本文介绍了一种用于人类的实验方法 体外 一种在96孔板格式中模拟冲击性创伤相关时间尺度的拉伸损伤模型。该方法包括可拉伸培养板的制备、机械损伤的量化、细胞培养与损伤、成像以及用于量化损伤的高内涵分析。
本文内容
摘要
摘要
创伤性脑损伤（TBI）是一种具有高发病率和高死亡率的重要临床难题。尽管已有数十年的临床前研究，目前仍无经证实有效的TBI治疗方法。本文介绍了一种新颖的临床前神经创伤研究方法，旨在补充现有的临床前模型。该方法通过使用人诱导多能干细胞来源的神经元（hiPSCNs）引入人类病理生理特征。其施加的载荷脉冲持续时间与临床闭合性头部撞击损伤的载荷持续时间相似。该方法采用96孔板格式，便于进行高通量实验，并能高效利用昂贵的细胞和培养试剂。首先对硅胶膜进行处理以去除具有神经毒性的未固化聚合物，然后将其键合至商用96孔板本体上，制成可拉伸的96孔板。使用自行设计的装置从部分或全部孔的底部进行压痕，从而诱导双轴等张机械应变，对孔内培养的细胞造成机械性损伤。通过在压痕过程中对孔底进行高速摄像，以经验方式确定压痕深度与机械应变之间的关系。可采用改良的传统细胞培养方案，在这些硅胶膜上培养包括hiPSCNs在内的多种细胞。损伤后，以半自动化方式获取并分析细胞培养物的荧光显微图像，以定量评估每个孔中的损伤程度。该模型已针对hiPSCNs进行优化，但理论上也可应用于其他细胞类型。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是美国死亡和发病的主要原因，每年导致约52,000人死亡和275,000例住院治疗1。已有超过30项针对TBI候选治疗药物的临床试验开展，但无一成功2。这种普遍的失败表明，人类特有的病理过程使得人类TBI与常用临床前啮齿类动物模型中观察到的病理生理学存在差异。
人源性诱导多能干细胞神经元的出现为研究人类神经创伤提供了机遇 体外 模型。基于hiPSCN的药物筛选模型可能比使用啮齿类动物细胞的模型更准确地预测临床疗效。此外，hiPSCN可进行遗传学操作，以分离并研究单个人类遗传变异对病理过程的影响3.
本文所述方法旨在将基于hiPSCN的疾病建模独特优势应用于神经创伤研究。体外神经创伤拉伸损伤模型已使用原代啮齿类细胞和人类神经肿瘤细胞系得到广泛建立4,5,6。这些模型大多通过气动加载硅胶膜来产生拉伸力。该方法在单孔体系中效果良好，但在向多孔体系扩展方面已被证明存在困难7。因此，迄今为止尚无针对拉伸损伤神经元治疗药物的高通量筛选研究。
在此模型中，膜结构因下方刚性压头的压入而发生拉伸。该方法已被反复证实可产生具有临床相关性的病理变化 体外 在单孔系统中8,9,10我们近期的研究表明，该方法可轻松扩展至96孔板格式，同时保持脉冲持续时间在数十毫秒的量级。11，即闭合性头部撞击事件的时间域12,13.
总之，该方法的主要优势在于 体外 损伤模型的特点包括采用96孔板格式、使用人诱导多能干细胞来源的神经元（hiPSCNs），以及具有临床相关性的损伤时间窗。
方案
1. 硅胶解毒
- 使用剃刀和丙烯酸模板，将254 µm厚、30.48 cm × 30.48 cm的硅胶膜切割成7.5 cm × 11 cm的矩形。每张膜可制备10个矩形膜。保留硅胶膜包装中附带的纸张。
- 将膜放入装有去离子水（DI水）和玻璃器皿清洁剂的容器中。每次取一片膜，戴手套用指尖用力擦洗至少20秒，或直至产生泡沫。
- 用流动的去离子水冲洗膜，直至泡沫完全清除。将膜平铺在原包装纸张上，并在重力循环条件下进行高压灭菌。
- 将每片硅胶膜分别浸泡于250 mL的70%乙醇中，在旋转摇床以60 rpm转速下处理24小时。容器应采用不与乙醇反应的材料制成，例如聚丙烯。
- 若将多片膜置于同一个容器中，或膜粘附在容器底部，应使用塑料移液管吸头和移液管吸头架将膜与其环境分隔开。
- 用戴手套的手将硅胶膜转移至每片250 mL的去离子水中，在旋转摇床上以60 rpm转速浸泡48小时。
- 将膜重新平铺在纸张上，放入93 °C的玻璃器皿烘箱中干燥4小时。
- 将膜保留在纸张上，存放于洁净干燥处，并用另一张纸覆盖，以防灰尘污染。
2. 培养板制备
- 使用200 W等离子清洗仪对96孔板盖进行等离子处理（参见 材料清单）在高功率下处理60秒，将芯片底部朝上放入等离子清洗仪中。通过腔室窗口观察是否有紫色辉光出现，若有则表明已形成有效的等离子体。该键合技术改编自Sunkara 等14
- 60 秒内将培养皿盖倒置（底部朝下）放入 200 mL 的 1.5% 二甲基亚砜（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）水溶液中，浸泡 20 分钟。该溶液不稳定：应在放入培养皿前不超过 60 秒内配制。
警告：请在通风橱中操作 APTES。 - 将提取的硅胶膜置于等离子清洗仪中，以高功率等离子处理60秒。控制等离子处理时间，使其在步骤2.2的20分钟周期结束前不超过5分钟内完成。
