方法文章

用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物

DOI：

10.3791/57295

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2018年3月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用 pBIBAC 的二进制向量, 可以生成具有完整单拷贝插入的转基因植物, 这是一个简单的过程。在这里, 提出了一系列的协议, 指导读者通过生成转基因拟南芥植物的过程, 并测试植物的完整性和复制数量的插入。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生成转基因植物时, 一般的目的是要有稳定的转基因表达。这需要一个单一的, 完整的整合的转基因, 因为多拷贝集成往往受到基因沉默。与其他 pBIBAC 衍生物一样, 基于细菌人工染色体 (pBIBAC) 的网关兼容二进制向量允许单拷贝转基因的高效插入。作为对原 pBIBAC 的改进, 一个网关盒已被克隆成 pBIBAC, 因此, 现在的兴趣序列可以很容易地纳入矢量转移 dna (T DNA) 的网关克隆。通常情况下, 与 pBIBAC 的转换结果是0.2–0.5% 的效率, 即转基因的一半携带完整的单拷贝集成的 T DNA。pBIBAC 的载体是可利用的抗膦铵或 DsRed 荧光的种子大衣, 以选择在植物, 和抗卡那霉素作为选择的细菌。在这里, 提出了一系列的协议, 引导读者通过使用 pBIBAC 生成转基因植物的过程: 从将兴趣序列重新结合到 pBIBAC 的选择向量, 到植物转化与农杆菌, 选择转基因, 并测试植物的完整性和复制数量的插入使用 DNA 印迹。注意设计一种 DNA 印迹策略, 以识别单个和多个位点的单拷贝和多复制集成。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生成转基因植物时, 通常的目的是使综合转基因 (s) 稳定表达。这可以通过转基因的完整的单拷贝集成来实现。多重整合可以导致基因表达的增加, 同时也会使转基因沉默。如果插入的序列排列在串联或反转重复的1、2、3、4中,则更有可能转基因沉默。在农杆菌介导的转化实验中, 二进制向量被用作航天飞机, 将感兴趣的序列传递到植物基因组中。集成到植物基因组的数量依赖于农杆菌5、6中二进制向量的拷贝号.许多常用的二进制向量都是高拷贝向量, 因此产生高平均的转基因拷贝数:拟南芥5中的3.3 到4.9 个拷贝。

通过使用.BIBAC 中具有低拷贝数的二进制向量 (如7) 或从a. 农杆菌染色体5启动 t dna, 可以降低 t dna 积分的数量。在这种情况下, 转基因集成的平均数量低于 25,8,9,10。由于在A. 农杆菌和大肠杆菌中都是单拷贝, BIBAC 衍生物可以维护和交付 150 kb11大的构造。

与 GW 兼容的 BIBAC 矢量10,12允许使用网关克隆轻松地将感兴趣的基因引入到向量中。网关技术的使用大大简化了克隆过程, 也克服了与大型低拷贝数向量13、14相关的常见问题, 如低 DNA 产量和有限的独特限制选择。可用于克隆7、11的站点。在植物 (图 1)10,12中, pBIBAC 的衍生物可在种子大衣 (pBIBAC-RFP) 中对膦铵 (pBIBAC 棒) 或 DsRed 荧光进行抗性。对于这两种载体, 卡那霉素抗性基因被用作细菌的选择标记。

pBIBAC 的向量结合: (1) 易于设计和遗传操作在大肠杆菌和 (2) 完整的单拷贝集成在 planta高效率。在拟南芥中, pBIBAC 的向量平均1.7 积分, 其中大约一半的转基因植株携带着单个集成的 T 型 DNA10。

转基因的稳定表达是大多数转基因产生的必要条件。稳定的转基因表达可以通过完整的单拷贝集成实现。然而, 与转基因植物进行完整的, 单拷贝集成是更重要的, 如果例如, 目的是研究的效率, 染色质的过程, 如诱变, 重组, 或修复, 并依赖这些在插入部位的基因组位置和染色质结构的过程。为了我们的兴趣, 研究寡核苷酸定向诱变 (ODM) 对局部基因组上下文的依赖性, 生成了一组完整的、单拷贝的突变报告基因集成的报告 (图 2)10。使用这组线, 结果表明, 在不同基因组位置集成的转基因基因座的 ODM 效率不同, 尽管转基因表达水平相当相似。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 将感兴趣的序列插入二进制向量中

