需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

12.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57295

⸱

2018年3月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

本文内容

摘要

使用pBIBAC-GW双元载体可轻松实现具有完整单拷贝插入的转基因植物的构建。本文提供了一系列实验方案，指导读者完成转基因拟南芥植株的构建过程，并对插入片段的完整性及拷贝数进行检测。

摘要

在培育转基因植物时，通常的目标是实现外源基因的稳定表达。这要求外源基因以单拷贝、完整的形式整合到基因组中，因为多拷贝整合常会导致基因沉默。基于细菌人工染色体（pBIBAC-GW）的Gateway兼容型双元载体与其他pBIBAC衍生载体一样，能够高效地实现单拷贝外源基因的插入。相较于原始pBIBAC载体，pBIBAC-GW中已克隆入一个Gateway表达盒，使得目的序列可通过Gateway克隆技术便捷地插入载体的T-DNA区域。通常情况下，使用pBIBAC-GW进行转化的效率为0.2–0.5%，其中约一半的转基因植株含有完整且单拷贝的T-DNA整合。pBIBAC-GW载体提供两种植物筛选标记：抗草铵膦铵盐或种子外壳表达DsRed荧光，同时在细菌中则以卡那霉素抗性作为筛选标记。本文提供一系列实验方案，指导读者完成利用pBIBAC-GW构建转基因植物的全过程：从将目的序列通过重组克隆插入选定的pBIBAC-GW载体，到利用农杆菌（Agrobacterium）进行植物转化、转基因植株的筛选，以及通过DNA印迹杂交检测插入片段的完整性与拷贝数。文中特别关注如何设计DNA印迹杂交策略，以区分单一位点或多位点上的单拷贝与多拷贝整合事件。

引言

在产生转基因植物时，通常的目标是使整合的外源基因稳定表达。这可以通过外源基因以完整单拷贝形式整合实现。多个拷贝的整合可能提高外源基因的表达水平，但也可能导致基因沉默。当插入序列以串联或反向重复形式排列时，外源基因沉默的可能性更高。1,2,3,4二元载体被用作穿梭载体 农杆菌介导的转化实验将目标序列导入植物基因组。整合到植物基因组中的拷贝数取决于双元载体在 根癌农杆菌5,6. 许多常用的双元载体均为高拷贝载体，因此可产生较高的外源基因平均拷贝数：3.3 至 4.9 拷贝 拟南芥5.

通过使用在A. tumefaciens中拷贝数较低的双元载体（如BIBAC7），或通过从A. tumefaciens染色体上启动T-DNA转移，可降低T-DNA整合的数目5。在这些情况下，外源基因平均整合次数低于25,8,9,10。由于BIBAC衍生物在A. tumefaciens以及Escherichia coli中均为单拷贝，因此能够稳定维持并递送长达150 kb的构建片段11。

GW兼容的BIBAC载体10,12 可通过Gateway克隆技术方便地将目的基因导入载体中。使用Gateway技术不仅极大地简化了克隆流程，还能克服与大分子低拷贝数载体相关的常见问题13,14，例如DNA产量低以及可用于克隆的独特限制性酶切位点有限7,11。pBIBAC-GW衍生物载体有两种类型，分别携带对草铵膦铵盐的抗性（pBIBAC-BAR-GW）或在种皮中表达DsRed荧光（pBIBAC-RFP-GW），用于植物中的筛选（图1）10,12。在这两种载体中，细菌筛选标记均为卡那霉素抗性基因。

pBIBAC-GW 载体结合了以下特点：（1）在遗传操作中易于设计和操作 E. coli，以及（2）完整的单拷贝整合 在植株中 以高效率进行。pBIBAC-GW 载体平均产生 1.7 次整合 拟南芥 约有一半的转基因植株携带单个整合的T-DNA10.

