本方案介绍了一种新型 体外 更适当地模拟该过程的珠式分析法 体内 通过引入周细胞来模拟出芽性血管生成。该改进使微球实验能够更真实地重现血管生成过程中内皮细胞与血管壁细胞之间关键的异质性细胞相互作用。
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摘要
摘要
血管生成是指从已有血管中形成新血管的过程，是多种生物过程的重要组成部分，包括胚胎发生与发育、伤口愈合、肿瘤生长与转移，以及眼部和心血管疾病。有效 体外 需要能够重现血管生成生物学特性的模型，以恰当地研究这一过程，并鉴定出可作为新型治疗策略靶点的调控机制。珠状血管生成实验已被证实可重现内皮细胞出芽的多个阶段。 体外 然而，该检测方法的一个局限性在于缺乏内皮细胞与壁细胞之间的相互作用, 这对于内皮细胞功能的分子和表型调控至关重要 体内本方案介绍了一种将壁细胞整合到微珠血管生成实验中的方法，并展示了在出芽过程中内皮细胞与周细胞之间的紧密关联。 体外该方案还详细阐述了在内皮细胞中利用siRNA有效沉默目标基因以进行机制研究的方法。总体而言，本方案提供了一套完整的 体外 一种更适于模拟出芽型血管生成过程中多种细胞类型的检测方法，并为血管生成调控机制的治疗评估和新发现提供了更具生理相关性的研究平台。
引言
血管生成对于正常的胚胎发育和伤口愈合至关重要，同时在多种疾病（包括癌症进展）中也发挥着关键作用1 以及冠状动脉疾病。2,3 深入了解血管生成在正常发育过程中的发生机制，以及其在病理条件下如何被重新激活，对于开发新型且有效的治疗手段至关重要。忠实 体外 能够重现血管生成过程中关键阶段和细胞类型的模型 体内 有助于研究人员更深入地表征驱动血管生成的分子机制，并在内皮调控领域取得新发现。
中村和休斯优化了一种出芽微珠实验方法，该方法已被证实能够经历出芽性血管生成的多个已知阶段。4,5 本方法旨在通过将周细胞引入Nakatsu和Hughes优化的实验体系，进一步研究血管壁细胞在内皮细胞出芽过程中所发挥的旁分泌和邻分泌作用，从而为新型血管生成研究提供支持。周细胞是一类血管壁细胞，其特征在于能够与内皮细胞保持紧密的物理接触，这是因为它们嵌入于血管基底膜中。6 周细胞与内皮细胞通过包括 Notch 信号通路、Ang-Tie2、PDGFRβ、TGFRβ 以及许多其他信号通路进行复杂的相互作用。7,8 信号通路缺陷的小鼠模型在胚胎发育过程中表现出血管生成时周细胞覆盖不足，导致血管重塑不良和功能异常的血管系统。7 此外，周细胞在病理性血管生成中的作用十分重要，但常常被低估。例如，肿瘤血管系统的一个独特特征是血管更为幼稚、渗漏且功能异常，这是由于周细胞覆盖不足所致。9 有研究提出，周细胞的存在或缺失会显著影响肿瘤血管的表型，并在抗血管生成治疗和抗肿瘤治疗的应答中发挥重要的调节作用。9 因此，包括周细胞的作用在内 体外 检测内皮调节的重要机制，全面捕捉其关键作用。
尽管有许多 体外 和 离体 目前用于研究血管生成的检测方法均存在各自的局限性。例如，内皮细胞增殖和内皮细胞迁移检测过于简化，仅在组织培养塑料表面的孤立环境中针对单一内皮细胞功能进行评估。10 其他检测在更接近三维（3D）的环境中进行，例如Matrigel管形成实验，10 但这些检测方法仍然过于简化，主要关注内皮细胞迁移和形成的能力 从头合成 血管结构，而非从已存在的脉管系统中出芽形成。此外，这些检测方法均未纳入壁细胞类型。目前尚无 离体 例如环形主动脉实验等模型确实包含了宿主器官中的周细胞，但这些模型的遗传操作极具挑战性，因为需要构建与目标通路相关的基因敲除或转基因小鼠模型。微球出芽实验则更为理想，因其可在三维基质中模拟内皮细胞的出芽、增殖、迁移，甚至吻合和管腔形成。4 该检测方法能够忠实地对出芽过程的多个不同阶段进行机制性评估，同时仍可在更受控的条件下对内皮细胞或周细胞进行直接的遗传修饰。含有出芽微珠的纤维蛋白凝块可在出芽的不同阶段被轻松固定、染色并成像；这些出芽结构也可置于活细胞成像腔中，以实现对出芽过程的实时成像。本文所述方法适用于通过深入的表型分析及对血管生成过程中激活通路的全面分析，来研究血管生成的基本机制。
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方案
第1天：
1. 内皮细胞的瞬时转染
- 如需进行，可使用基因调控寡核苷酸（例如 micro-RNAs 或小干扰 RNA (siRNA)）及适当的脂质体转染试剂，按照制造商说明书对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行瞬时转染。
