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方法文章

胆盐诱导的肠道病原体生物膜形成：鉴定与定量技术

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DOI：

10.3791/57322

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2018年5月6日

 , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本方案使读者能够采用多角度方法分析胆盐诱导的肠道病原菌生物膜形成，通过评估细菌的黏附、胞外聚合物基质形成及分散过程，揭示细菌生物膜的动态特性。

摘要

生物膜的形成是一个动态的多阶段过程，细菌在恶劣环境条件或应激状态下会启动该过程。对于肠道病原菌而言，在通过胃肠道以及接触胆汁（人类消化过程中的正常组分）时，会引发显著的应激反应。为了抵御胆汁的杀菌作用，许多肠道病原菌会形成生物膜，据推测这种结构有助于其在穿越小肠期间存活。本文介绍了通过固相黏附实验以及胞外聚合物基质（EPS）的检测与可视化来界定生物膜形成的方法。此外，还提供了生物膜分散能力的评估方法，以模拟感染过程中触发细菌释放的相关事件。采用结晶紫染色法，在高通量96孔板黏附实验中检测黏附性细菌。EPS产生的评估通过两种方法进行：即对EPS基质进行显微镜染色，以及使用荧光标记的多糖结合凝集素进行半定量分析。最后，通过菌落计数和平板培养法测定生物膜的分散情况。多种实验所得的阳性数据共同支持对生物膜的表征，并可用于鉴定其他细菌菌株中由胆盐诱导的生物膜形成能力。

引言

生物膜的形成是细菌在恶劣环境条件下被诱导产生的一种重要生存策略。当暴露于杀菌化合物（如抗生素）或营养物质及氧气供应发生变化时，细菌会进入应激状态，而生物膜的形成可缓解这种压力。生物膜的特征是细菌附着于表面或其他细菌，并伴随分泌主要由多糖组成的胞外聚合物基质（EPS）1,2,3。生物膜的形成是一个动态过程，一系列连续事件最终导致成熟且具有黏附性的细菌群落的建立1,2,3。细菌通过产生黏附素以促进早期附着，同时在生物膜成熟过程中调整黏附素基因的表达谱，以增强附着能力。与此同时，细菌合成EPS，形成包裹整个群落的保护性基质，以抵御初始的应激因子。生物膜内的细菌生长缓慢，因此大多数抗生素对其无效。此外，这种缓慢生长状态有助于在环境条件尚未适宜细菌生长时保存能量1,2,3。当恶劣环境条件消除后，细菌会从生物膜中分散并恢复浮游生活方式1,2,3。传统上，生物膜在各种表面被观察到，由于导管和植入性医疗设备上存在感染储存库，已成为临床持续性感染的重要挑战1,2,3。

最近已有研究报道多种肠道病原菌可形成生物膜；这些细菌可感染小肠或结肠4。对于 志贺氏菌 物种, 感染发生在人类结肠，需经过大部分胃肠道的迁移。在通过小肠的过程中， 志贺氏菌 暴露于胆汁中；胆汁是一种脂解性去污剂，分泌进入肠道以促进脂质消化，同时可杀死大多数细菌5肠道病原体具有独特的抵抗胆汁杀菌作用的能力6我们最近的分析利用了 体内-类似组合的葡萄糖和胆盐以证明其在强健生物膜形成中的作用 S. flexneri 以及其他物种的 志贺氏菌， 致病的 大肠杆菌，以及 沙门氏菌4此前， 鼠伤寒沙门氏菌 伤寒沙门菌在慢性感染期间因胆囊的独特定植而被证实可形成胆汁诱导的生物膜7,8,9,10此外，先前的研究表明 弧菌11 和弯曲杆菌12 在胆汁诱导下表现出生物膜形成。因此，该分析将胆汁诱导的生物膜形成现象拓展至其他病原体，有助于确立胆汁引发的保守性肠道病原体应答反应。与慢性生物膜不同，在慢性生物膜中细菌基因转录受限且可能发生细胞衰老1,2,3我们提出，肠道胆汁诱导形成的生物膜具有更短暂的特性。这种短暂且具有高毒力的生物膜以快速解体为特征（如分散实验所示），并在生物膜群体中观察到毒力相关基因表达增强。4,6.