- 使用镊子将经等离子体处理的膜置于 7.5 × 11 cm 的2 羊皮纸矩形。将一块7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm的铝板对齐放置于平板制备夹具的下部。用镊子将硅胶膜和羊皮纸在铝板上对齐放置。
注意：该装置的计算机辅助设计（CAD）文件作为补充材料提供，包含在补充代码文件“Press Die - Generic 3D.STEP”中。相关物料清单已提供于 补充表1：自制设备——物料清单.xlsx. - 从APTES溶液中取出板盖，甩去多余溶液。浸入200 mL去离子水浴中5秒，甩去多余水分。再浸入另一份200 mL去离子水浴中5秒，甩去多余水分。在浸入下一块板盖前，更换上述水浴中的去离子水。
- 使用压缩空气将板的顶部彻底吹干。
- 将板的上部置于板制作夹具的上端。轻轻合上板制作夹具，使板的上部与硅胶压紧。夹紧至少1小时。
- 将培养板在室温下避尘静置固化24小时后使用。
3. 拉伸培养板
- 清洁压头。
注意：参见 补充图1.- 在室温下将去离子水加入60 W的浴式超声波破碎仪中。
- 将压痕块支撑在超声波清洗槽上方，倒置，使仅压痕头顶部浸入液面下至少1 mm深度。在42 kHz条件下对压痕头超声处理8 min。
- 用压缩空气吹干压头。
- 对齐压头块。
- 将一台具有实时画面传输功能的相机置于拉伸装置上方，使其俯视压痕阵列，对焦于压痕器的顶部。
注意：第4节中描述的装置 "表征膜拉伸" 是完成此任务的一种可能的相机设置。 - 使用载物台夹具将培养板固定在损伤装置的载物台上（图1并将一个圆顶灯放置在装置上方。
注意：参见 材料表 用于仪器控制软件。 - 启动仪器控制软件，方法是单击控制损伤设备的计算机桌面上的软件图标。运行 "体外神经创伤.lvproj" 在启动窗口中单击项目以打开。在项目窗口中，通过双击分别启动名为“motion_control.vi”和“position_tracker.vi”的运动控制和位置追踪虚拟仪器（VIs）。
- 关闭围绕损伤装置的笼子。按下运动控制虚拟仪器（VI）左上角的“箭头”按钮以运行该程序，然后点击“Near Bottom”将载物台下降至距离压痕器约2毫米处。点击“Stop”按钮以停止程序运行。
注意：在笼内操作相机时，请勿将手伸入担架区域。笼子应配备门控开关，仅在笼门关闭时才向拉伸装置供电。 - 在项目窗口中，右键单击“Axis 1”，然后点击“Interactive Test Panel”。在打开的窗口中，将步长设置为 50 µm 通过在“目标位置”字段中输入“500”单位。
- 反复点击“交互式测试面板”窗口底部的绿色“运行”按钮，直至载物台首次接触到任意一个压头。通过摄像头显示的实时图像检查接触情况。记录“交互式测试面板”窗口左上方显示的垂直载物台位置；该位置即为首次接触位置。
- 继续向下移动（如步骤 3.2.6 所述），直至每个孔均与压痕器接触。如有必要，移动摄像头以观察整个板，并通过设定负的“目标位置”来上下移动载物台。当所有柱体均接触时，记录窗口左上角显示的载物台垂直位置（此即完全接触位置）。
- 注意首次接触位置与完全接触位置之间的区别。关闭“交互式测试面板”。运行“运动控制VI”（见步骤3.2.4），点击“Top”以升起载物台。使用“Stop”按钮停止运动控制VI。
- 当载物台运动至最高位置时，打开门以使设备停止工作。调节压头块四个角上的调节螺钉。将最先接触的角上的螺钉松开，以降低该角，同时拧紧对角的螺钉，以抬高最后接触的角。
- 重复降低载物台直至样品板接触压头，检查接触图像是否存在倾斜，然后升高载物台并调整压头块（步骤 3.2.9）。当载物台与压头块对齐时，所有压头将同时接触样品。
- 打开设备门以使装置失活。将固定螺钉插入压头块上的孔中并拧紧。确认在安装固定螺钉后压头块处于水平状态（步骤 3.2.4–3.2.8）。当压板接触时，记录“交互式测试面板”显示的载物台位置，该位置将作为压痕实验的零位。
- 将一台具有实时画面传输功能的相机置于拉伸装置上方，使其俯视压痕阵列，对焦于压痕器的顶部。
- 润滑压头。
- 如果压头模块刚刚安装且尚未润滑，请使用浸有乙醇的实验室擦拭巾清洁一块实心橡胶垫（7.5 cm × 11 cm × 1.5 mm）和一块柔软的闭孔泡沫橡胶垫（7.5 cm × 11 cm × 3 mm），然后使其自然风干。
- 用实验室擦拭纸蘸取玉米油，均匀涂抹于实心橡胶垫上，直至呈现暗淡光泽。
- 将泡沫垫放置在实心橡胶垫上，以将油转移到泡沫垫上。在泡沫垫上方放置一块7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm的铝板，并加载约360 g的压载重量（例如，6 个锥形管，每个装有 45 mL 水）以确保油从固体橡胶垫一致地转移到泡沫垫上。静置 10 s，使油转移至泡沫橡胶垫。
- 将泡沫橡胶垫移至压痕阵列上。将铝板和配重块依次放置在泡沫橡胶垫上方，以确保油液均匀地传递至压痕针尖端。静置10秒，使油液充分转移至压痕针。