稳定表达外源基因是大多数转基因生物构建的基本要求。通过完整且单拷贝的整合可实现外源基因的稳定表达。然而，在某些情况下，使用携带完整单拷贝整合的转基因植株尤为重要，例如当研究目标涉及基于染色质的过程（如诱变、重组或修复）的效率，以及这些过程对插入位点基因组位置和染色质结构的依赖性时。为了研究寡核苷酸定向诱变（ODM）对局部基因组环境的依赖性，我们构建了一组携带完整单拷贝整合的诱变报告基因的报告株系（图2）10。利用这一系列株系，研究发现尽管外源基因的表达水平较为相似，但整合于不同基因组位点的转基因位点之间，ODM的效率仍存在差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 将目的序列插入双元载体

  1. 准备 Gateway 入门载体和双元载体。
    1. 使用试剂盒按照供应商建议的方法提取含有目的 DNA 片段或基因的 Gateway 入门载体。
      注意：BIBAC-GW 载体在细菌中筛选时需使用卡那霉素（Km），因此应选择带有非卡那霉素抗性标记的入门载体。例如，携带庆大霉素抗性基因的 pENTR-gm 载体是一个合适的选择12。
    2. 扩增并提取所需的目的 BIBAC-GW 载体。使用对 Gateway 重组盒中 ccdB 基因毒性具有抗性的 E. coli 菌株。根据供应商建议，使用专为大质粒设计的方案或试剂盒提取 BIBAC 载体。
  2. 进行 Gateway 重组反应。
    1. 按照供应商建议准备 LR 重组反应。在室温（RT）下，将以下组分加入一个 1.5 mL 微量离心管中：100–300 ng 入门克隆（超螺旋构型）、300 ng BIBAC-GW 载体、LR Clonase 反应缓冲液（终浓度为 1×）。用 TE 缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）将混合物体积调至 16 µL。最后加入 4 µL LR Clonase 酶混合液，涡旋混匀。在 25 °C 下孵育 1 小时。
    2. 向步骤 1.2.1 制备的混合物中加入 2 µL 蛋白酶 K 溶液（2 µg/µL），以终止 LR 反应。混匀后于 37 °C 孵育 10 分钟。
  3. 通过电穿孔将 Gateway 反应混合物转化至 E. coli 中。
    1. 电穿孔前对 LR 反应混合物进行脱盐处理。
      注意：此步骤对成功电穿孔至关重要。以下描述的是透析法，但也可使用乙酸钠-乙醇沉淀等其他方法。
      1. 准备滤膜透析装置。将 20 mL 超纯去离子水倒入无菌培养皿中，将膜滤圆片（孔径 = 0.025 µm）轻轻放置于水面上。
      2. 小心地将全部 LR 反应液加至膜表面，室温下透析 1 小时。
    2. 将 5 µL 脱盐后的 LR 混合液加入电穿孔杯（0.1 cm）中的电转感受态 DH10B 细胞中。进行电穿孔（1.5 V/cm，电阻 200 Ω，电容 25 µF），立即加入 1 mL 预热的 SOC 培养基，随后在 37 °C、180 rpm 条件下孵育 45 分钟。（SOC 培养基，1 L：20 g 细菌胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，0.5 g NaCl，2.5 mL 1 M KCl，20 mL 1 M 过滤除菌葡萄糖）。
      注意：DH10B 细胞可替换为其他能稳定维持大质粒的 E. coli 菌株。
      注意：最佳电穿孔条件取决于所使用的电穿孔仪器。
    3. 使用微量离心机以最大转速离心 30 秒收集细菌，弃去多余 SOC 培养基，将菌体沉淀重悬于约 50–100 µL 的 LB 培养基中。将菌液涂布于含卡那霉素的 LB 平板（Km-LB 平板，卡那霉素浓度为 40 µg/mL），37 °C 过夜培养。（LB 培养基，1 L：10 g 细菌胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl；固体培养基另加琼脂 15 g/L）。
  4. 鉴定重组后的 BIBAC-GW 衍生载体并提取质粒 DNA。
    1. 能够在 Km-LB 平板上生长的 E. coli 菌落应含有重组后的 BIBAC-GW 质粒，其中 ccdB 序列已被目标插入片段取代。使用菌落聚合酶链式反应（PCR）15 检测平板上的菌落是否含有正确的质粒，即具有 BIBAC-GW 骨架和目标插入片段。
      1. 为鉴定 pBIBAC-BAR-GW 骨架，使用引物 DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3' 和 DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3' 进行 PCR15 反应。该引物组合可扩增出 bar 基因的一段 563 bp 片段。
      2. 为检测 BIBAC-RFP-GW 骨架的存在，使用引物 M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3' 和 M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3' 进行 PCR15 反应。该引物组合可扩增出一段 791 bp 的片段，覆盖十字花科种子蛋白启动子（cruciferin promotor）与 rfp 序列的重叠区域。
      3. 使用基因特异性引物进行 PCR15 反应，以检测目标插入片段的存在。
    2. 挑取单个阳性菌落接种于含卡那霉素（40 µg/mL）的 2–5 mL LB 培养基中，用于质粒 DNA 提取16。在 37 °C、180 rpm 摇床上过夜培养。
    3. 提取质粒 DNA（参见步骤 1.1.2）。