  1. 准备网关条目和二进制向量。
    1. 根据供应商的建议, 将包含 DNA 片段或感兴趣基因的网关入口向量隔离。
      注: BIBAC-GW 载体需要使用卡那霉素 (公里) 来选择细菌, 因此, 使用一个输入向量与另一种抵抗标记而不是卡那霉素。例如, 携带庆大霉素抗性基因的 pENTR 转基因载体是一个很好的选择12。
    2. 传播和隔离 BIBAC 的兴趣向量。使用对在网关盒中存在的ccdB基因的毒性具有抗药性的大肠杆菌菌株。根据供应商的建议, 使用专门为大型质粒设计的协议或套件隔离 BIBAC 矢量。
  2. 进行网关反应。
    1. 根据供应商的建议, 准备 LR 重组反应。在室温下 (RT) 将以下组件混合在1.5 毫升离心管中: 100–300的进入克隆 (超螺旋), 300 的 BIBAC-GW 向量, LR Clonase 反应缓冲器 (最终浓度: 1x)。将混合物的体积调整到16µL (10 毫米三, EDTA 1 毫米, pH 8.0)。最后, 添加4µL 的 LR Clonase 酶混合, 并混合涡流。将混合物在25摄氏度孵育1小时。
    2. 在步骤1.2.1 中加入2µL 蛋白酶 K 溶液 (2 µg/µL), 终止 LR 反应。混合和孵化在37°c 10 分钟。
  3. 用电穿孔法将大肠杆菌转化为网关反应混合物。
    1. 在电穿孔前淡化 LR 反应混合物。
      注意: 这一步对成功的电穿孔至关重要。在透析方法下面描述, 但其他方法例如沉淀与乙酸钠和乙醇也可以使用。
      1. 为 LR 反应的滤过透析准备设置。将20毫升超纯去离子水倒入无菌培养皿中。将膜过滤盘 (孔径 = 0.025 µm) 放在水面上。
      2. 把整个 LR 反应小心地放在膜的顶端, 让混合物在 RT 中透析1小时。
    2. 在电穿孔试管 (0.1 厘米) 中添加5µL 的淡化 LR 混合到电子主管 DH10B 细胞。Electroporate 细胞 (1.5 伏/厘米, 电阻200Ω, 电容25µF), 并立即添加1毫升预预热的超级最佳阻遏压制 (SOC) 培养基到细胞, 其次是孵化在37°c 45 分钟, 180 rpm。(SOC 培养基, 1 升:20 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 0.5 克氯化钠, 2.5 毫升1M 氯化钾, 20 毫升的1米过滤-灭菌葡萄糖)。
      注: DH10B 细胞可替代其他稳定维持大粒质的大肠杆菌细胞。
      注: 最佳电穿孔条件取决于所使用的电穿孔装置。
    3. 颗粒细菌以最大速度在三十年代使用离心, 去除过剩的 SOC, 并且并用重悬颗粒在大约50-100 µL Luria Bertani (磅) 媒介。将细菌传播到卡那霉素磅 (公里磅) 板上 (公里浓度, 40 µg/毫升), 并在37摄氏度一夜之间孵化盘子。(LB 中, 1 升:10 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母萃取物, 10 克氯化钠。固体培养基添加琼脂, 15 克/升)。
  4. 鉴定重组 BIBAC-GW 衍生物, 分离质粒 DNA。
    1. 为了能够在千米磅的板块上生长,大肠杆菌细胞应包含重组 BIBAC-GW 质粒, 其中ccdB序列被所需的插入物取代。使用菌落聚合酶链反应 (PCR)15检查板上的细菌菌落是否含有正确的质粒, 具有 BIBAC 的主干和插入的兴趣。
      1. 要识别 pBIBAC-GW 骨干, 请执行 PCR15反应与引物 DM1969 5 '-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 ' 和 DM1970 5 '-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3 '。本底漆集放大了bar基因的 563 bp 片段。
      2. 要检查 BIBAC 的存在, 请执行 PCR15反应, 使用底漆 M737 5 '-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 ' 和 M892 5 '-AACAGATGGTGGCGTCCC-3 '。该底漆组合放大了一个 791 bp 片段重叠的 cruciferin 助剂和rfp序列。
      3. 使用特定于基因的引物进行 PCR15反应, 检查是否存在插入的兴趣。
    2. 在含有卡那霉素 (40 µg/毫升) 的 LB 培养基中接种一个阳性菌落, 用于 DNA 隔离16. 2–5毫升。在180转一夜的轨道振动筛上孵育37摄氏度。
    3. 分离质粒 DNA (见步骤 1.1.2)。

