Method Article

用 BIBAC 二元矢量生成单拷贝插入的转基因植物

DOI:

10.3791/57295

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用 pBIBAC 的二进制向量, 可以生成具有完整单拷贝插入的转基因植物, 这是一个简单的过程。在这里, 提出了一系列的协议, 指导读者通过生成转基因拟南芥植物的过程, 并测试植物的完整性和复制数量的插入。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生成转基因植物时, 一般的目的是要有稳定的转基因表达。这需要一个单一的, 完整的整合的转基因, 因为多拷贝集成往往受到基因沉默。与其他 pBIBAC 衍生物一样, 基于细菌人工染色体 (pBIBAC) 的网关兼容二进制向量允许单拷贝转基因的高效插入。作为对原 pBIBAC 的改进, 一个网关盒已被克隆成 pBIBAC, 因此, 现在的兴趣序列可以很容易地纳入矢量转移 dna (T DNA) 的网关克隆。通常情况下, 与 pBIBAC 的转换结果是0.2–0.5% 的效率, 即转基因的一半携带完整的单拷贝集成的 T DNA。pBIBAC 的载体是可利用的抗膦铵或 DsRed 荧光的种子大衣, 以选择在植物, 和抗卡那霉素作为选择的细菌。在这里, 提出了一系列的协议, 引导读者通过使用 pBIBAC 生成转基因植物的过程: 从将兴趣序列重新结合到 pBIBAC 的选择向量, 到植物转化与农杆菌, 选择转基因, 并测试植物的完整性和复制数量的插入使用 DNA 印迹。注意设计一种 DNA 印迹策略, 以识别单个和多个位点的单拷贝和多复制集成。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生成转基因植物时, 通常的目的是使综合转基因 (s) 稳定表达。这可以通过转基因的完整的单拷贝集成来实现。多重整合可以导致基因表达的增加, 同时也会使转基因沉默。如果插入的序列排列在串联或反转重复的1、2、3、4中,则更有可能转基因沉默。在农杆菌介导的转化实验中, 二进制向量被用作航天飞机, 将感兴趣的序列传递到植物基因组中。集成到植物基因组的数量依赖于农杆菌5、6中二进制向量的拷贝号.许多常用的二进制向量都是高拷贝向量, 因此产生高平均的转基因拷贝数:拟南芥5中的3.3 到4.9 个拷贝。

通过使用.BIBAC 中具有低拷贝数的二进制向量 (如7) 或从a. 农杆菌染色体5启动 t dna, 可以降低 t dna 积分的数量。在这种情况下, 转基因集成的平....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 将感兴趣的序列插入二进制向量中

  1. 准备网关条目和二进制向量。
    1. 根据供应商的建议, 将包含 DNA 片段或感兴趣基因的网关入口向量隔离。
      注: BIBAC-GW 载体需要使用卡那霉素 (公里) 来选择细菌, 因此, 使用一个输入向量与另一种抵抗标记而不是卡那霉素。例如, 携带庆大霉素抗性基因的 pENTR 转基因载体是一个很好的选择12。
    2. 传播和隔离 BIBAC 的兴趣向量。使用对在网关盒中存在的ccdB基因的毒性具有抗药性的大肠杆菌菌株。根据供应商的建议, 使用专门为大型质粒设计的协议或套件隔离 BIBAC 矢量。
  2. 进行网关反应。
    1. 根据供应商的建议, 准备 LR 重组反应。在室温下 (RT) 将以下组件混合在1.5 毫升离心管中: 100–300的进入克隆 (超螺旋), 300 的 BIBAC-GW 向量, LR Clonase 反应缓冲器 (最终浓度: 1x)。将混合物的体积调整到16µL (10 毫米三, EDTA 1 毫米, pH 8.0)。最后, 添加4µL 的 LR Clonase 酶混合, 并混合涡流。将混合物在25摄氏度孵育1小时。
    2. 在步骤1.2.1 中加入2µL 蛋白酶 K 溶液 (2 µg/µL), 终....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用 BIBAC 系统, 生成了用于研究植物 ODM 的记者构造10。构造是在网关条目向量 pENTR-gm12中设计的, 并使用网关 LR 复合反应插入 pBIBAC BAR (图 1)。