2. 准备工作 A. tumefaciens 用于花序浸润法的 拟南芥

  1. 将 pBIBAC-GW 衍生物转化至 A. tumefaciens 中。
    1. 制备携带 pCH32 辅助质粒的 A. tumefaciens 菌株 C58C1 的电转化感受态细胞7。在含有四环素（5 µg/mL）和利福平（100 µg/mL）的培养基中培养细菌，以筛选含有 pCH32 的菌株，并确保仅 Agrobacterium 细胞生长。
    2. 将 0.25–0.5 µg 已预先溶解于 10–20 µL 无菌超纯去离子水中的 pBIBAC-GW 衍生物 DNA 加入到电穿孔杯（0.1 cm）中的 20 µL 感受态 Agrobacterium 细胞中。将细胞置于冰上保持低温。
    3. 进行电穿孔（1.5 V/cm，电阻 400 Ω，电容 25 µF）。电穿孔后立即向细菌中加入 1 mL 预热至 28 °C 的 SOC 培养基，并在 28 °C 下孵育 60–90 分钟。
    4. 将 100 µL 及其余菌液分别涂布于含有利福平（100 µg/mL）、四环素（5 µg/mL）和卡那霉素（40 µg/mL）的 LB 平板上，于 28 °C 黑暗条件下培养 1–2 天。
  2. 制备 Agrobacterium 菌液。
    1. 通过 PCR 检测步骤 2.1.4 所制备平板上的数个 A. tumefaciens 菌落，确认是否含有正确的载体（参见步骤 1.4.1）。
    2. 挑取一个经确认含有正确插入片段的双元载体的单菌落，在含抗生素的 LB 平板上划线（见步骤 2.1.4）。于 28 °C 过夜培养。
    3. 从步骤 2.2.2 获得的单菌落再次进行划线培养。
    4. 挑取一个单菌落接种至 2.5 mL 添加了抗生素（见步骤 2.1.4）的 LC 培养基中进行预培养。于 28 °C、180 rpm 条件下孵育至少 8 小时或过夜。（LC 培养基，1 L：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 · 7H2O 2.5 g，麦芽糖 2 g）。
    5. 将步骤 2.2.4 的预培养菌液接种至 250 mL 含抗生素（见步骤 2.1.4）的 LC 培养基中，于 28 °C、180 rpm 条件下过夜培养。
    6. 以 5,500 × g 离心 12 分钟收集菌体。将菌体沉淀重悬于 100 mL 含 5% 蔗糖、0.05% Silwet L-77 和 0.5× MS 的溶液中。将该悬浮液倒入无菌容器中，用于植物的花序浸润实验。