2. 制备A. 农杆菌用于对拟南芥进行花浸

  1. 将 BIBAC-GW 衍生物转换为. 农杆菌。
    1. 制备A. 农杆菌应变 C58C1 的电子主管细胞, 携带 pCH32 辅助质粒7。在四环素 (5 µg/毫升) 和利福平 (100 µg/毫升) 的存在下生长细菌, 以选择 pCH32, 并确保只生长农杆菌细胞。
    2. 添加0.25–0.5 µg DNA 的 pBIBAC-GW 衍生物, 预溶解在10–20µL 不育超纯去离子水, 20 µL 合格的农杆菌细胞电穿孔小试管 (0.1 厘米)。把细胞放在冰上。
    3. Electroporate 细胞 (1.5 伏/厘米, 电阻400Ω, 电容25µF)。电穿孔后立即加入1毫升预热 (28 °c) SOC 培养基到细菌和孵化细胞在28°c 为60–90分钟。
    4. 在含有利福平 (100 µg/毫升)、四环素 (5 µg/毫升) 和卡那霉素 (40 µg/毫升) 的单独 LB 板上传播100µL 和其余的细菌, 并在黑暗中孵育28天。
  2. 准备农杆菌挂起。
    1. 在步骤2.1.4 中准备的板块中, 通过 PCR 方法检查一对a. 农杆菌菌落, 以了解正确的向量 (参见步骤 1.4.1)。
    2. 条纹一个单一的殖民地确认包含的二进制向量与适当的插入一个 LB 板含有抗生素 (见步骤 2.1.4)。在28摄氏度的一夜之间生长。
    3. 重复在步骤2.2.2 中获得的单一菌落的裸奔。
    4. 在2.5 毫升的 LC 培养基中接种单一菌落, 辅以抗生素 (见步骤 2.1.4) preculture。孵育在28°c 至少8小时或隔夜, 在180转每分钟。(LC 培养基, 1 升:10 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 0.5 克氯化钠, 2.5 克 MgSO 4 · 7H 2 O, 2 克麦芽糖).
    5. 从步骤2.2.4 添加 preculture。对250毫升 LC 补充抗生素 (见步骤 2.1.4) 和增长28摄氏度, 在 180 rpm, 一夜之间。
    6. 在 5500 x g 处旋转12分钟, 将该颗粒重新悬浮在100毫升溶液中, 其中含有5% 蔗糖、0.05% Silwet L-77、0.5x MS. 将悬浮液倒入无菌容器中, 用于植物的花浸。