- 如果自压头块首次安装并润滑以来尚未拉伸过任何载玻片，则在开始实验前应先拉伸一块测试载玻片。
注意：这将防止首次拉伸与后续拉伸之间的不一致对实验造成干扰。对于后续拉伸，在每次拉伸前仅需重复步骤 3.3.2–3.3.5。
- 拉伸培养板。
- 按照步骤 3.3 中所述润滑压头。
- 用载物台夹具将培养板固定在损伤装置的载物台上。若需保持无菌，可调整盖子的位置，以固定培养板的同时避免培养表面暴露于室内空气中。
- 使用载物台将物镜降至零位 '运动控制VI（见步骤3.2.4-3.2.6）；零位在步骤3.2.中确定
- 更改文件名中的 "文件路径" 在“位置追踪VI”中的文件名字段输入一个唯一的文件名，然后点击该窗口左上角的“箭头”按钮运行程序。
- 在“运动控制面板VI”的“损伤（mm）”和“损伤持续时间（ms）”字段中，通过单击相应字段并输入所需数值，设置压痕的深度和持续时间（通常分别为1–4 mm和30 ms，最大深度为5 mm，最短持续时间为15 ms）。
- 运行“运动控制面板VI”，然后单击“损伤”以压入培养板。
- 通过点击“Top”将载物台移至行程的最顶端，然后点击“Stop”按钮停止程序，并通过打开门来关闭损伤装置。
- 检查“位置追踪VI”中显示的载物台位移历史，以确认已施加指定的最大位移。右键单击图表，然后点击“导出至Excel”。点击“文件| 另存为”以保存数据。
4. 膜拉伸的表征
- 将每个压头顶部的凹槽涂成白色，以在高速摄像时提供高对比度的背景。
注意：切勿将压头与板接触的边缘部分涂上涂料。 - 使用聚乳酸（PLA）进行3D打印，或采用其他方式制备一个圆柱形印章，用于在每个孔中制作点状标记。将圆柱体制成直径5.9 mm、高12.2 mm，并在顶部中心设置一个直径1.5 mm、高1.0 mm的圆柱形凸起。
注意：可3D打印的模型“stamp.STL”可作为补充文件获取。 - 将培养板正面朝上进行等离子处理，以活化孔内的硅胶细胞培养表面，处理时间为60秒，具体操作见步骤2.1。
- 将培养板置于橡胶垫或其他柔软表面上。用永久性记号笔将墨水涂在印章的小突起上（参见步骤4.2）。将印章插入待测孔中，并轻压以确保墨水良好转移。每检测一个孔前均需重新蘸取墨水并润饰印章。
- 对压痕块进行对齐，并润滑损伤装置的压头（参见步骤 3.2–3.3）。将培养板固定在损伤装置的载物台上。在损伤装置上方放置一个明亮的漫射轴向光源。
- 在损伤装置上方的悬臂架上安装一台高速摄像机，镜头垂直向下，将光圈调至最小编号的f值，然后打开摄像机。启动与摄像机相连的计算机上的摄像软件。在帧率下拉菜单中选择每秒2,000帧，在快门下拉菜单中选择能够获得高对比度图像的最快曝光时间。将摄像机视野中心对准带点的孔位。
- 将相机定位，使视野包含以 3 行 4 列排列的 12 个孔。
注意：此视野范围在通量和分辨率之间为1,280提供了一个最佳折衷方案 × 1,024 张图像
- 将相机定位，使视野包含以 3 行 4 列排列的 12 个孔。
- 将平板降至零点（参见步骤 3.2.4-3.2.6）。单击相机软件上的记录按钮，使其显示 触发输入启动位置追踪器VI（步骤3.4.4）。
- 打开明亮的漫射轴向光源。按照步骤 3.4.6 中所述对平板进行压痕。
- 关闭明亮的漫射轴向光源。
- 在相机控制计算机上，找到录制视频中压痕发生的30-40毫秒时间段：在相机软件的高速视频播放条中拖动起始和结束箭头。点击“保存”，在“文件名”字段中设置名称，在“格式”字段中选择“TIFF”，然后点击“保存”。
- 查看 .TIF 文件，找出拉伸程度最小（起始状态）和最大（最大压痕状态）的图像。
- 使用 Fiji 将最小拉伸和最大拉伸的图像并排打开，以测量两个图像中各点的高度和宽度。使用默认的矩形选择工具，在最小拉伸图像中点击并拖动，围绕一个点绘制一个矩形框。通过“分析｜测量”功能测量其高度和宽度。
- 对同一孔中峰值拉伸图像上的点重复上述操作。对剩余各孔重复此步骤。
- 计算拉格朗日应变 x 和 y 方向如下：
注意：此处， Exx 是拉格朗日应变在 x 方向 Eyy 是拉格朗日应变在 y 方向 X 是点的宽度， Y 是该点的高度， f 表示最终图像（即，峰值压痕图像），以及 i 表示初始图像（即，预压痕图像）。取这两个值的平均值以确定该孔中的应变。
5. 接种培养细胞
- 将用于灭菌的容器和配重块进行高压灭菌。
- 将硅胶底板正面朝上进行等离子处理60秒（见步骤2.1）。立即将其浸入含有70%乙醇的无菌容器中，静置15分钟。
- 将平板分别浸入装有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌容器中，静置30分钟。
- 吸除孔中的PBS。每次仅干燥一块板，以防止孔失去等离子处理效果。
注意：与刚性板相比，硅胶底板在移液时提供的触觉反馈较弱，更容易堵塞移液枪头。 - 向已灭菌的板中每孔加入100 µL的0.1 mg/mL多聚-L-鸟氨酸（PLO），于室温孵育1小时。