3. 拟南芥转化

  1. 准备 拟南芥 用于转化的植物
    1. 培养 拟南芥 在温室或气候可控的生长室中培养植物，直至其开花（每次浸润处理12个花盆，每盆9株植物）。
    2. 剪除第一批花序，以促进更多次级花序的生长。剪除后4–6天，当植株上出现大量未成熟花序且受精角果较少时，即可进行浸花转化。
  2. 花序浸润法
    1. 将花序浸入5–10秒 农杆菌 在步骤 2.2.6 中制备的悬浮液。使用轻柔振荡。
    2. 用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆使植物处于黑暗环境中。在温室或生长室中培养2天。
    3. 移除盒子和保鲜膜，将植物在温室或生长室中培养至成熟。
      注意：为了提高转化效率，可在首次浸染7天后对同一植株再次进行浸染。
    4. 收获种子。将使用相同构建体转化的植株所结种子（T1代）合并为一组进行收集与分析。
  3. 筛选转基因植株。
    1. 为筛选经 pBIBAC-RFP-GW 衍生载体转化的转基因植物，使用荧光显微镜分析种子。为检测种皮中的 DsRed 表达，在激发波长 560 nm、发射波长 600–650 nm 下对种子进行成像。使用镊子将荧光种子与非荧光种子分离。
    2. 为筛选经 pBIBAC-BAR-GW 衍生载体转化的转基因植株，将种子播种于装有土壤的育苗盘中（约 2,500 粒种子/0.1 m²）。2). 为确保种子在培养皿中均匀分布，将种子悬浮于含0.1%琼脂的0.5×Murashige Skoog培养基（MS）中，并使用1 mL移液器分散种子。
      注意：为了促进种子同步萌发，需将种子在 4 ℃ 下孵育至少 2 天。 °C. 此步骤可在播种种子之前或之后进行。
      1. 播种后2周和3周，用0.5% Glufosinate-ammonium溶液喷洒穴盘中的幼苗。每1 m²使用500 mL Glufosinate-ammonium溶液。2.
      2. 将存活的幼苗转移至单独的花盆中。图中显示了在（第二次）Glufosinate-ammonium 处理前后，育苗盘中幼苗的典型表型。 图3.
      3. 通过PCR分析抗草铵膦铵的植株中目标载体的存在情况（引物见步骤1.4.1）。
        1. 使用 Edwards 描述的方法提取基因组植物 DNA 用于 PCR 等17