注意：本方案在使用定制 siRNA 序列和商用转染试剂进行反向转染时取得了良好效果（参见材料表）。作者未测试其他转染方案和试剂与本实验的兼容性。使用所列试剂进行反向转染的步骤如下： - 用无核酸酶水将冻干的 siRNA 或 microRNA 重悬至浓度为 20 µM。
- 按以下比例配制转染溶液：每 1 mL 无血清培养基中加入 9 µL siRNA 或 microRNA。
- 轻轻振荡溶液，并于室温孵育 5 分钟。
- 向溶液中加入 18 µL 转染试剂，振荡混匀。
- 将溶液于室温孵育 20–40 分钟，在孵育期间每隔 10 至 15 分钟振荡一次。
- 在转染溶液孵育的同时，使用细胞解离液（例如 Accutase）消化 HUVEC。对于 T175 培养瓶，先用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入 5 mL 细胞解离液，于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 向 T175 培养瓶中加入 5 mL 完全培养基，收集细胞悬液并以 1200 rpm 离心 3 分钟。
- 用真空抽吸法弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 EGM2 培养基中，密度为 1 × 106 个细胞/mL。
注意：本方案使用含标准生长因子子弹套装及额外添加 10% FBS 的内皮细胞生长培养基（EGM2），效果良好。 - 转染溶液完成孵育后，向 10 cm 培养皿中加入 1 mL 该溶液，再在其上加入 1 mL HUVEC 悬液。
- 额外加入 7 mL 完全培养基，使 10 cm 培养皿中的终体积达到 9 mL。
- 每种转染条件至少制备两个 10 cm 培养皿的细胞，以确保后续实验步骤有足够的细胞量。
注意：该条件下的基因调控寡核苷酸终工作浓度为 20 nM。作者发现该条件可使其目标基因的表达降低 60–80%。其他研究人员可能需要根据实验需求优化转染条件。 - 在加入 siRNA 复合物后 4–6 小时更换为新鲜的完全培养基。
注意：本方案使用第 1 至第 2 代 HUVEC 开发而成。
第2天
2. 内皮细胞包被微载体珠
- 用 PBS 将微载体珠（例如，Cytodex 3）重悬至浓度为 60,000 珠/mL，并进行高压灭菌。
注意：微载体珠的初始浓度约为每克 3 × 106 珠。按每毫升 PBS 中加入 20 mg 微载体珠的比例进行重悬，可获得约 60,000 珠/mL 的珠密度。 - 将 1 mL 完全培养基分装至所需数量的圆底荧光激活细胞分选（FACS）管中。
- 向每根 FACS 管中加入 20 µL 微载体珠悬液（加样前需确保珠悬液充分重悬）。
注意：不同批次的微载体珠悬液中，其最终工作浓度可能存在显著差异。珠子容易黏附在塑料或玻璃容器壁上，从而显著改变溶液中的珠子浓度。因此，每批微载体珠悬液加入 FACS 管中的最适体积需由研究者通过实验确定。此处提供的数值仅作为起始参考。理想情况下，应在实验结束时使 24 孔板中每个孔的纤维蛋白凝胶内嵌入 10–20 个珠子。有关珠子数量优化的进一步讨论，请参见下文讨论部分。 - 转染后 24 小时，使用细胞解离液解离转染的 HUVEC，操作如下：
- 用 5 mL PBS 洗涤每块 10 cm 培养皿中的细胞，然后加入 2 mL 细胞解离液，在 37 °C 下孵育 10 分钟。
- 将细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的浓度重悬于完全培养基中。
- 向每根含珠子的 FACS 管中加入 1 mL 细胞悬液（即 1 × 106 个 HUVEC）。
- 在 37 °C 下持续轻柔振荡 FACS 管 4 小时（若继续进行步骤 3.4）或 2.5 至 3 小时（若继续进行步骤 3.2），每隔 20 分钟振荡一次。
注意：该振荡时长和频率是先前研究者在优化基本珠出芽实验时通过实验确定的4。作者未测试其他振荡频率或包被步骤的其他持续时间。
3. 在 HUVEC 包被的微载体珠上依次包被周细胞
- 使用细胞解离液（胰蛋白酶）开始解离10T1/2细胞（周细胞），步骤如下：
- 用10 mL PBS清洗T175培养瓶，然后加入5 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育10分钟。
