胆汁盐诱导肠道病原菌生物膜形成的鉴别和定量技术

摘要

该协议使读者能够分析胆汁盐诱导的肠道致病菌的生物膜形成, 采用多层面的方法来通过评估附着体、胞外高分子物质基质形成来捕获细菌生物膜的动态特性,和分散。

摘要

生物膜形成是一种动态的、多级的过程, 在恶劣的环境条件下或受压力的时代发生在细菌中。对于肠道病原体, 在胃肠道转运和胆汁暴露过程中, 引起了明显的应力反应, 这是人类消化的正常成分。为了克服胆汁的杀菌作用, 许多肠道病原体形成生物膜假说, 允许在小肠中转时存活。在这里, 我们提出了定义生物膜形成的方法, 通过固相粘附测定, 以及胞外高分子物质 (EPS) 矩阵检测和可视化。此外, 还提出了生物膜色散评估法, 模拟了在感染过程中引发细菌释放的事件的分析。在高通量的96井板粘附试验中, 用结晶紫染色法检测粘附细菌。eps 生产评价由两种方法确定, 即 eps 基质的显微染色和荧光共轭多糖结合凝集素的半定量分析。最后通过菌落计数和电镀来测量生物膜的分散性。来自多种化验的阳性数据支持生物膜的特性, 可用于鉴别其他细菌菌株中的胆汁盐诱导生物膜的形成。

引言

生物膜形成是恶劣环境条件下引起的一种重要的细菌生存策略。暴露在杀菌化合物如抗生素或营养或氧的变化, 导致细菌的压力状态, 可以通过生物膜形成缓解。生物膜的特点是细菌附着于表面或其他细菌, 并伴随着一个 EPS 矩阵的分泌, 主要由多糖^1,2,3。生物膜形成是一个动态过程, 其中一连串事件的高潮形成一个成熟的黏附细菌社区^1,2,3。细菌产生 adhesins, 以方便早期附着, 而转移黏附基因表达谱, 以加强附着在生物膜成熟。同时, EPS 生产发生在基质中覆盖细菌群落, 以保护细胞不受初始压力源的侵害。生物膜内含有的细菌生长缓慢;因此, 大多数抗生素都是无效的。此外, 缓慢的增长节省能源, 直到条件改变有利于细菌生长^1,2,3。在严酷的条件已经过去了, 细菌分散生物膜和恢复浮游生活方式^1,

方案

1. 试剂的制备

1. 胆汁盐培养基: 制备含有0.4% 胆汁盐 (重量/容积) 的胰蛋白酶大豆汤 (并用重悬), 50 毫升蒸压的200毫克胆汁盐。使用0.22 µm 过滤器进行杀菌消毒。每周制作新鲜媒体。
   注: 经常使用的胆汁盐是1:1 混合胆酸钠和脱氧钠, 从绵羊和牛胆囊分离。如前所示的⁴, 胆汁盐诱导的生物膜形成需要葡萄糖的存在。Luria-Bertani (磅) 汤增加了葡萄糖;因此, 在志贺菌和其他肠道病原体分析中, 足以诱发生物膜的形成。根据要分析的细菌, 可能需要不同的葡萄糖浓度或不同的糖要求。
2. 0.5% 瓦特/v 水晶紫在水: 溶化 2.5 g 水晶紫罗兰在500毫升蒸馏水。使用0.22 µm 过滤器进行杀菌消毒。
3. 刀豆蛋白 (错那县) 共轭异硫氰酸荧光素 (FITC): 重组 1x PBS 的股票。稀释10毫克集中的股票与 400 ul 1x PBS 的最终浓度25µg/毫升, 并保护免受光。
4. pbs + 葡萄糖: 溶解0.2 克葡萄糖在10毫升 1x PBS (2% 瓦特/v 葡萄糖决赛)。使用0.22 µm 过滤器进行杀菌消毒。在使用的当天进行新鲜。
5. pbs + 胆汁盐: 溶解40毫克在10毫升 1x PBS (0.4% 瓦特/v 胆汁盐决赛)。使用0.22 µm 过滤器进行杀菌消毒。在使用的当天进行新鲜。
6. pbs + 葡萄....

结果

在图 1中, 在含有胆汁盐的培养基的生长过程中, 大多数六种肠道病原体均诱导生物膜形成。在几乎所有的菌株中都能观察到胆汁盐暴露后黏附细菌的显著增加。异常是 enteroaggregative大肠杆菌(EAEC);但是, 请注意对Δ aaf突变⁴的诱导观察。结果表明, 在没有聚集黏附放线菌菌毛 I (AAF⁾21 的情况下, EAEC 中胆盐暴露会诱发附加黏附机制。若要从该数据集中得出结论, 请为测试的每个应变和媒体类型绘制 OD₅₄₀值。比较媒体控制 (BS) 中每个应变的值相对于含胆汁盐的介质, 将决定胆汁盐是否会显著诱发生物膜的形成。对细菌菌株和/或突变体的比较也可以进行进一步的表征分析。

EPS 的错那县 FITC .......

讨论

由于生物膜的动态性质以及菌株、材料、实验室和化验结果之间的变异性, 生物膜形成的分析具有挑战性。本文提出了在胆盐暴露后肠道病原体中生物膜形成的几种策略, 并对其进行了实验研究, 以促进重现性。还有其他的考虑, 以确保重现性。首先, 我们建议执行至少三个独立的实验, 每个与技术 triplicates, 以确认观察和统计意义, 由于可能发生的变化。第二, 使用积极和消极的控制是至关重要的, 以确保化验的重现性。在评价生物膜形成突变体时, 强烈建议将野生型应变作为一种正向控制。此外, 由于对生物膜形成很重要的基因被识别 (例如, 请参阅弧菌²²、沙门氏菌⁷和大肠杆菌^23、24、25), 使用生物膜突变体作为阴性对照将验证该检测的重现性。第三, 上述方法的基础是重点研究与志贺菌和S. .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
结晶紫	Sigma	C6158-50
刀豆素-A FITC	Sigma	C7642-10mg
葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
胆盐	Sigma	B8756-100G
LB 琼脂	Sigma	L7533-1KG
14 mL 培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌	Fisher	14-959-11B
Vectashield 硬质抗淬灭剂，含 DAPI	Vector Laboratories	H-1500
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635-500
戊二醛	Sigma-Aldrich	G6257
平底 96 孔板（透明）	TPP	92696
平底 96 孔板（黑色）	Greiner Bio-One	655076
平底 24 孔板（透明）	TPP	92424
玻璃盖玻片 12 mm，圆形	Fisher	08-774-383
96 孔板检测仪	Spectramax
荧光板检测仪	Biotek Synergy 2
共聚焦或荧光显微镜	尼康 A1 共聚焦显微镜
37°C 振荡培养箱	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C 板培养箱	Thermolyne Series 5000