由于生物膜的形成是一个多因素、动态的过程，而胆盐作为诱导因子的作用在大多数肠道病原体中仅在近期才被描述，因此所使用的工具和技术是对传统方法的独特且富有创造性的应用。本文介绍了三种互补的策略，用于定量分析胆盐诱导生物膜形成的若干重要特征，包括细菌的黏附、胞外多糖基质（EPS）的产生以及活菌从生物膜中的分散。这些技术主要应用于志贺菌（Shigella）的研究；因此，其他肠道病原体的评估可能需要进行优化。然而，三项实验均获得阳性结果，支持生物膜的鉴定，并建立了可重复的胆盐诱导生物膜形成的实验方案。

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方案

1. 试剂的准备

  1. 含0.4%胆盐的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：将200 mg胆盐溶解于50 mL已灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，使用0.22 µm滤膜过滤除菌。每周新鲜配制。
    注：常规使用的胆盐是从绵羊和牛的胆囊中分离得到的牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠按1:1比例组成的混合物。如先前研究所示4，葡萄糖的存在是胆盐诱导生物膜形成所必需的。与Luria-Bertani（LB）肉汤相比，TSB中添加了葡萄糖，因此足以诱导生物膜的形成 志贺氏菌 以及所分析的其他肠道病原体。根据待分析的细菌种类，可能需要不同的葡萄糖浓度或不同的糖类需求。
  2. 0.5% w/v 水合结晶紫溶液：将 2.5 g 结晶紫溶解于 500 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
  3. 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的刀豆蛋白A（ConA）：用1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬原液。将10 mg的浓缩原液加入400 μL的1×PBS中，稀释至终浓度为25 µg/mL，并避光保存。
  4. PBS + 葡萄糖：将 0.2 g 葡萄糖溶解于 10 mL 1x PBS 中（终浓度为 2% w/v 葡萄糖）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。当日现配现用。
  5. PBS + 胆盐：将 40 mg 溶于 10 mL 1×PBS 中（终浓度为 0.4% w/v 胆盐）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。当日现配现用。
  6. PBS 加葡萄糖和胆盐：将 40 mg 胆盐和 0.2 g 葡萄糖溶解于 10 mL 1x PBS 中（终浓度为 0.4% w/v 胆盐和 2% w/v 葡萄糖）。使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。当日现配现用。
  7. 制备LB琼脂平板。
  8. 甲醛/戊二醛固定液：向14 mL 1×PBS中加入810 µL甲醛（37%贮存液，终浓度3%）和125 µL戊二醛（25%贮存液，终浓度0.25%），充分混匀，4 °C保存。使用前应冷却至低温以确保固定效果。
    注意：固定剂具有毒性，需按危险废物处理。
  9. 抗荧光淬灭封片液：使用含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料的抗荧光淬灭封片液，在对细菌DNA进行荧光染色的同时，抑制免疫荧光显微镜样品的光漂白。

2. 细菌的制备

  1. 取待测细菌菌株的单个分离良好的菌落，接种于3 mL TSB培养基中，在无菌培养管内37 °C、225 rpm振荡培养过夜（16 - 24 h），制备过夜培养物。
    注意：菌株应每隔2至4周从冷冻保藏物中重新划线接种，平板培养物保存时间不应超过两周。

3. 固相黏附实验

注意：本实验采用96孔板法对黏附细菌进行定量。细菌在平底板中静置培养。通过洗涤去除非黏附细菌后，使用结晶紫对黏附细菌进行染色。结晶紫可与细菌细胞壁中的肽聚糖结合，并可用乙醇溶解。根据结晶紫的保留量来确定黏附细菌的数量。

