家科研署（ANR，项目号ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01）、欧洲分子生物学组织青年研究员计划（EMBO Young Investigator Program）、欧洲共同体、欧洲研究理事会巩固基金（ERC CoG N°682938 Evalve）以及法国国家科研署“未来投资计划”框架下的资助项目ANR-10-LABX-0030-INRT（项目标识号ANR-10-IDEX-0002-02）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
饲养鱼类和收集鱼卵所需的设备（详见《斑马鱼手册》22）。
体视显微镜
直立式共聚焦显微镜（配备488 nm、561 nm和405 nm激光器，可调谐多光子激光器，以及Leica HCX IRAPO L，25 ×，N.A. 0.95物镜）LeicaLeica SP8
加热金属块ThermoScientific88870001
35 mm × 10 mm 组织培养皿Falcon353001
6孔板Falcon353046
培养皿
镊子
玻璃移液管
模具
试剂
8 mg/mL 三卡因储备液 
1 M BDM 储备液
UltraPure 低熔点琼脂糖Invitrogen16520-050
琼脂糖Lonza50004
PTU（1-苯基-2-硫脲）Sigma AldrichP7629
胚胎培养基：30x 储备液
软件
配备图像分析、曲线拟合和Bio-Formats工具箱的MatlabMathWorks
8 mg/mL 三卡因储备液
200 mg 三卡因粉末（甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸）Sigma-AldrichE10521
25 mL Danieau溶液
调pH至7，分装后于-20 °C 保存
1 M BDM 储备液
1 g BDMSigma-Aldrich112135
10 mL ddH2O
分装后于-20 °C保存
胚胎培养基：30x 储备液
50.7 g NaClSigma-Aldrich7647-14-5
0.78 g KClSigma-Aldrich7447-40-7
1.47 g 硫酸镁Sigma-Aldrich 7487-88-9
2.1 g 四水合硝酸钙Sigma-Aldrich13477-34-4
19.52 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）Sigma-Aldrich7365-45-9
调pH至7.2，室温保存
模具
PlasCLEAR 树脂Asiga
Plus 39 Freeform Pico 3D打印机Asiga

参考文献

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