拟南芥是与 pDM19, 一个 BIBAC-GW 质粒与 mTurquoise eYFP 的记者, 携带一个平移停止密码子在 eYFP 阅读框架的位置 120 (mTurquoise2-eYFP*40) (图 2)10。总共有126个拟南芥植物被改造 (每壶9株, 14 盆)。这些植物的种子被汇集, 播种在托盘与土壤, 并允许生长两个星期之前, 膦铵溶液处理。只有表示bar

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对产生转基因的关键是单一的, 完整的整合的转基因是使用二进制向量的选择。BIBAC 家族载体已被用来交付许多植物物种的利益序列23,24,25,26,27,28。BIBAC 向量, 包括 BIBAC, 具有高效率的单拷贝集成: 每行插入的平均数量是1.5 到 2, 而最常用的二进制向量5,9,29. 与其他 BIBAC 向量相比, 与 BIBAC 的向量比较起来, 兴趣序列可以很容易地通过网关重组站点12来插入。修.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人没有宣布任何竞争性的金融利益或其他利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到荷兰技术基金会 STW (12385) 的支持, 该基金是荷兰科学研究组织 (NWO) 的一部分, 由经济事务部 (检察官办公室赠款12385至 MS) 部分资助。 我们感谢卡罗尔 m. 汉密尔顿 (美国康奈尔大学) 提供 pCH20, BIBAC 的主干。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
硫酸卡那霉素一水合物DuchefaK0126
硫酸庆大霉素DuchefaG0124
利福平DuchefaR0146
盐酸四环素SigmaT-3383
DB3.1 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen11782-018可以使用 Invitrogen 的 One Shot ccdB 存活 2 T1R 感受态细胞 （A10460） 或任何其他耐 ccdB 的 E. coli 菌株  
DH10B 感受态细胞Thermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR 克隆酶混合物 Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
柠檬酸三钠二水合Merck106432
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503
EDTA 二钠二水合DuchefaE0511
蛋白酶 KThermo Scientific EO0491
Bacto 胰蛋白胨BD211705
酵母提取物BD212750
氯化钠霍尼韦尔 Fluka13423
氯化钾默克104936
D（+）-葡萄糖一水合物默克108346
电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙Biorad
电穿孔仪 基因脉冲器BioRad
硫酸镁七水合钙化化学442613
D（+）-麦芽糖一水合物 90%Acros Organics32991
蔗糖Sigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
MurashigeSkoog 培养基DuchefaM0221
琼脂BD214010
草铵膦-铵 （Basta）拜耳79391781
限制性内切酶NEB
溴化乙锭Bio-Rad1610433
电泳系统Bio-Rad
氢氧化钠Merck106498
盐酸Merck100316
印迹尼龙膜 Hybond N+Sigma Aldrich15358或 GE Healthcare Life Sciences （RPN203B）
Whatman 3MM Chr 印迹纸GE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
乙酰化 BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-巯基乙醇Merck805740
Sephadex G-50 粗GE 医疗保健生命科学17004401或 Sephadex G-50 培养基 （17004301）
葡聚糖硫酸钠硫酸钠 Sigma-AldrichD8906
十二烷基硫酸钠 美国生物S5010
鲑鱼精子 DNASigma-AldrichD7656
磷酸二氢钠一水合默克106346
Storage 荧光粉屏幕和盒GE Healthcare Life Sciences28-9564-74
荧光粉成像仪GE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
紫外线交联剂StratageneStratalinker 1800
保鲜膜（Saran wrap）Omnilabo1090681
琼脂糖Thermo Scientific - Invitrogen16500
硼酸Merck100165
DNA 标记物 'Blauw';DNA 分子量标准。MRC HollandMCT8070
DNA 标记 'Rood' ;DNA 分子量标准MRC 荷兰MCT8080
六核苷酸混合物Roche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
可热封聚乙烯管，透明各种供应商管的宽度应比印迹膜的宽度宽
热封机
膜过滤器diskMerckVSWP02500
氯化镁Merck105833
Hybridization meshGE Healthcare Life SciencesRPN2519
物 物 1652089物 物

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BIBAC GW VectorGateway RecombinationTransgenic PlantsSingle copy InsertionsDNA BlottingAgrobacterium TransformationGlufosinate SelectionDsRed FluorescenceRestriction EnzymesT DNA Integrity

Related Articles