  1. 准备两个 1.5 mL 离心管，分别标记为 TSB 或 TSB + 胆盐（BS）。
  2. 向对应的离心管中加入 1 mL 的 TSB 或 TSB + BS。
  3. 向离心管中接种 20 µL 过夜培养物（按 1:50 稀释）。
  4. 在无菌、透明、平底、经组织培养处理的 96 孔板中，每种待测培养基（TSB 和 TSB + BS）分别设置三个空白对照孔，每孔加入 130 µL 未接种的培养基作为空白对照。
  5. 向三个孔中每孔加入 130 µL 接种后的培养物，重复操作直至所有实验条件均以三复孔形式加样完成。
  6. 于 37 °C 静置培养 4–24 小时。
  7. 使用酶标仪测定 OD600，将对照孔设为“空白”。确认对照培养基澄清，无浑浊现象。若发现任何浑浊，应弃去该实验。若不同细菌菌株的生长速率存在显著差异，可利用 OD600 值对数据进行归一化处理。
  8. 使用真空泵轻轻倾斜培养板，从孔的下边缘缓慢抽吸去除培养基，确保完全移除所有培养基，同时不破坏附着在塑料表面的细菌群体。若在培养期间产生了 EPS 基质，则会以白色沉淀物形式可见，切勿扰动 EPS 基质。
  9. 用 200 µL 无菌 PBS 轻柔洗涤各孔一次，随后使用真空泵去除 PBS 洗涤液。
  10. 将培养板倒置晾干，至少干燥 20 分钟。
    注意：由于生物膜必须在染色前彻底干燥，因此可在本步骤暂停实验数小时甚至过夜。额外的干燥时间不会影响染色过程，但干燥不完全将影响结果的定量分析和可重复性。
  11. 向每个实验孔和对照孔中加入 150 µL 0.5% 结晶紫溶液。
  12. 室温（RT）孵育 5 分钟。
  13. 用 400 µL 蒸馏水洗涤各孔一次，增加的体积有助于去除孔壁残留的结晶紫染料，随后使用真空泵去除洗涤液。
  14. 用 200 µL 蒸馏水洗涤各孔五次，每次均使用真空泵去除洗涤液。
    注意：充分洗涤对定量至关重要。当空白孔中的蒸馏水澄清、无任何残留结晶紫染料时，方可进行下一步操作。
  15. 将培养板倒置，避光晾干，确保如上所述完全干燥。
  16. 每孔加入 200 µL 95% 乙醇进行脱色，将培养板置于摇床上孵育 30 分钟。为避免蒸发（尤其在较高温度下），建议在 4 °C 条件下进行此步骤。
  17. 使用酶标仪测定 OD540。
    注意：结晶紫最大吸收波长接近 590 nm。文献报道其吸收波长范围为 OD540 –OD5954,13,14,15,16，因此可根据所用酶标仪的可用波长选择合适的检测波长。

4. EPS 基质检测

注意：这些互补性检测可对胞外多糖（EPS）进行定量和可视化。在这两种方法中，均使用凝集素结合多糖来检测EPS。荧光标记的蛋白质可实现定量（步骤4.1）或可视化（步骤4.2）。