- 将10T1/2细胞以2 × 105 个细胞/0.5 mL的浓度重悬于完全培养基中。
注意：细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。
注意：将10T1/2细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基（MEM）中。
- 在将微珠与HUVEC细胞混合液振荡2.5至3小时后，静置5分钟，使微珠和游离的HUVEC细胞沉降至管底。
- 使用P1000移液器从每根管中移除0.5 mL完全培养基，并向每根FACS管中加入含2 × 105 个10T1/2细胞的0.5 mL完全培养基。轻轻振荡细胞与微珠混合液，随后继续在37 °C孵育。此后每20分钟振荡一次，直至总振荡时间达到4小时。
注意：微珠上HUVEC与周细胞的比例为5:1，此比例对维持血管上适当的周细胞覆盖率至关重要。
注意：在本步骤中，可选择执行以下替代操作： - 仅将微珠与HUVEC细胞振荡4小时。
- HUVEC细胞在微载体微珠上的包被完成后，最后一次振荡试管，静置30-60秒，然后立即从FACS管中移除1.5-1.75 mL上清液。
注意：此操作应足以使大部分微珠沉降，同时去除培养基中大量游离的HUVEC细胞。- 向FACS管中加入含2 × 105 个10T1/2细胞的完全培养基，并将总体积补至2 mL。
- 在接下来的1小时内，每20分钟轻轻振荡FACS管一次。
- 振荡完成后，最后一次轻轻振荡试管，立即转移全部溶液（2 mL）至6 cm培养皿中。向每个培养皿中额外加入3 mL完全培养基，并将培养皿置于37 °C培养箱中过夜孵育。
第3天
4. 纤维蛋白凝胶溶液的制备
- 用 PBS 配制浓度为 1 mg/mL 的抑肽酶工作液和浓度为 50 单位/mL 的凝血酶工作液。
注意：可大量配制上述溶液，并在 4 °C 下保存至少一年。 - 新鲜配制浓度为 2 mg/mL 的纤维蛋白原溶液。每根需振荡的 FACS 管准备 2.5 mL 溶液。
- 将溶液置于 37 °C 水浴中加热 10 分钟，使纤维蛋白原完全溶解。
- 每 1 mL 纤维蛋白原溶液中加入 37.5 µL 抑肽酶溶液。
- 对溶液进行无菌过滤，并在室温下放置备用。
5. 凝胶植入前微珠的制备
- 使用20倍物镜在显微镜下检查含有微载体包被珠的培养皿，确保所有珠子均已充分被内皮细胞包被。
- 用力吹打已接种的细胞溶液，使细胞从6 cm培养皿上脱离，并将溶液转移至 离心管中。再用完全培养基额外洗涤培养皿两次，并将洗涤液转移至同一离心管，以收集可能黏附在培养皿上的所有残留珠子。
- 避免引入气泡，并使用P1000移液器以尽量减少对内皮细胞包被珠的剪切应力。
- 若需评估内皮细胞中siRNA的敲低效率，在步骤2中应保留一皿仅包被HUVEC的珠子。随后在此步骤（5.2）中，将珠子从培养皿上脱离，并收集残留附着于培养皿的HUVEC，用于RNA提取和qPCR分析。
- 静置3分钟，使溶液中的珠子沉降到离心管底部。
- 使用P1000移液器吸头尽可能吸除上清液，注意不要扰动管底的珠子沉淀（切勿使用真空抽吸装置）。
- 向每根离心管中加入1 mL完全培养基，并重悬珠子。
- 静置30–60秒，使珠子重新沉降到管底。然后使用P1000移液器尽可能吸除上清液，注意不要扰动珠子沉淀。切勿使用真空抽吸装置，以免意外吸走珠子沉淀。
- 重复步骤5.5和5.6共两次。目的是尽可能去除从6 cm培养皿上脱落的游离HUVEC，同时尽量保留HUVEC包被的珠子，因为包被珠子在FACS管中的沉降速度明显快于游离细胞。
- 向珠子中加入1 mL完全培养基。
6. 将包被微珠嵌入纤维蛋白凝胶中
- 使用 P1000 移液器尽可能吸除培养基，注意不要扰动各 FACS 管中的珠粒沉淀。
- 将珠粒重悬于 2.5 mL 纤维蛋白原溶液中。
- 将 13 µL 凝血酶溶液加入 24 孔玻璃底培养板中所需孔内。使用玻璃底培养板对于实现血管出芽的最佳成像至关重要。
注意：在进行下一步操作前，凝血酶在孔中静置时间不得超过 5–10 分钟。 - 向每孔中加入 0.5 mL 珠粒/纤维蛋白原混合溶液。
- 每次移液前，务必充分重悬珠粒溶液。
- 小心地将移液枪头直接插入孔中已存在的凝血酶液滴内，缓慢吹打混合 2–3 次，确保溶液充分混匀，注意避免引入气泡。
- 务必在不同孔之间更换移液枪头。
- 在初始纤维蛋白凝胶形成过程中，切勿移动或扰动培养板，任何移动均可能干扰凝胶的形成。