3. 拟南芥转化

  1. 准备用于转换的拟南芥植物。
    1. 在温室或气候控制的生长室中种植拟南芥植物, 直到它们开花 (每浸12盆9株)。
    2. 夹住第一个螺栓, 以允许更多的二次螺栓出现。植物准备浸泡第4-6 天后修剪, 当植物有许多未成熟的花头, 而不是许多受精角果。
  2. 花浸
    1. 在步骤2.2.6 中制备的农杆菌悬浮液中5–10的浸出花序。使用温和的鼓动。
    2. 将植物的上述部位包裹在保鲜膜中, 以保持湿度高, 并用盒子盖住花盆, 使植物在黑暗中保持。在温室/生长室中孵化植物2天。
    3. 取出盒和保鲜膜, 在温室/生长室中种植植株成熟。
      注: 为了提高转化效率, 同一株植物可以在第一次浸渍后7天重新浸渍。
    4. 收割种子。池和分析植物的种子 (T1), 转化为相同的结构, 作为一个单一的集合。
  3. 用于转基因植物的筛网。
    1. 用荧光显微镜对 pBIBAC 的转基因植物进行筛选, 分析其种子。为了检测 DsRed 在种子大衣中的表达, 图像的种子在 560 nm 的激发和600–650纳米的排放。用镊子将荧光种子与非荧光的对应物分开。
    2. 要筛选与 pBIBAC 的转基因植物, 在填充土壤的托盘中播种种子 (~ 2500 种子/0.1 米2)。为了确保均匀地在托盘上传播种子, 在 0.5x Murashige Skoog 培养基 (MS) 中悬浮种子, 用1毫升吸管将种子传播。
      注: 为了刺激种子以同步方式发芽, 种子孵化至少2天, 在4摄氏度。这可以在播种种子之前或之后完成。
      1. 在托盘中播种后, 用0.5% 膦铵溶液喷洒2周3周的幼苗。每1米2使用500毫升的膦铵溶液。
      2. 将幸存的幼苗转移到各个花盆。在图 3中显示了在 (第二) 膦-铵处理前后有幼苗的托盘的典型图像。
      3. 用 PCR 方法分析膦铵耐氨植物的结构 (见步骤 1.4.1. 用于底漆)。
        1. 使用爱德华兹et . 描述的方法分离基因组植物 DNA 进行 PCR。17