  1. 胞外多糖（EPS）的半定量检测
    1. 准备两个1.5 mL离心管，分别标记为TSB或TSB + BS。
    2. 向对应的离心管中加入1 mL的TSB或TSB + BS培养基。
    3. 向离心管中接种20 µL过夜培养物（1:50稀释）。
    4. 在无菌的黑色平底、组织培养处理过的96孔板中，每孔加入130 µL未接种的对照培养基，设置三孔作为空白对照。每种待测培养基类型均需设置三个对照孔。向其他孔中每孔加入130 µL已接种的培养物，并重复操作，直至所有实验条件均以三复孔形式接种完毕。
    5. 在37 °C静置培养4–24小时。
    6. 使用移液器（理想情况下为多通道移液器）将培养基转移至透明的96孔板中。注意收集全部培养基，避免扰动附着的菌体群体和/或塑料表面的EPS。转移后的培养基暂存备用。
    7. 在室温下，每孔加入200 µL PBS 1×中的甲醛/戊二醛固定液，固定15分钟。
    8. 在附着菌体固定的同时，评估步骤4.1.6中获得的上清液部分。使用酶标仪测定OD600，将对照孔设为“空白”。确认对照培养基澄清，无浑浊现象。若发现任何浑浊，应弃去该次实验。
      1. 可选方案：整个实验也可在黑色底、透明孔底的96孔板中进行。在此情况下，可先测定OD600值，随后弃去培养基，再进入步骤4.1.7。若不同细菌菌株间生长速率存在显著差异，可用OD600值对数据进行归一化处理。
    9. 移除固定液，并将其作为危险废物处理。
    10. 每孔加入200 µL无菌PBS，轻柔洗涤两次。使用真空泵，将板子轻轻倾斜，缓慢从孔的下边缘吸除PBS洗涤液。
    11. 每孔加入150 µL浓度为25 µg/mL的ConA-FITC溶液，在室温下孵育15分钟。
    12. 用200 µL PBS轻柔洗涤两次。
    13. 向每孔加入150 µL PBS，记录488 nm处的荧光值。
  2. 共聚焦显微镜观察EPS产生情况及生物膜厚度计算
    1. 准备两个1.5 mL离心管，分别标记为TSB或TSB + BS。
    2. 向对应的离心管中加入1 mL的TSB或TSB + BS培养基。
    3. 向离心管中接种20 µL过夜培养物（1:50稀释）。
    4. 准备一个无菌的24孔板，每孔放入一个12 mm无菌圆形玻璃盖玻片。每孔加入400 µL未接种的对照培养基，设置三孔作为空白对照。每种待测培养基类型均需设置三个对照孔。
    5. 向孔中每孔加入400 µL已接种的培养物，每个条件设两个复孔，并重复操作，直至所有实验条件均完成接种。
    6. 在37 °C静置培养4–24小时。
    7. 肉眼观察确认：TSB条件下有菌体生长，TSB + BS条件下有菌体生长及EPS沉淀（白色），而无菌对照孔中无菌体生长和/或白色沉淀。随后移除上清液。
    8. 在室温下，每孔加入200 µL PBS 1×中的甲醛/戊二醛固定液，固定15分钟。
    9. 移除固定液，并将其作为危险废物处理。
    10. 每孔加入200 µL无菌PBS，轻柔洗涤两次。使用真空泵吸除PBS洗涤液。
    11. 每孔加入150 µL浓度为25 µg/mL的ConA-FITC溶液，在室温下孵育15分钟。
    12. 用200 µL PBS每孔轻柔洗涤两次。
    13. 使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂进行封片。
      注：该溶液为即用型、甘油基封片剂，含有DAPI，可在保护荧光标记的同时对细菌细胞内的DNA进行染色，作为共聚焦成像的反染。请遵循试剂盒说明书中的孵育时间建议。若所用抗荧光淬灭封片剂不含DAPI，可在封片前单独进行DAPI染色。
    14. 通过共聚焦显微镜进行观察。在共聚焦显微镜上，将激光设置为495 nm/519 nm激发/发射波长以观察FITC信号，另设一激光为360 nm/460 nm激发/发射波长以观察DAPI信号。通过聚焦DAPI通道定位生物膜，结合DAPI和FITC通道确定生物膜的完整厚度，并设定成像的上下边界。在设定Z轴堆栈的顶部和底部边界后，每隔0.25 µm采集一张图像，记录完整的Z轴堆栈图像。有关共聚焦显微镜的更多技术细节，请参阅Paddock et al.17,18,19,20的文献。
    15. 使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）对图像进行三维重建，以观察完整的生物膜形成情况并计算生物膜厚度。S. flexneri在胆盐诱导下形成的生物膜平均厚度为14 µm4。

5. 分散实验

注意：本实验通过检测细菌的分散作用来评估生物膜的解体过程。具体步骤为，先建立成熟的生物膜，随后（通常在次日）将培养基替换为磷酸盐缓冲液（PBS）或添加成分的PBS。然后检测上清液组分，以定量从生物膜中解离出的细菌数量。