- 用100 µL无菌PBS清洗孔两次，第二次清洗后将PBS保留在孔中，直至细胞悬液准备就绪。
- 佩戴安全手套从液氮中取出hiPSCN冻存管，置于干冰上。迅速将冻存管转移至37 °C水浴中，准确解冻3分钟。切勿摇动冻存管。
- 在无菌操作台内，使用1 mL移液管将冻存管内容物轻柔转移至50 mL锥形管中。
- 用1 mL室温完全维持培养基（基础培养基 + 添加剂）冲洗空的冻存管。
- 以约每秒一滴的速度将1 mL培养基逐滴加入50 mL管中。边加边轻柔旋转混匀。随后以约每秒两滴的速度向50 mL管中加入8 mL室温完全维持培养基。
- 盖紧管盖并轻轻倒置混匀2–3次。使用血细胞计数板计数细胞，并计算所需额外培养基的体积，以将细胞悬液稀释至225,000个细胞/mL。
- 使用25 mL移液管，将上述计算出的培养基体积轻柔加入细胞悬液管中。
- 使用1,000 µL微量移液器，按每1 mL细胞悬液加入10 µL的1 mg/mL层粘连蛋白原液，使细胞悬液中层粘连蛋白终浓度为10 µg/mL。用同一枪头将溶液上下吹打一次，盖紧管盖后倒置混匀一次。
- 逐块吸除板中PBS。使用多通道移液器向每孔加入100 µL hiPSCN细胞悬液。每孔培养面积为0.33 cm2，因此细胞密度为67,500个细胞/cm2。
- 接种后将板在室温静置15分钟，以促进细胞贴壁。为避免无菌培养操作台风扇振动，将盖好盖的板置于实验台面上。将培养物置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
- 在24小时后进行全量换液，每孔补充200 µL完全维持培养基。此后每2–3天进行半量换液，每孔更换100 µL。
6. 损伤培养物
- 按照步骤 3.2 所述，对齐压痕块并找到零位。按照步骤 3.3 所述，对压头进行润滑。
- 在“位移追踪 VI”中设置位移历史记录的文件名（步骤 3.4.4）。在“运动控制 VI”中设置损伤参数（步骤 3.4.5）。
- 将待损伤的培养板从培养箱中取出，并将其固定在载物台上。调整盖子的位置，以固定培养板，同时避免培养物暴露于室温空气中。
- 使用“运动控制 VI”将培养板降至零点位置（步骤 3.2.4–3.2.6）。启动“位移追踪 VI”（步骤 3.4.4）。
- 使用运动控制 VI 对培养板进行压痕操作（如步骤 3.4.6 所述）。对于假损伤（sham）处理，仅跳过此步骤。
- 将载物台返回至其运动范围的顶部位置（见步骤 3.4.7）。将培养板放回培养箱中。
- 检查并保存位移轨迹（如步骤 3.4.8 所述）。
7. 显微镜观察
- 在维持培养基中配制 10 倍浓度的染色液，其中含 2 µg/mL Hoechst 33342 和 5 µg/mL Calcein AM。
- 每孔加入 20 µL 10 倍浓度的染色液进行染色。
- 在 37 °C 条件下避光孵育 15 分钟。
- 采集宽场荧光图像。分别使用标准的 FITC 和 DAPI 滤光片组检测 Calcein AM 和 Hoechst 33342 信号。若多孔板成像序列耗时超过 10 分钟，应将培养板置于载物台培养箱中，以维持细胞状态。
注意：使用 10X、0.30 NA 的物镜即可获得足够清晰的图像，用于判断细胞活力和形态。调整增益以确保神经突起清晰可见，即使这会导致较明亮的胞体出现部分信号饱和。 - 在绿色 Calcein AM 通道中对活细胞图像进行分割，以识别胞体和神经突起。利用蓝色 Hoechst 33342 通道的细胞核图像辅助确定胞体位置。
结果
该拉伸装置能够以短至10–15 ms的脉冲持续时间重复移动载物台，具体时长取决于脉冲幅度（图2A）。脉冲幅度具有高度重复性，但脉冲持续时间在重复实验间大约存在1 ms的波动。当加载的孔数量较多且设定的脉冲幅度较高时，实际脉冲幅度会偏离设定值（见图2B）。当载物台位移幅度超过3 mm后，实际位移幅度逐渐低于设定的位移幅度（见图2B）。通过仔细对准柱状块，可消除膜应变在行或列方向上的趋势性差异（图2C）。在设定载物台位移幅度为3.5 mm（实际位移幅度为3.3 mm）、52个孔被压痕的条件下，所有孔位置的平均拉格朗日应变为0.451（各位置均值的标准差为0.051，各位置标准差的平均值为0.065，每孔n = 5次测量）。此处展示这些结果以保证完整性，尽管其中部分结果已有报道11。
理想的、未受损伤的培养物中，成团的细胞应极少或没有，且每个团块包含的细胞数不超过5个。神经突应为独立、细长、纤细且弯曲的形态，几乎或完全没有张力或串珠样改变的迹象（图3A）。在理想条件下，培养物的存活率应接近制造商数据表中注明的存活率（通常为60–70%），并且在硅胶基质上的培养物应与在传统刚性培养基上维持的培养物相似（图3B）。在低倍明场显微镜下，神经突可能可见，也可能不可见。层粘连蛋白浓度和细胞密度均会影响培养物在基础状态及损伤后的表现。增加细胞密度会增加培养物中形成的细胞团数量和大小。提高层粘连蛋白浓度通常可抵消这一效应（图3A）。然而，过高的层粘连蛋白浓度会降低培养物对损伤的敏感性（图4）。对于未受损伤的培养物，最佳层粘连蛋白浓度为50 µg/mL（图3）；但为了在假处理组与拉伸损伤组之间获得最佳区分效果，最佳浓度为10 µg/mL的层粘连蛋白（图4）。较高的层粘连蛋白浓度在较早时间点会降低培养物对损伤的敏感性（图4），但在较长时间点（例如，7天）可改善基础细胞存活率。综上所述，针对每种实验条件优化层粘连蛋白浓度是值得的。