4. 鉴定转基因植株中T-DNA整合的拷贝数与完整性

  1. 限制性酶切策略
    注意：使用限制性内切酶通过DNA印迹法确定T-DNA插入的拷贝数及其完整性。该方法可用于鉴定基因组中同一或不同位点的单拷贝以及重复插入。
    1. 使用一系列限制性酶切来鉴定可能的不同整合模式：
      1. 选择一种在T-DNA中部仅切割一次的限制性内切酶，以便能够独立探测限制性位点上游和下游的序列图4A 和 图 7A-C）。参见 图4A以及预期结果和解释的图注。
      2. 选择一种或组合使用多种酶，一次性切割出完整的目 的序列（图4B 以及 图7A-）。任何与已知长度的偏差均表明整合的盒式结构发生截短。
        注意：务必仅使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制性内切酶。
  2. 制备基因组DNA样品。
    1. 从携带目标构建体的植物中分离基因组DNA。可采用CTAB DNA小量提取法进行DNA分离。18用于DNA印迹分析的 拟南芥 DNA，2–2.5 µ克基因组DNA。将DNA溶解于50 µTE 的 L
    2. 通过凝胶电泳检测DNA完整性16完整的基因组DNA在凝胶顶部迁移形成一条清晰的条带。DNA降解则表现为出现弥散的 smear。为避免因反复冻融导致DNA损伤，基因组DNA样品应保存在4℃ °C.
    3. 消化基因组DNA（2–2.5 µg 在以下情况下 拟南芥 基因组 DNA）于总体积 50 µL，过夜，使用酶供应商推荐的缓冲条件。
      1. 在离心管中，加入2–2.5 µ克 拟南芥 基因组 DNA，5 µL 10倍限制性酶缓冲液，以及5 U限制性内切酶，总体积为50 µL超纯去离子水
    4. 将上样染料加入限制性酶切样品中，使其终浓度为1×，然后上样至凝胶。为获得良好的可视化追踪效果，可选用以下指示染料：与较小片段共迁移的溴酚蓝（350–400 bp）或与较大片段共迁移的二甲苯青蓝（Cylene cyanol，3–4 kbp）。
  3. 运行DNA凝胶电泳。
    1. 制备一块长（20 cm）的0.5×TBE琼脂糖凝胶19凝胶中琼脂糖的百分比取决于预期的片段大小。0.8–1% 的浓度可最佳分离片段 >大小为1 kb。对于片段，使用1–1.5%琼脂糖凝胶 <1 kb。不要向凝胶中添加溴化乙锭。（5×TBE，1 L：54 g Trizma 碱，27.5 g 硼酸，3.75 g EDTA）。
      注意：为防止 DNA 污染，请使用未用于分离质粒和 PCR 扩增 DNA 的凝胶电泳托盘。
    2. 将样品上样至凝胶19.
    3. 在凝胶中加入大小范围与预期片段相符的DNA标记物。加载约1 µ在凝胶上加入g的标记物（50-250 ng不同大小的片段），以便通过紫外光可视化观察。
    4. 在低电压（40–50 V/500 mA）下对DNA进行过夜的大小分级分离。
  4. 将DNA从琼脂糖凝胶转移至尼龙膜前的准备工作。
    1. 将凝胶转移至另一个托盘中，在含有溴化乙锭（5 μg/mL）的0.5×TBE缓冲液中染色20–25分钟。 µg/mL）时，在旋转摇床上以 40 rpm 的速度旋转。
    2. 在紫外透射仪上观察凝胶。验证基因组DNA的大小分离情况，包括离散的卫星条带是否可见图 5A向较低分子量方向出现的弥散条带表明DNA降解。
    3. 在紫外透射仪上，将一张透明膜覆盖在凝胶上，用记号笔标记加样孔和分子量标记条带的位置图5B这将有助于在后续步骤中确定杂交片段的大小，以防标记序列与探针DNA的杂交不具特异性。在此步骤中标注标记片段，可追踪杂交片段的大小。
    4. 将凝胶放回托盘中，用超纯去离子水冲洗，然后浸入0.25 M HCl中15分钟以使凝胶内的DNA片段化。用超纯去离子水洗涤。使用足量的HCl和水以完全覆盖托盘中的凝胶，并将盛有浸没凝胶的托盘置于摇床上，以40 rpm转速旋转。
    5. 将凝胶在变性缓冲液中孵育 30 分钟。用超纯去离子水洗涤。使用足量的缓冲液和水以完全覆盖托盘中的凝胶，并在摇床上以 40 rpm 的速度旋转托盘，使凝胶浸没其中。（变性缓冲液：0.5 M NaOH，1.5 M NaCl）。
    6. 将凝胶在中和缓冲液中孵育30分钟。用超纯去离子水洗涤。使用足量的缓冲液和水以浸没托盘中的凝胶，并在旋转摇床以40 rpm转速旋转托盘使凝胶浸没其中。（中和缓冲液：0.5 M Tris，1.5 M NaCl，220 mM HCl，pH 7.6）。