4. 转基因对 T 型 DNA 积分的数量和完整性的表征

  1. 限制消解策略
    注: 使用限制酶测定 dna 印迹, 确定 T dna 积分的数量及其完整性。这种方法允许在基因组的相同或不同的基因座上识别单个的, 也可以重复的集成。
    1. 使用一系列限制消解来确定可能的不同集成模式:
      1. 选择在 T DNA 中间切割一次的酶, 以便能够独立地探测限制站点上游和下游的序列 (图 4A和图 7 a-c)。请参见图 4A和预期结果和解释的图形图例。
      2. 选择一种酶或酶组合, 一次切割出整个兴趣序列 (图 4B和图 7A-d)。从已知长度的任何偏差表示集成磁带的截断。
        注意: 要注意只使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制酶。
  2. 准备基因组 DNA 样本。
    1. 将基因组 DNA 从携带有兴趣结构的植物中分离出来。CTAB dna miniprep 方法可用于 dna 隔离18。对于拟南芥dna 的 dna 印迹分析, 需要2–2.5 µg 基因组 dna。在50µL 中溶解 DNA。
    2. 通过凝胶电泳检查 DNA 完整性16。完整的基因组 DNA 作为一个离散带在凝胶的顶端迁移。DNA 降解可以被识别为存在涂片。为了避免重复冻融造成的 dna 损伤, 基因组 DNA 样本保持在4摄氏度。
    3. 利用酶供应商建议的缓冲条件, 在一夜之间以50µL 的总容积 (2–2.5 µg) 消化基因组 dna (如拟南芥基因组 dna)。
      1. 在试管中, 混合2–2.5 µg 的拟南芥基因组 DNA, 5 µL 10x 限制缓冲器, 5 U 限制酶在总共50µL 超纯去离子水。
    4. 将负载染料 (1x 最终浓度) 添加到限制样品上, 然后再在凝胶上加载。要进行良好的视觉跟踪, 请使用下列方法之一: comigrating 与小片段 (溴酚蓝色、350–400 bp) 或 comigrating 与更大的片断 (Cylene 蓝, 3–4 kbp)。
  3. 运行 DNA 凝胶。
    1. 准备长 (20 厘米) 0.5x 琼脂糖凝胶19。凝胶中琼脂糖的百分比取决于所需的碎片大小。0.8–1% 最佳地将碎片 > 1 kb 的大小分开。使用1–1.5% 琼脂糖的片段 < 1 kb。不要在凝胶中加入溴溴化物。(5x, 1 升: Trizma 基54克, 硼酸27.5 克, EDTA 3.75 克)。
      注: 为了防止 dna 污染, 使用不用于分级质粒和 PCR 扩增 dna 的凝胶托盘。
    2. 在凝胶19上加载示例。
    3. 将 DNA 标记添加到所需碎片大小范围内的凝胶中。在凝胶上加载大约1µg (50-250 ng 不同大小的碎片), 以允许紫外线照射。
    4. 大小-分级的 DNA 在一个低电压 (40–50 V/500 mA) 过夜。
  4. 准备从琼脂糖凝胶到尼龙膜的 DNA 转移。
    1. 将凝胶转移到一个单独的托盘, 并在0.5x 的溴溴 (5 µg/毫升), 通过旋转在一个轨道振动筛 40 rpm 的20–25分钟染色。
    2. 在 UV transilluminator 上可视化凝胶。验证基因组 DNA 的大小分离, 包括离散卫星波段的可见性 (图 5A)。对低分子量大小的涂片表明 DNA 降解。
    3. 在 UV transilluminator 上, 在凝胶上放置透明, 并用标记笔 (图 5B) 标记插槽和标记带的位置。这将有助于确定杂交片段的大小以后, 如果标记序列不杂交专门与探针 DNA。通过在此步骤中指示标记片段, 可以跟踪杂交片段的大小。
    4. 将凝胶放回托盘中, 用超纯去离子水冲洗, 并将其浸入0.25 米 HCl 中以15分钟 fragmentize 在凝胶内的 DNA。用超纯去离子水冲洗。使用足够的 HCl 和水覆盖在托盘中的凝胶, 并旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。
    5. 在变性缓冲器中孵育凝胶30分钟, 用超纯去离子水冲洗。使用足够的缓冲和水来覆盖在托盘中的凝胶, 并旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。(变性缓冲器: 0.5 米氢氧化钠, 1.5 米氯化钠)。
    6. 将凝胶在中和缓冲器中孵育30分钟, 用超纯去离子水冲洗。使用足够的缓冲和水来覆盖在托盘中的凝胶, 旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。(中和缓冲: 0.5 米三, 1.5 米氯化钠, 220 毫米 HCl, pH 值 7.6)。