- 将培养板置于超净台中，室温静置 30 分钟。
- 小心将培养板转移至 37 °C 培养箱中，继续孵育 1.5–2 小时，使凝胶完全固化。
7. 在纤维蛋白凝胶上接种成纤维细胞
- 在凝胶凝固的最后30分钟内，按以下步骤分离正常人肺成纤维细胞（NHLF）：
- 用10 mL PBS洗涤一个T175培养瓶中的细胞，然后加入5 mL细胞分离液，在37 °C孵育10分钟。
- 将NHLF以20,000个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中。
注：NHLF细胞可在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。
- 将1 mL NHLF细胞悬液接种至每个孔的凝胶表面，并放回培养箱中。
- 在实验期间每隔一天更换一次完全培养基。
8. 在纤维蛋白凝胶中植入微珠后，于2-7天内观察出芽情况。出芽所需时间取决于HUVEC的传代次数和批次号。
9. 萌发实验的固定
- 当出芽情况已足够明显，能够确定不同处理组之间的表型差异时，用 2 mL PBS 将所有孔清洗一次。
- 向每孔加入 0.5 mL 细胞解离溶液，并将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
- 从培养箱中取出培养板，轻敲板壁。
注意：此步骤的目的是尽可能去除生长在纤维蛋白凝胶表面的人肺成纤维细胞（NHLF），以促进抗体渗透进入凝胶，并便于对凝胶进行成像。可能需要调整细胞解离溶液的总孵育时间，以优化去除 NHLF 的效果。研究人员需注意，不要孵育过长时间，因为细胞解离溶液可能渗入凝胶内部，进而开始破坏其中的内皮结构。 - 当足够数量的 NHLF 细胞被去除后，加入 1 mL 完全培养基以终止细胞解离反应。
- 使用真空抽吸装置吸除脱落的 NHLF 细胞及培养基，并用 1 mL PBS 每孔清洗一次。
- 向每孔加入 300 µL 含 2% 多聚甲醛的 PBS 溶液，在室温下孵育 10 分钟。
- 移除 2% 多聚甲醛溶液，并用 1 mL PBS 每孔清洗三次，每次 3 分钟，室温进行。
注意：请根据环境健康与安全（EHS）指南，妥善处理 2% 多聚甲醛溶液。- 向每孔加入 1 mL PBS，并在 4 °C 保存，直至准备对出芽结构进行染色或成像。
10. 萌发实验的染色
- 向每个孔中加入 300 µL 含 0.5% Triton-X 100 的 PBS 溶液，在室温下孵育 30 至 45 分钟。
- 使用真空吸液器吸除 Triton-X100 溶液，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 向每个凝胶中加入 500 µL 封闭液，在 4 °C 下孵育过夜。
注意：封闭液的成分为：1% 牛血清白蛋白（BSA）、5% 胎牛血清（FBS）、0.1% Tween-20 和 1% 抗血清（使用与二抗来源相同的物种）溶于 PBS 中。 - 移除各孔中的封闭液，向每个孔中加入含一抗的 300 µL 染色液。
注意：染色液成分与封闭液相同，但不含抗血清。作者发现将一抗以 1:200 至 1:400 的比例稀释孵育效果良好。 - 在 4 °C 下用染色液孵育一抗 24 小时。
- 吸除一抗溶液，用含 0.5% Tween 的 TBS 在室温下轻轻摇动洗涤 3 次，每次 20 分钟。第三次洗涤后，更换为新鲜洗涤缓冲液，于 4 °C 下过夜保存。
- 用染色液将荧光二抗稀释至 1:1000，在室温下孵育 2 小时。
- 移除二抗染色液，用含 0.5% Tween 的 TBS 在室温下轻轻摇动洗涤 5 次，每次 20 分钟。
- 将核染料用 PBS 稀释后，在 4 °C 下孵育过夜。
注意：本方案中使用 Hoechst 以 1:10000 的比例溶于 PBS 进行核染色效果良好。
注意：成像前无需移除核染色液。 - 染色完成后数日内进行成像，以获得最佳荧光信号。
11. 萌发实验的定量分析
- 成像完成后，将图像文件导入 ImageJ，使用计数工具统计芽状结构的数量，或使用线条工具测量芽状结构的长度。
注意：芽状结构定义为内皮细胞突出物，其长度大于或等于出芽微球的直径。11 芽状结构长度可测量自芽体从微球表面开始突出的点至芽体顶端的距离。每个微球的平均芽长和平均芽数是评估基因沉默对出芽性血管生成表型影响的有用指标。每组处理中至少含有一个芽状结构的微球的平均比例也可作为评估出芽强度的指标。