  5. 将DNA转移至尼龙膜上。
    1. 准备基因组DNA的毛细管转移装置。将一个塑料板（大小约与凝胶相同或更大）置于盛有20倍浓度柠檬酸钠-氯化钠（SSC）溶液的托盘上。将一张厚滤纸折叠后跨过托盘，使其两端浸入SSC溶液中。剪取一块与凝胶大小相同的带正电荷的尼龙膜Hybond N+，以及两张大小相同的厚滤纸。（20x SSC：3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠）
    2. 准备印迹装置（图6将凝胶（点样孔朝下）放置在塑料板上滤纸的上方。在其上放置一张Hybond N+膜，随后覆盖两层滤纸。每加一层前需用20x SSC预湿。确保去除各层之间的所有气泡，以免阻碍DNA转移。
    3. 用一层厚的纸巾覆盖装配体，在其上方放置一个带有重物（如小瓶子）的塑料板。确保压力均匀分布在凝胶上，以保证DNA的有效转移。
      注意：重量应约为 200–300 g；过重的重量会妨碍 DNA 转移。
    4. 用保鲜膜覆盖装配区域周围部分，包括暴露的滤纸图6）以避免 20x SSC 缓冲液蒸发，并使毛细作用力指向尼龙膜。转印过夜。
    5. 用铅笔在膜的顶部标记加样孔的位置、名称和/或日期，然后将膜从装置中取出。注意，与凝胶接触的底面带有DNA。
    6. 立即通过紫外照射（2,400 µJ/m2) 使用紫外交联仪。
      注意：交联条件取决于所用膜的类型。
      注意：此时可将膜在 -20℃ 保存 °C，用于后续与探针杂交。将交联后的膜在2x SSC中漂洗，然后密封于预折叠的可热封聚乙烯管中，置于-20℃保存。 °C.
  6. 准备用于杂交的探针。
    1. 通过PCR扩增将用于DNA印迹杂交的探针序列20使用50-100 ng的250 bp-2 kbp PCR片段作为探针。可分别使用两个探针，一个与T-DNA右边界邻近区域杂交，另一个与左边界邻近区域杂交，以检测完整T-DNA的存在（图 4A 以及 图7).
    2. 将50–100 ng的PCR产物用24 μL水稀释 µ超纯去离子水 L，置于试管中。
    3. 将稀释的PCR产物在水浴或加热块中煮沸5分钟以使其变性，然后直接置于冰上冷却。
    4. 在冰上解冻预混的GCT混合液。（GCT混合液：dGTP、dCTP、dTTP（均为0.5 mM）、随机六聚体43.2 ng/μL）µL，乙酰化BSA 1.33 mg/mL，33 mM的 β-巯基乙醇，0.67 M Hepes，0.17 mM Tris pH 6.8，17 mM MgCl
    5. 加入21 µL的GCT混合液和2 U Klenow片段加入PCR产物中。
    6. 加入2 µ升的[32P]ATP 加入混合物中，37℃孵育 °C，1 小时。
      警告：所有涉及[32P]ATP 的操作必须在指定用于放射性工作的环境中进行，并使用适当的防护措施。
      注意：确保 [32P]ATP 应为新鲜制备（未超过其半衰期）。
    7. 准备Sephadex G-50（粗粒或中粒）柱21 用于从未掺入的（放射性）核苷酸中纯化标记探针。取一支2 mL注射器，用一小块厚滤纸覆盖其出口端。将2 mL溶于TE缓冲液中的Sephadex G-50加入注射器中，通过离心去除柱中全部液体。
    8. 将柱子放入一个15 mL塑料离心管中，加入标记好的探针至柱上，室温下离心（将离心机设置为750 × g，待转速升至750 × g后停止离心机，待转速降至0 × g）以洗脱探针。加入200 µ加入1 mL TE至柱中，离心以洗脱剩余探针；重复一次。在此条件下，标记的DNA片段被排除在Sephadex凝胶基质之外而被洗脱，游离核苷酸则保留在柱中。
    9. 使用300 µ每杂交管中加入适量标记探针的 L，其余标记探针保存于 -20 °C，以备后续使用。但需注意 [32P]ATP
  7. 杂交DNA印迹。
    1. 将2×SSC和杂交缓冲液（每根杂交管15 mL，每管最多处理2张膜）加热至65℃ °C. （杂交缓冲液：10% 硫酸葡聚糖，1% SDS，1 M NaCl，50 mM Tris pH 7.5，65℃下溶解） °C，将分装样品置于 -20 ℃保存 °C）。
    2. 将杂交炉预热至 65 °C.
    3. 将尼龙网置于盛有少量加热（65℃）水的托盘中 °C) 加入 2x SSC 覆盖托盘。将 DNA 印迹置于网膜上，DNA 面朝上。连同网膜一起将印迹卷起，并将卷好的印迹放入杂交管中。倒去多余的 2x SSC。