膜应变、损伤后成像时间点、层粘连蛋白浓度和细胞密度均对每个细胞的神经突长度具有高度统计学显著性的主效应（ANOVA，p <0.001）。膜应变对每个细胞神经突长度的影响与损伤后成像时间点和层粘连蛋白浓度之间存在高度统计学显著性的交互作用（ANOVA，p <0.001），并与细胞密度存在统计学显著性的交互作用（ANOVA，p <0.05）。类似地，膜应变、损伤后成像时间点、细胞密度和层粘连蛋白浓度均对细胞活力具有高度统计学显著性的主效应（ANOVA，p <0.001）。膜应变对细胞活力的影响与损伤后成像时间点之间存在高度统计学显著性的交互作用（ANOVA，p <0.001），并与细胞密度存在统计学显著性的交互作用（ANOVA，p <0.05）。这些结果证明，时间点、细胞密度和层粘连蛋白浓度对施加的损伤与实验结果之间的关系具有重要影响，因此每一项都应仔细优化。
细胞存活率低、神经突出现串珠样改变以及神经突生长受阻，提示培养环境存在毒性，这可能是由于硅胶制备不当所致。若省略或缩短水浸泡或烘箱干燥步骤，膜中可能分别残留吸收的乙醇或水分，这些物质可扩散至培养基中，对细胞造成应激。严重损伤的培养物表现为细胞存活率降低、神经突缩短或缺失、出现串珠样神经突，以及神经突呈现紧绷或受张力状态。损伤可能诱导原本分散良好的细胞发生聚集。较大的细胞团块会干扰形态学分析。进行形态学分析时，应调节损伤程度，使细胞发生明显变化的同时，仍有部分细胞及其神经突存留。
图1：损伤装置的标注示意图。（A）顶视图，（B）等距视图，（C）前视图，（D）右侧视图。比例尺适用于正交视图（A、B 和 D）。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：机械刺激的运动学特征。（A）在未加载任何孔板的情况下，5次脉冲过程中平台位移随时间的变化曲线，对应一系列预设振幅（预设振幅值见图例）。（B）在加载52个孔板的情况下，10次脉冲过程中平台位移随时间的变化曲线，对应一系列预设振幅（预设振幅值见图例）。（C）各孔在平台位移振幅为3.3 mm时的平均应变（每孔n = 5次测量，每孔平均标准误差 = 0.029）。注意：C4-F4和C9-F9为未拉伸的对照孔。该图经Sherman et al.11 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3硅胶上培养条件的优化 (A) 细胞密度和层粘连蛋白浓度对硅胶基质上 hiPSCN 培养的影响。细胞聚集程度随细胞密度增加和层粘连蛋白浓度降低而增强。必须优化细胞密度和层粘连蛋白浓度以获得单分散培养。单分散培养在定量分析过程中不易产生人为假象。请注意，动态范围已调整以优化神经突的可视化效果，因此亮度更高的胞体出现信号饱和。相比以胞体为基准优化动态范围而导致较暗的神经突几乎不可见的情况，本呈现方式更为可取。红色方框标示的条件被认为是最优的 体外 拉伸损伤实验。 (B在最佳条件下，硅胶膜上的培养物与传统刚性基质上的培养物形态相似。左图显示在33,750个细胞/cm²密度下培养的人诱导多能干细胞来源的神经元（hiPSCNs）2 与 3.3 µg/mL 层粘连蛋白在常规刚性96孔板上的分布（细胞培养基底为经组织培养处理的环烯烃共聚物）。右侧面板重现了（A）中红色框选区域的图像。比例尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4损伤表型及其对层粘连蛋白浓度的依赖性 (A健康培养，使用 10 µg/mL 层粘连蛋白和67,500个细胞/cm2神经突长，无串珠样改变。死亡细胞核较少，且细胞聚集体较少。B) 在相同培养条件下培养，经57%峰值应变损伤后4小时进行成像。神经突出现缩短或缺失，部分神经突呈现串珠样改变（箭头所示）。Calcein AM阳性细胞减少，Calcein AM阴性细胞增多即，死亡）的细胞核。损伤导致存活细胞之间的聚集增加。C损伤后4 h，每细胞神经突长度随应变增加而下降，且该变化依赖于层粘连蛋白浓度。D损伤后4 h，细胞活力随应变增加而下降，且该变化依赖于层粘连蛋白的浓度。E损伤后24小时，每细胞的神经突长度随应变增加而下降，且该变化依赖于层粘连蛋白的浓度。F损伤后24小时，细胞活力随应变增加而下降，且该变化依赖于层粘连蛋白的浓度。（每组n = 4，误差线表示） ± 1 个标准差，比例尺 = 100 µm）。应变值是根据先前Sherman发表的研究数据，通过台阶级位移推导得出 等11 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充图1：压头的技术图纸。 请点击此处下载该图。
