本方案使读者能够采用多角度方法分析胆盐诱导的肠道病原菌生物膜形成，通过评估细菌的黏附、胞外聚合物基质形成及分散过程，揭示细菌生物膜的动态特性。
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本文内容
摘要
摘要
生物膜的形成是一个动态的多阶段过程，细菌在恶劣环境条件或应激状态下会启动该过程。对于肠道病原菌而言，在通过胃肠道以及接触胆汁（人类消化过程中的正常组分）时，会引发显著的应激反应。为了抵御胆汁的杀菌作用，许多肠道病原菌会形成生物膜，据推测这种结构有助于其在穿越小肠期间存活。本文介绍了通过固相黏附实验以及胞外聚合物基质（EPS）的检测与可视化来界定生物膜形成的方法。此外，还提供了生物膜分散能力的评估方法，以模拟感染过程中触发细菌释放的相关事件。采用结晶紫染色法，在高通量96孔板黏附实验中检测黏附性细菌。EPS产生的评估通过两种方法进行：即对EPS基质进行显微镜染色，以及使用荧光标记的多糖结合凝集素进行半定量分析。最后，通过菌落计数和平板培养法测定生物膜的分散情况。多种实验所得的阳性数据共同支持对生物膜的表征，并可用于鉴定其他细菌菌株中由胆盐诱导的生物膜形成能力。
引言
生物膜的形成是细菌在恶劣环境条件下被诱导产生的一种重要生存策略。当暴露于杀菌化合物（如抗生素）或营养物质及氧气供应发生变化时，细菌会进入应激状态，而生物膜的形成可缓解这种压力。生物膜的特征是细菌附着于表面或其他细菌，并伴随分泌主要由多糖组成的胞外聚合物基质（EPS）1,2,3。生物膜的形成是一个动态过程，一系列连续事件最终导致成熟且具有黏附性的细菌群落的建立1,2,3。细菌通过产生黏附素以促进早期附着，同时在生物膜成熟过程中调整黏附素基因的表达谱，以增强附着能力。与此同时，细菌合成EPS，形成包裹整个群落的保护性基质，以抵御初始的应激因子。生物膜内的细菌生长缓慢，因此大多数抗生素对其无效。此外，这种缓慢生长状态有助于在环境条件尚未适宜细菌生长时保存能量1,2,3。当恶劣环境条件消除后，细菌会从生物膜中分散并恢复浮游生活方式1
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方案
1. 试剂的准备
- 含0.4%胆盐的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：将200 mg胆盐溶解于50 mL已灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。每周新鲜配制。
注：常规使用的胆盐是从绵羊和牛的胆囊中分离得到的牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠按1:1比例组成的混合物。如先前研究所示4，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。与Luria-Bertani（LB）肉汤相比，TSB中添加了葡萄糖，因此足以诱导生物膜的形成 志贺氏菌 以及所分析的其他肠道病原体。根据待分析的细菌种类，可能需要不同的葡萄糖浓度或不同的糖类需求。 - 0.5% w/v 水合结晶紫溶液：将 2.5 g 结晶紫溶解于 500 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
- 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的刀豆蛋白A（ConA）：用1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬原液。将10 mg的浓缩原液加入400 μL的1×PBS中，稀释至终浓度为25 µg/mL，并避光保存。
- PBS + 葡萄糖：将 0.2 g 葡萄糖溶解于 10 mL 1x PBS 中（终浓度为 2% w/v 葡萄糖）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。当日现配现用。
- PBS + 胆盐：将 40 mg 溶于 10 mL 1×PBS 中（终浓度为 0.4% w/v 胆盐）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。当日现配现....
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结果
在 图1，生物膜形成在六种肠道病原体中的大多数菌株中被诱导，这些菌株在含有胆盐的培养基中生长后表现出显著增加的黏附细菌数量。几乎所有受试菌株在暴露于胆盐后均观察到黏附细菌数量显著上升。例外的是肠聚集性 E. coli （肠聚集性大肠杆菌）； 然而，需注意观察到的 Δ 诱导现象aaf 突变体4结果表明，在缺乏聚集性黏附菌毛I（AAF/I）的情况下，胆盐暴露可诱导EAEC产生额外的黏附机制。21. 要从该数据集中得出结论，绘制 OD540 每种菌株和培养基类型的测试值。通过比较各菌株在不含胆盐的培养基对照（-BS）与含胆盐培养基中的数值，可判断胆盐是否显著诱导生物膜形成。还可对不同细菌菌株和/或突变株进行比较，以开展进一步的表征分析。
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讨论
由于生物膜具有动态特性，且不同菌株、材料、实验室和检测方法之间存在变异性，生物膜形成分析具有挑战性。本文介绍了几种在胆盐暴露后检测肠道病原体生物膜形成的方法，并提供了实验细节以促进结果的可重复性。为确保可重复性，还需注意以下几点：首先，建议至少进行三次独立实验，每次实验设置三个技术重复，以确认观察结果的可靠性和统计学显著性，从而应对可能出现的变异。其次，使用阳性和阴性对照对于确保检测的可重复性至关重要。在评估突变株的生物膜形成能力时，强烈建议使用野生型菌株作为阳性对照。此外，随着与生物膜形成相关的重要基因被陆续鉴定（例如参见Vibrio22、Salmonella7以及E. coli23,24,25），使用生物膜缺陷突变株作为阴性对照可有效验证检测方法的可重复性。第三，上述方法主要基于对Shigel.......
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致谢
感谢 Rachael B. Chanin 和 Alejandro Llanos-Chea 提供的技术支持。感谢 Anthony T. Maurelli、Bryan P. Hurley、Alessio Fasano、Brett E. Swierczewski 和 Bobby Cherayil 提供本研究所用的菌株。本研究由美国国家过敏与传染病研究所资助项目 K22AI104755（C.S.F.）支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| 结晶紫 | Sigma | C6158-50 | |
| 刀豆球蛋白A-FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7021-1KG | |
| 胆盐 | Sigma | B8756-100G | |
| LB琼脂 | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌 | Fisher | 14-959-11B | |
| 含DAPI的Vectashield抗荧光淬灭封片剂（硬封片） | Vector Laboratories | H-1500 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| 平底96孔板（透明） | TPP | 92696 | |
| 平底96孔板（黑色） | Greiner Bio-One | 655076 | |
| 平底24孔板（透明） | TPP | 92424 | |
| 圆形玻璃盖玻片，直径12 mm | Fisher | 08-774-383 | |
| 96孔板读板仪 | Spectramax | ||
| 荧光读板仪 | Biotek Synergy 2 | ||
| 共聚焦或荧光显微镜 | Nikon A1共聚焦显微镜 | ||
| 37°C 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C 培养箱 | Thermolyne Series 5000 |
参考文献
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
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重印与许可