  5. 将 DNA 转移到尼龙膜上。
    1. 准备基因组 DNA 毛细转移的设置。将塑料板 (大约是凝胶的大小或更大的) 放在装有20x 盐水钠 (SSC) 的托盘上。在托盘上折叠一张厚的滤纸, 使其两端都挂在 SSC 中。切下一个凝胶尺寸为正电荷的尼龙膜 Hybond N +, 2 块厚的滤纸。(20x SSC: 3 米氯化钠, 0.3 米柠檬酸钠)。
    2. 通过将胶凝剂、插槽放在塑料板上的滤纸顶部, 准备印迹设置 (图 6)。将 Hybond N + 膜放在上面, 接着是2层滤纸。在将其添加到组件之前, 在 20x SSC 中预湿每一层。确保删除层间的任何气泡, 因为这会阻碍 DNA 的转移。
    3. 用一层厚的纸巾盖住组件。在上面放一个有重量的塑料盘子, 比如一个小瓶子。确保压力在凝胶上同样有分歧。这将确保 DNA 的正确转移。
      注: 重量应约 200–300xg g;重的重量会阻碍 DNA 的转移。
    4. 用保鲜膜 (图 6) 覆盖组件周围的区域, 包括暴露的过滤纸, 以避免 20x SSC 缓冲器的蒸发, 并将毛细管力对准尼龙膜。污点过夜。
    5. 用铅笔将插槽、名称和/或日期的位置标记在膜上, 然后从组件中取出膜。请注意, 在与凝胶接触的底部, 携带 DNA。
    6. 使用 uv 交联剂立即将 DNA 固定到膜上, 紫外线照射 (2400 µJ/米2)。
      注: 交联条件取决于所用膜的类型。
      注: 在这一点上, 膜可以储存在-20 摄氏度, 并用于杂交与探针后。在 2x SSC 中冲洗交联膜, 并将其密封在预折叠的热密封聚乙烯管材上, 然后放入-20 摄氏度。
  6. 准备杂交探针。
    1. 放大序列, 用作探针的 DNA 印迹 PCR20。50-100 ng 250 bp-2 kbp PCR 片段用作探针。两个单独的探针, 一个杂交到右边界近端区域, 另一个与 t dna 的左边界近区, 可用于评估整个 t dna 的存在 (图 4A和图 7)。
    2. 在试管中, 在24µL 超纯去离子水中稀释50-100 的 PCR 产物。
    3. 变性稀释后的 PCR 产物, 在水或热块的烧杯中煮沸5分钟, 然后直接在冰上冷却。
    4. 解冻预制 GCT-混合在冰上。(GCT 混合: dGTP, dCTP, dTTP (全部0.5 毫米), 随机 hexamers 43.2 ng/µL, 乙酰 BSA 1.33 毫克/毫升, 33 毫米β巯基乙醇, 0.67 米 Hepes, 0.17 毫米三 pH 6.8, 17 毫米氯化镁)。
    5. 添加21µL 的 GCT 混合和 2 U 克莱诺片段的 PCR 产品。
    6. 将 [32P] ATP 的2µL 添加到混合中, 并在37°c 处孵育1小时。
      警告: 涉及 [32P] ATP 的所有步骤都需要在使用适当保护的情况下指定的放射性工作环境中进行。
      注意: 确保 [32P] ATP 是新鲜的 (超过1的半时间已过)。
    7. 准备一个葡 G-50 (粗或中) 列21 , 用于从未注册的 (放射性) 核苷酸中纯化标记探针。取2毫升注射器, 用一小圈厚的滤纸盖住出口。加入2毫升的葡 G-50 溶解在 TE 进入注射器, 并清除所有的液体从该柱旋转。
    8. 把柱子放进15毫升的塑料管里, 在柱上装上标记探针, 在室温下旋转 (将离心机设置为 750 x g, 允许 rpm 增加到 750 x g 达到, 然后停止离心机并允许旋转下降到 0 x g) 洗脱探头。在柱上加200µL, 旋转洗脱剩余探头;重复一次。在这些条件下, 标记的 DNA 片段被排除在葡矩阵和洗脱, 而游离核苷酸留在柱中。
    9. 使用300µL 的标记探针每杂交管。将剩余标记的探头保持在-20 摄氏度, 以供以后使用。但是, 请记住 [32P] ATP 的半时间。
  7. 杂交 DNA 印迹。
    1. 热 2x SSC 和杂交缓冲 (每杂交管15毫升, 最大2个污点每管) 到65°c。(杂交缓冲: 10% 葡聚糖硫酸盐, 1% SDS, 1 米氯化钠, 50 毫米三 pH 7.5, 溶解在65°c, 保持整除数在-20 °c)。
    2. 预热的杂交烤箱到65摄氏度。
    3. 将尼龙网放在托盘上, 用少许加热 (65 °c) 2x SSC 覆盖托盘。将 dna 印迹放在网格的顶端, dna 端起来。将印迹与网格一起滚动, 并将该卷插入到杂交管中。倒入多余的 2x SSC。
    4. 在离心管中, 每杂交管煮沸150µL 的鲑鱼精子 DNA (浓度10毫克/毫升) 5 分钟 (请参见步骤 4.6.3)。冰上立即冷却, 加入预加热的杂交缓冲。