补充表1：自制设备。 请点击此处下载该表格。
补充表 2：96 孔板加载器针脚接线图。 请点击此处下载该表格。
补充代码文件1：损伤装置的计算机辅助设计图纸。 请点击此处下载该文件。
补充代码文件2：平板制备夹具的计算机辅助设计图纸。请点击此处下载该文件。
补充代码文件3：印章几何结构的3D表示，适用于3D打印机使用。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 4：MuStLiMo_si_initialize.vi 的子程序（SubVI），该子程序用于 motion_control.vi，用于将对话框中的输入转换为运动控制参数。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 5：Multiple Straight Line Moves_simplified.vi，是 motion_control.vi 的一个子VI。用于将对话框中的输入转换为运动参数。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 6：position_tracker.vi 的子虚拟仪器。计数器用于跟踪来自线性编码器的位移输入。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 7：基础 LabVIEW 项目。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 8：用于移动设备的顶层 VI。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 9：motion_control.vi 的子VI。用于执行快速位移以拉伸培养板。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 10：motion_control.vi 的子虚拟仪器。执行移动载物台的缓慢位移。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 11：motion_control.vi 的子虚拟仪器。在 motion_control.vi 控制面板中绘制（通常为欠采样）位移历史曲线。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 12：用于记录位移历史的顶层 VI。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 13：包含在 motion_control.vi 与 position_tracker.vi 之间进行通信的 Variable2。请点击此处下载该文件。
补充代码文件14：印刷电路板示意图。 请点击此处下载该文件。
补充代码文件15：印刷电路板布局。 请点击此处下载该文件。
讨论
在此模型中获得稳定且符合生物真实性的表型的关键在于施加一致且符合生物真实性的机械损伤。该模型可产生的脉冲持续时间最短可达10–15毫秒，与根据尸体实验测得的人类头部撞击脉冲持续时间相似12,13。这种机械损伤的一致性取决于压头板与压痕块的对准情况以及压头润滑的一致性。当压痕块对准良好时，施加的应变在行或列之间无明显趋势（图2C）。通常，薄层润滑剂产生的摩擦小于厚层润滑剂，不推荐使用黏稠的润滑脂，因其会污染硅胶材料并在显微镜观察时阻碍光线透过。当使用多个压头且设定的载物台位移幅值较大（> 3 mm）时，实际的载物台位移幅值可能显著低于设定值。然而，尽管在大幅值下实际位移小于设定位移，其仍具有良好的可重复性（图2B）。因此，通过输入高于期望值的设定值，可可靠地获得较大的实际位移幅值。位移幅值的重要性仅在于它是膜峰值应变的一个易于记录的替代指标，而膜应变直接反映了诱导病理变化的机械损伤程度。因此，从载物台位移确定膜应变的步骤至关重要。如果对系统进行了任何影响培养板与压头之间相互作用的重大更改（例如使用不同直径的压头、不同材质或涂层的压头，或不同类型的硅胶底培养板），则应重复该过程。每次实验开始前，均应重新校准压痕块并对零位进行确认。拉伸装置的示意图见图1。用于复现该装置的CAD模型作为补充材料提供：‘Injury Device - FULL ASSEMBLY - Generic 3D.STEP’；相关物料清单以‘补充表1：定制设备物料清单.xlsx’形式提供。另见补充表2 96孔板_加载器-引脚接线图.xlsx，其中描述了连接系统各组件的电缆连接方式。‘Interconnector_circuit_board.dip’文件描述了一块用于连接电缆的电路板。