    4. 在微量离心管中，将150 µ每杂交管中加入 1 L 浓度为 10 mg/mL 的鲑精 DNA，孵育 5 分钟（另见步骤 4.6.3）。立即置于冰上冷却，然后加入预热的杂交缓冲液中。
    5. 将杂交缓冲液-鲑鱼精子溶液加入含有印迹的试管中，在65 °C下预杂交。 °在12 rpm的旋转轮中于4°C孵育至少1小时。
    6. 当步骤 4.7.5 中的预培养即将结束时，将 300 µ将标记的探针溶液 5 分钟（另见步骤 4.6.3），孵育结束后立即加入杂交膜中。
    7. 在63℃的旋转轮中杂交过夜 °C，12 转/分钟。切勿将探针直接加至印迹膜上，而应加入杂交缓冲液-鲑精 DNA 溶液中。
  8. 洗涤印迹。
    1. 将洗涤液（1x SSPE, 0.1% SDS 和 0.1x SSPE, 0.1% SDS）预热至 65 ℃ °C.（20× SSPE：3 M NaCl，230 mM NaH2PO4，20 mM EDTA，pH 7.0）
    2. 弃去杂交溶液，向杂交管中加入约100–150 mL的1x SSPE、0.1% SDS溶液，盖紧管盖，手动旋转混匀。将杂交液和洗涤液倒入适当的液态放射性废物容器中。
    3. 加入约 100–150 mL 的 1x SSPE、0.1% SDS 溶液至管中，盖紧后于 63 °C 孵育 15 分钟 °在旋转轮中，37 °C，12 rpm。适当弃去洗涤液。
    4. 加入约 100–150 mL 的 0.1x SSPE、0.1% SDS 溶液至杂交管中，封闭管口，在 63 °C 下旋转 5 分钟 °C，12 转/分钟。妥善弃去洗涤液。
    5. 将印迹膜从管中取出，放入盛有足量预热的0.1×SSPE、0.1% SDS溶液的托盘中，在65℃摇动水浴中振荡3分钟 °C. 同时，将筛网置于盛有水的托盘中冲洗。
    6. 取出印迹，置于预先折叠好的塑料膜（聚乙烯管）之间，轻轻擦去多余液体，并让印迹短暂干燥。注意液体将损坏磷光成像屏。
    7. 将印迹从三侧用塑料膜密封。去除印迹周围所有多余液体，通过密封第四侧封闭塑料管。剪去多余的塑料膜。确保密封后的印迹无泄漏，且塑料膜外表面干燥。
  9. 曝光磷光成像屏。
    1. 将密封的印迹膜放入磷光成像盒中，使磷光成像屏面向印迹膜的DNA一侧。盖紧盒盖并静置 ± 2–4 天，具体时间取决于放射性标记的强度和磷屏成像仪的灵敏度。
    2. 使用磷屏成像仪扫描磷屏。扫描前应尽量避免让磷屏暴露于光线下。保存图像。通过将磷屏暴露于强光下以消除信号。
  10. 分析印迹。
    1. 分析依赖于步骤4.1中所采用的限制性酶切策略。在分析按照步骤4.1.1.1所示策略制备的印迹时（图4A），计数检测到的片段数量。在此策略中，杂交片段的数量代表T-DNA整合的拷贝数。
      1. 比较使用左侧片段探针检测到的片段数量图7B）和右侧（图 7CT-DNA 的一部分。
        注意：若检测到不同数量的杂交片段，则可能存在以下两种情况：i）多个T-DNA拷贝（以反向或正向排列）；或 ii）T-DNA未完全整合。
      2. 根据标记条带的大小估算杂交片段的大小，并将杂交片段的大小与基于串联插入限制性酶切策略计算出的预期片段大小进行比较图 4A)以识别T-DNA可能的串联排列。使用 图 4A 作为计算预期片段大小的参考。
        注意：如果杂交片段的大小与计算值不符，则很可能存在的整合之一不完整。
    2. 在分析按照步骤 4.1.1.2 所示策略制备的印迹时（图 4B），根据标记条带的大小估计杂交片段在印迹上的大小，并与预期大小进行比较。完整的插入会产生一条具有确定长度的单一片段。任何与预期长度的偏差均表明插入不完全。图7D).
  11. （可选）剥离膜以进行再次杂交。
    注意：同一张印迹膜可连续与不同的探针进行杂交。在使用新的探针前，需将先前杂交的探针从印迹膜上剥离。
    1. 将膜的DNA面朝下放入盛有0.5% SDS溶液的托盘中，以去除膜上的探针。加入过量的0.5% SDS，将膜煮沸2–5分钟。处理时间取决于所用探针的长度和GC含量：较长且GC含量较高的探针需要更长的处理时间。
    2. 洗脱后，用另一种探针重新杂交印迹，或密封后于 -20 ℃保存 °C.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