    5. 加入杂交缓冲-鲑鱼精子溶液的管与印迹。前杂交在65°c 至少1小时在一个转动的轮子, 在12转每分钟。
    6. 当预孵化阶段4.7.5。几乎完成, 煮沸300µL 的标记探针5分钟 (参见步 4.6.3) 并且立刻增加对污点在孵化以后。
    7. 杂交隔夜在转动的轮子在63°c, 12 转每分钟。不要直接用吸管把探针上的印迹, 而是进入杂交缓冲-鲑鱼精子溶液。
  8. 洗净污点。
    1. 预热洗涤液 (1x SSPE, 0.1% sds 和 0.1x SSPE, 0.1% SDS) 到65°c。(20x SSPE: 3 米氯化钠, 230 毫米 NaH2PO4, 20 毫米 EDTA, pH 7.0)。
    2. 处理杂交溶液, 并添加约100–150毫升的 1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的杂交管, 关闭管, 并轮流旋转。在适当的液体放射性废料中倒入杂交和洗涤液。
    3. 添加约100–150毫升 1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的管, 关闭, 并孵化管15分钟63°c 在旋转轮, 12 rpm。适当丢弃洗涤液。
    4. 添加约100–150毫升 0.1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的杂交管, 关闭, 并旋转管5分钟63摄氏度, 12 rpm。适当丢弃洗涤液。
    5. 把污点从管中取出, 放在装有足够预热的 0.1x SSPE、0.1% SDS 的托盘中, 在65摄氏度的震动水浴中晃动3分钟。同时, 在装满水的托盘中冲洗网格。
    6. 把污点取出, 放在预折叠的塑料 (聚乙烯油管) 之间, 仔细擦拭多余的液体, 并让污点干燥。注意, 液体会破坏 phosphorimager 屏幕。
    7. 在三边上用塑料封住污点。清除所有多余的液体周围的污点, 并关闭塑料管密封第四方。切断塑料的过剩。确保密封的污点没有泄漏, 塑料在外面是干的。
  9. 公开 phosphorimager 屏幕。
    1. 将密封的印迹放在 phosphorimager 盒中, phosphorimager 屏幕面对印迹的 DNA 侧。关闭盒式磁带并离开2–4天, 这取决于放射性标签的强度和 phosphorimager 的灵敏度。
    2. 使用 phosphorimager 扫描 phosphorimager 屏幕。注意在扫描前尽可能少地暴露屏幕的光线。保存图像。将屏幕从信号中抹去, 将其暴露在明亮的光线下。
  10. 分析污点。
    1. 分析取决于步骤4.1 中使用的限制策略。在分析根据步骤4.1.1.1 中显示的策略准备的污点 (图 4A) 时, 计算检测到的片段数。在这个策略中, 杂交片段的数量是指 T DNA 积分的数量。
      1. 将检测到的片段数与左侧的探测器 (图 7B) 和 T DNA 的右侧 (图 7C) 部分进行比较。
        注: 如果检测到不同数量的杂交片段, 那么无论是 i) 多个 t DNA 拷贝 (无论是在倒置或直接方向) 或 ii) 不完全集成的 t 型脱氧核糖核酸存在。
      2. 根据标记带的大小估计杂交碎片在印迹上的大小, 并根据串联插入 (图 4A) 的限制策略, 比较混合片段的大小和预期的碎片大小, 以确定可能的串联排列的 T 型 dna。使用图 4A作为计算预期片段大小的指南。
        注: 如果混合碎片的大小与计算结果不一致, 则最有可能存在的集成不完整。
    2. 在分析根据步骤 4.1.1.2 (图 4B) 中显示的策略准备的污点时, 根据标记带的大小估计印迹上杂交片段的大小, 并将其与预期大小进行比较。完整的插入生成一个具有定义长度的单个片段。预期长度的任何偏差都表示不完整的集成 (图 7D)。
  11. 剥去再杂交的印迹 (可选)。
    注意: 相同的印迹可以与不同的探针连续杂交。在继续新探针之前, 从印迹中剥离先前的杂交探针。
    1. 要从印迹中取出探针, 将印迹放在托盘上, 其 DNA 侧朝下。将多余的 0.5% SDS 倒入托盘中。将膜煮沸2–5分钟。治疗的持续时间取决于所用探针的大小和 GC 含量。更长和 GC 更丰富的探针需要更长的治疗。
    2. 剥离后, 杂交与另一探头, 或密封和存储在摄氏-20 摄氏度。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用 BIBAC 系统, 生成了用于研究植物 ODM 的记者构造10。构造是在网关条目向量 pENTR-gm12中设计的, 并使用网关 LR 复合反应插入 pBIBAC BAR (图 1)。