如果设备在载物台处于行程中间附近时被关闭，由于装置具有弹簧加载机制，断电后载物台仍会移动。当电源恢复时，反馈回路会检测到最后已知的设定位置与实际位置之间存在较大偏差。这将导致载物台突然移动至设备关闭时所处的位置。这种突然的运动可能导致编码器输出出现错误，因此应特别注意，仅在载物台处于断电静止位置（即行程顶端）时关闭设备。
制作夹具的设计目的是以允许最佳粘合的方式将板体与硅胶底面压合在一起。为此，补充文件“Press Die - Generic 3D.STEP”中提供的设计包含三个关键特征。第一，夹具的板体固定部分与硅胶底面保持平行。若该结构加工准确，则在初始设置完成后无需进一步调整。第二，夹具中的泡沫橡胶层在板体下方提供轻微的顺应性，因为完全刚性的系统在夹具闭合时理论上会从零夹紧力突变为无限大的夹紧力。第三，夹具的横杆和调节螺钉位置可调，以便精确微调夹具两侧之间的距离。
在菌株表征实验期间，应尽量确保微孔底部小点后方具有明亮、均匀的白色背景。图像对比度越高，就越容易自动测量小点的高度和宽度，这对于需要人工分析大量实验数据的操作人员而言可显著减轻工作负担。对96孔板中微孔底部进行高速摄像时存在挑战，因为微孔壁容易产生阴影。使用穹顶式照明或漫射同轴光源可沿相机视轴方向提供照明，同时不会遮挡成像视野，从而消除传统光源可能引起的阴影或镜面反射。应采用可获得的最亮光源，因为强光照允许以较短曝光时间采集图像，而短曝光时间可最大限度减少运动模糊。升级漫射同轴光源中的发光二极管（LED）可在高速视频采集过程中实现更短的曝光时间。可通过打开漫射同轴光源装置，移除原装LED，使用LED支架将4组高功率LED阵列安装至后板，将其连接至恒流电源，并重新组装漫射同轴光源来完成升级（参见材料表中的目录编号）。升级LED的缺点是，由于存在过热风险，被动散热的LED无法持续点亮超过数秒钟。因此，在进行柱块定位和相机调节时，需要使用另一种光源。
通过测量印在膜上的点的扩张程度来量化膜应变的方法相对粗糙，但能够以稳健的方式扩展至多个孔。可使用数字图像相关技术更详细地表征孔底部的应变场。该技术涉及在孔底部喷涂斑点图案，并在变形过程中进行高速成像。随后可使用商业软件通过追踪斑点图案的变化，量化图像中每个点的应变。
本方案可在hiPSCNs中产生一种多维度、具有临床相关性的拉伸损伤表型。细胞死亡、神经突退化和神经突串珠样变是人类及动物模型中创伤性脑损伤（TBI）中已有充分记录的继发性病变15。该模型成功的关键在于建立并维持健康的细胞培养体系。通常而言，采用传统刚性培养板开发的细胞培养方案可作为可拉伸培养板培养的良好起点。然而，必须始终考虑目标细胞在硅胶材料上可能表现出不同的反应。这一点对于对培养条件极为敏感的hiPSCNs尤为关键。有关优化细胞密度和层粘连蛋白（laminin）浓度的示例见代表性结果部分（图3、图4）。通过等离子体处理对硅胶进行活化至关重要。硅胶本身具有疏水性和化学惰性；在自然状态下，其无法与层粘连蛋白或其他用于促进细胞贴附的分子结合。等离子体处理可使表面变为亲水性，并暴露出反应性基团，从而允许黏附分子与硅胶结合，促进细胞贴附。需要注意的是，除非表面浸没于液体中，等离子体处理的效果会在数分钟内迅速减弱，因此涉及活化表面干燥的操作应尽快完成。一种简单的检测等离子体处理效果是否失效的方法是在表面滴加一滴水：在未经处理的硅胶表面，水滴会形成珠状；而在经等离子体处理的表面，水滴则会铺展开来。对于我们所使用的hiPSCNs（参见材料表），制造商建议将层粘连蛋白与细胞悬液一同加入，而非预先包被。本方案已成功采用了这一方法。理论上，图像分割可通过开源软件或通用编程语言实现，但要获得良好结果，需具备较高的工具使用熟练度。由于神经突极为纤细，常难以与背景信号区分。因此，若条件允许，我们推荐使用高内涵显微成像公司提供的商业软件工具，其通常配备专用于神经元分割与定量分析的模块。即使使用商业软件，也建议导出分割图像以进行目视检查，确认其准确性。
与使用传统的刚性培养板相比，使用可拉伸培养板存在一些局限性。可拉伸培养板可使用空气物镜进行常规成像。然而，使用浸没物镜成像则非常困难。浸没油可能损坏硅胶材料。此外，当物镜向上移动时会对硅胶膜施加压力，这种压力会导致膜在垂直方向上发生位移，从而难以将样品聚焦清晰。目前用于制造培养板的硅胶膜厚度约为 250 µm，这一厚度超过了多数高倍浸没物镜的焦距范围。在夹紧前必须特别小心地将膜完全展平，以达到显微镜观察所需的平整度。自动对焦系统可在一定程度上补偿成品培养板表面平整度的偏差。未来版本的实验方案可能会在将膜与培养板上盖键合前预先施加张力，以确保其平整。采用无需胶粘剂的方法将硅胶膜与培养板上盖进行键合14，被认为是当前实验方案的重要优势。该方法避免了胶粘剂可能引起的神经毒性风险，同时也消除了因胶层厚度不均而导致的平整度偏差问题。