利用BIBAC-GW系统，构建了用于研究植物中ODM的报告基因载体10。这些载体首先在Gateway入门载体pENTR-gm12中进行设计，然后通过Gateway LR重组反应插入到pBIBAC-BAR-GW中（图1）。

利用 pDM19（一种带有 mTurquoise-eYFP 报告基因的 BIBAC-BAR-GW 质粒，其 eYFP 阅读框第 120 位含有翻译终止密码子，即 mTurquoise2-eYFP*40）对拟南芥（Arabidopsis）进行遗传转化（图 2）10。共对 126 株拟南芥植株进行了转化（每盆 9 株，共 14 盆）。将这些植株的种子混合后播种于...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

获得具有单拷贝、完整插入外源基因的转基因植株，关键在于所选用的双元载体。BIBAC系列载体已被用于将目的序列递送至多种植物物种23,24,25,26,27,28。BIBAC载体（包括BIBAC-GW）能够高效地实现单拷贝整合：每株系平均插入拷贝数为1.5至2，而大多数常用双元载体的平均插入拷贝数为3或更高5,9,29。相较于其他BIBAC载体，BIBAC-GW载体的主要改进在于可通过Gateway重组位点便捷地插入目的序列12...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本研究由荷兰技术基金会STW（12385）资助，该基金会是荷兰科学研究组织（NWO）的一部分，并由荷兰经济事务部部分资助（向MS提供的OTP资助编号12385）。 我们感谢美国康奈尔大学的Carol M. Hamilton提供了pCH20质粒，该质粒是BIBAC-GW载体的骨架。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硫酸卡那霉素一水合物DuchefaK0126
硫酸庆大霉素DuchefaG0124
利福平DuchefaR0146
盐酸四环素SigmaT-3383
DB3.1 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen11782-018可使用 Invitrogen 的 One Shot ccdB Survival 2 T1R 感受态细胞 (A10460) 或任何其他具有 ccdB 抗性的 E. coli 菌株代替  
DH10B 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR Clonase 酶混合液 Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
三水合二钠柠檬酸盐Merck106432
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503
二水合乙二胺四乙酸二钠DuchefaE0511
蛋白酶 KThermo Scientific EO0491
胰蛋白胨BD211705
酵母提取物BD212750
氯化钠Honeywell Fluka13423
氯化钾Merck104936
一水合 D(+)-葡萄糖Merck108346
电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙Biorad1652089
电穿孔仪 Gene PulserBioRad
七水合硫酸镁Calbiochem442613
90% 一水合 D(+)-麦芽糖Acros Organics32991
蔗糖Sigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige 和 Skoog 培养基DuchefaM0221
琼脂BD214010
草铵膦铵盐（Basta）Bayer79391781
限制性内切酶NEB
溴化乙锭Bio-Rad1610433
电泳系统Bio-Rad
氢氧化钠Merck106498
盐酸Merck100316
Hybond N+ 尼龙印迹膜Sigma Aldrich15358或 GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr 印迹纸GE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
乙酰化牛血清白蛋白Sigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-巯基乙醇Merck805740
Sephadex G-50 粗颗粒GE Healthcare Life Sciences17004401或 Sephadex G-50 中颗粒 (17004301)
硫酸葡聚糖钠盐Sigma-AldrichD8906
十二烷基硫酸钠 US BiologicalS5010
鲑鱼精子 DNASigma-AldrichD7656
一水合磷酸二氢钠Merck106346
储存式磷屏及暗盒GE Healthcare Life Sciences28-9564-74
磷成像仪GE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
紫外交联仪StratageneStratalinker 1800
保鲜膜（Saran wrap）Omnilabo1090681
琼脂糖Thermo Scientific - Invitrogen16500
硼酸Merck100165
DNA 标记物 ‘Blauw’；DNA ladderMRC HollandMCT8070
DNA 标记物 ‘Rood’；DNA ladderMRC HollandMCT8080
六核苷酸混合物Roche11277081001
大构建片段试剂盒Qiagen12462
可热封透明聚乙烯管多个供应商管的宽度应大于印迹膜的宽度
热封仪
膜过滤圆盘MerckVSWP02500
氯化镁Merck105833
杂交网膜GE Healthcare Life SciencesRPN2519

参考文献

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33(2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208(2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644(2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

BIBAC-GW 载体Gateway 重组DNA 印迹农杆菌转化草铵膦筛选DsRed 荧光限制性内切酶T-DNA 完整性
利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。