拟南芥是与 pDM19, 一个 BIBAC-GW 质粒与 mTurquoise eYFP 的记者, 携带一个平移停止密码子在 eYFP 阅读框架的位置 120 (mTurquoise2-eYFP*40) (图 2)10。总共有126个拟南芥植物被改造 (每壶9株, 14 盆)。这些植物的种子被汇集, 播种在托盘与土壤, 并允许生长两个星期之前, 膦铵溶液处理。只有表示bar

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对产生转基因的关键是单一的, 完整的整合的转基因是使用二进制向量的选择。BIBAC 家族载体已被用来交付许多植物物种的利益序列23,24,25,26,27,28。BIBAC 向量, 包括 BIBAC, 具有高效率的单拷贝集成: 每行插入的平均数量是1.5 到 2, 而最常用的二进制向量5,9,29. 与其他 BIBAC 向量相比, 与 BIBAC 的向量比较起来, 兴趣序列可以很容易地通过网关重组站点12来插入。修...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人没有宣布任何竞争性的金融利益或其他利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到荷兰技术基金会 STW (12385) 的支持, 该基金是荷兰科学研究组织 (NWO) 的一部分, 由经济事务部 (检察官办公室赠款12385至 MS) 部分资助。 我们感谢卡罗尔 m. 汉密尔顿 (美国康奈尔大学) 提供 pCH20, BIBAC 的主干。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硫酸卡那霉素一水合物DuchefaK0126
硫酸庆大霉素DuchefaG0124
利福平DuchefaR0146
盐酸四环素SigmaT-3383
DB3.1 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen11782-018可以使用 Invitrogen 的 One Shot ccdB 存活 2 T1R 感受态细胞 （A10460） 或任何其他耐 ccdB 的 E. coli 菌株  
DH10B 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR 克隆酶混合物 Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
柠檬酸三钠二水合Merck106432
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503
EDTA 二钠二水合DuchefaE0511
蛋白酶 KThermo Scientific EO0491
Bacto 胰蛋白胨BD211705
酵母提取物BD212750
氯化钠霍尼韦尔 Fluka13423
氯化钾默克104936
D（+）-葡萄糖一水合物默克108346
电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙Biorad
电穿孔仪 基因脉冲器BioRad
硫酸镁七水合钙化化学442613
D（+）-麦芽糖一水合物 90%Acros Organics32991
蔗糖Sigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
MurashigeSkoog 培养基DuchefaM0221
琼脂BD214010
草铵膦-铵 （Basta）拜耳79391781
限制性内切酶NEB
溴化乙锭Bio-Rad1610433
电泳系统Bio-Rad
氢氧化钠Merck106498
盐酸Merck100316
印迹尼龙膜 Hybond N+Sigma Aldrich15358或 GE Healthcare Life Sciences （RPN203B）
Whatman 3MM Chr 印迹纸GE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
乙酰化 BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-巯基乙醇Merck805740
Sephadex G-50 粗GE 医疗保健生命科学17004401或 Sephadex G-50 培养基 （17004301）
葡聚糖硫酸钠硫酸钠 Sigma-AldrichD8906
十二烷基硫酸钠 美国生物S5010
鲑鱼精子 DNASigma-AldrichD7656
磷酸二氢钠一水合默克106346
Storage 荧光粉屏幕和盒GE Healthcare Life Sciences28-9564-74
荧光粉成像仪GE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
紫外线交联剂StratageneStratalinker 1800
保鲜膜（Saran wrap）Omnilabo1090681
琼脂糖Thermo Scientific - Invitrogen16500
硼酸Merck100165
DNA 标记物 'Blauw';DNA 分子量标准。MRC HollandMCT8070
DNA 标记 'Rood' ;DNA 分子量标准MRC 荷兰MCT8080
六核苷酸混合物Roche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
可热封聚乙烯管，透明各种供应商管的宽度应比印迹膜的宽度宽
热封机
膜过滤器diskMerckVSWP02500
氯化镁Merck105833
Hybridization meshGE Healthcare Life SciencesRPN2519
物 物 1652089物 物

参考文献

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