多电极阵列通常用于人诱导多能干细胞神经元（hiPSCNs）实验中，以评估其成熟度和功能。然而，这些系统与该模型不兼容，因为细胞培养基质是刚性的。尽管目前已仅在单孔格式中实现过，但有可能制备出可拉伸的多电极阵列。16,17注意，压痕头可从压痕头模块中单独移除，从而使部分孔不进行压痕处理，作为假手术对照。移除压痕头可避免产生压痕，但并不能完全消除机械负荷，因为在载物台运动过程中，孔内液体仍存在惯性运动。值得比较的是 这些 将孔板中的孔转移到从未经历过载物台移动的孔板中，以测量流体运动可能带来的病理影响。此外，压痕模块中的压头阵列应具备双对称性（前后对称且左右对称）。这一预防措施可确保在压痕过程中孔板受力均匀，避免载物台发生侧向倾斜，导致压杆在轴承中卡滞。
神经创伤治疗创新面临的主要挑战之一是该疾病的复杂性和异质性。创伤会同时对中枢神经系统中的每种细胞类型施加多模式的应激。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）已可稳定地分化为神经元，目前这类细胞已由多家商业供应商广泛提供。该领域的创新进展迅速，其他神经细胞类型（如星形胶质细胞）的研究也在不断推进18 和小胶质细胞19 也正在从hiPSCs中获得。不久的将来，或许能够分离出这些细胞类型对创伤所表现出的细胞自主性反应。 体外 然后共培养不同类型的细胞，以了解创伤后它们之间的通信机制。通过这种方式，最终有可能从底层逐步重建临床挑战，在人类系统中对其进行彻底研究。该方法不同于依赖啮齿类动物模型的传统方法，有望为这种常见、严重且难治的疾病提供全新的见解，并推动首个有效疗法的诞生。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院资助（项目编号：R21NS098129）。我们感谢陈 SueSan、Tan Jonathan、Cavanaugh Courtney、Ng Shi Kai 和 Bu Feng Yuan 提供的出色技术支持，他们设计并搭建了用于本文所述高速成像实验中的光源支撑结构。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| .010" 硅胶片 | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | 聚二甲基硅氧烷（PDMS）片 |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | 无底96孔板 |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| 烘焙纸 | Reynolds | N/A | |
| 圆顶光源 | CCS inc | LFX2-100SW | |
| 圆顶光源电源 | CCS inc | PSB-1024VB | |
| 轴向漫射照明单元 | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | 漫射轴向光 |
| 高功率LED阵列 | CREE | XLamp CXA2540 | 高功率LED阵列 |
| LED支架 | Molex | 1807200001 | LED支架 |
| LED电源 | Mean Well | HLG-320H-36B | 恒流电源 |
| FastCam Viewer软件 | Photron | 相机软件 | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | 高速相机 |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | 高速相机镜头 |
| 0.1 mg/mL 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell培养基 | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell添加剂 | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| 音圈电机 | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| 光学线性编码器 | Renishaw | T1031-30A | |
| 伺服驱动器 | Copley Controls | Xenus XTL | |
| 控制器 | National Instruments | cRIO 9024 实时PowerPC控制器 | |
| cRIO机箱 | National Instruments | cRIO 9113 | |
| 数字输入模块 | National Instruments | NI 9411 | |
| 数据采集机箱 | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | 仪器控制软件 | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International |
参考文献
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