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结果
该方案可实现两种细胞类型之间的紧密关联 体外 周细胞的存在补充了出芽现象的发生（图1A，B）。该方案还能实现有效的沉默（例如 通过RNA干扰技术在特定细胞类型中对目标基因进行敲低（例如在内皮细胞中特异性敲低VEGFA，或在周细胞中特异性敲低PDGFRβ）7,12 在实验过程中，这可能导致出芽表型受到抑制。建议使用本方案的研究人员同时进行标准的仅含内皮细胞的出芽实验，以更全面地探究周细胞在所研究的血管功能和表型中的独特作用。
为获得能够充分包被且在纤维蛋白凝胶中稳定出芽的微珠（图2A、B），必须严格遵守本方案中所述的实...
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讨论
本方案介绍了一种通过使研究者能够运用遗传学和成像方法进行深入的机制研究，来表征出芽型血管生成过程中复杂阶段及异质性细胞间相互作用的方法。在进行该实验时，关键在于珠粒振荡步骤中必须实现内皮细胞对珠粒的有效包被。如果次日早晨在凝胶植入前珠粒表面未呈现出类似高尔夫球的粗糙外观，而是显得完全光滑，则表明内皮细胞包被效果不佳。在每次振荡过程中，应确保充分重悬珠粒，通过剧烈振荡离心管使珠粒表面最大程度地暴露于内皮细胞，但振荡力度不宜过大，以免导致已附着的内皮细胞从珠粒上脱落。
在将周细胞加入实验时，必须维持5个内皮细胞与1个周细胞的比例。周细胞过多会导致其在实验过程中过度生长并取代内皮细胞群体，而周细胞不足则会导致血管覆盖不充分。如果细胞密度适当但仍观察到周细胞对血管的覆盖不佳，可能需要调整与周细胞共孵育的时间。不建议调整细胞数量。另一种方法是仅用内皮细胞包被微珠4小时，然后通过重悬微珠和细胞溶液并在微珠沉降后、细胞沉降前移除培养基，从而将内皮细胞从培养体系中去除，随后加入周细胞，并每隔20分钟振荡一次，持续额外1小时。
将包被的微珠嵌入...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Victoria Bautch 博士和 Joshua Boucher 博士在优化标准微珠出芽实验条件及出芽实验染色方案方面提供的有益讨论和建议。 S.H.A. 的研究部分由美国国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 5T32 GM007092。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌移液器吸头 | VWR | ||
| 移液器 | Eppendorf | ||
| EGM2完全培养基弹药包试剂盒 | Lonza | CC-3162 | HUVEC培养基 |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2培养基 |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF培养基 |
| 组织培养级PBS | Gibco | 14190-144 | 无镁和钙 |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | 用于消化HUVEC细胞 |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 15050065 | 用于消化10T1/2和NHLF细胞 |
| 定制siRNA | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3微载体珠 | Sigma | C3275 | |
| 组织培养包被的6 cm和10 cm培养皿 | Corning | ||
| 牛血浆来源纤维蛋白原 | Sigma | F8630 | |
| 凝血酶 | Sigma | t9549 | |
| 抑肽酶 | Sigma | a3428 | |
| Falcon圆底管 | Corning | ||
| 组织培养用孵育箱和超净台 | |||
| 24孔玻璃底培养板 | MatTek | P24G1.513F | 仅当需要对出芽结构进行成像时才需使用玻璃底培养板；若无需成像，使用组织培养级塑料培养板亦可。 |
| 无菌过滤装置 |
参考文献
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