  1. 准备两个 1.5 mL 离心管，分别标记为 TSB 或 TSB + BS。
  2. 向对应的离心管中加入 1 mL 的 TSB 或 TSB + BS。
  3. 用 20 µL 过夜培养物（按 1:50 稀释）接种各离心管。
  4. 在无菌、透明、平底、经组织培养处理的 96 孔板中，向三个孔中每孔加入 130 µL 未接种的对照培养基，作为空白对照。每种待测培养基均需设置三个对照孔。
  5. 向三个孔中每孔加入 130 µL 接种后的培养物，并重复操作，直至所有实验条件均以三复孔形式接种完毕。
  6. 将 96 孔板在 37 °C 静置培养 4–24 小时。
  7. 继续操作前，将 PBS、PBS + 葡萄糖、PBS + 胆盐以及 PBS + 胆盐 + 葡萄糖预热至 37 °C。上述试剂需每日新鲜配制。
  8. 使用酶标仪测定 OD600，将对照孔设为“空白”。确认培养基澄清，无浑浊现象。若发现任何浑浊，应弃去该次实验。若不同细菌菌株的生长速率存在显著差异，可利用 OD600 值对数据进行归一化处理。
  9. 使用真空泵移除培养基，注意完全收集培养基，同时避免破坏附着在塑料表面的菌体。
  10. 用 200 µL/孔的无菌 PBS 轻柔洗涤孔内两次，并使用真空泵移除每次洗涤液。
  11. 向每组三个孔中分别更换为 130 µL/孔的以下试剂：PBS、PBS + 葡萄糖、PBS + 胆盐、PBS + 胆盐 + 葡萄糖。这些试剂必须预先加热至 37 °C。
  12. 将 96 孔板在 37 °C 培养 30 分钟。
  13. 小心地从 37 °C 培养箱中取出 96 孔板，将上清液转移至新的无菌 96 孔板中。
  14. 使用 96 孔板或稀释块，将上清液用无菌 PBS 进行 10 倍（1:10）系列稀释。
    注：稀释梯度应根据待测菌株的不同，从原液至 10-6 不等。可通过预实验确定最佳稀释范围。
  15. 使用多通道移液器将每个稀释度的 5 µL 点样至 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。次日计数菌落，并根据稀释倍数计算回收的菌落形成单位（CFU）。为计算相对于 1× PBS 对照组（设为 100%）的分散百分比，将各处理组的回收 CFU 除以 1× PBS 对照组的回收 CFU。
    注：也可使用目标细菌菌株的常规培养基平板。例如，Shigella 可点样于刚果红平板上。确保平板干燥，以保证点样技术的准确性。

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结果

在 图1，生物膜形成在六种肠道病原体中的大多数菌株中被诱导，这些菌株在含有胆盐的培养基中生长后表现出显著增加的黏附细菌数量。几乎所有受试菌株在暴露于胆盐后均观察到黏附细菌数量显著上升。例外的是肠聚集性 E. coli （肠聚集性大肠杆菌）； 然而，需注意观察到的 Δ 诱导现象aaf 突变体4结果表明，在缺乏聚集性黏附菌毛I（AAF/I）的情况下，胆盐暴露可诱导EAEC产生额外的黏附机制。21. 要从该数据集中得出结论，绘制 OD540 每种菌株和培养基类型的测试值。通过比较各菌株在不含胆盐的培养基对照（-BS）与含胆盐培养基中的数值，可判断胆盐是否显著诱导生物膜形成。还可对不同细菌菌株和/或突变株进行比较，以开展进一步的表征分析。

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讨论

由于生物膜具有动态特性，且不同菌株、材料、实验室和检测方法之间存在变异性，生物膜形成分析具有挑战性。本文介绍了几种在胆盐暴露后检测肠道病原体生物膜形成的方法，并提供了实验细节以促进结果的可重复性。为确保可重复性，还需注意以下几点：首先，建议至少进行三次独立实验，每次实验设置三个技术重复，以确认观察结果的可靠性和统计学显著性，从而应对可能出现的变异。其次，使用阳性和阴性对照对于确保检测的可重复性至关重要。在评估突变株的生物膜形成能力时，强烈建议使用野生型菌株作为阳性对照。此外，随着与生物膜形成相关的重要基因被陆续鉴定（例如参见Vibrio22、Salmonella7以及E. coli23,24,25），使用生物膜缺陷突变株作为阴性对照可有效验证检测方法的可重复性。第三，上述方法主要基于对Shigel...

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致谢

感谢 Rachael B. Chanin 和 Alejandro Llanos-Chea 提供的技术支持。感谢 Anthony T. Maurelli、Bryan P. Hurley、Alessio Fasano、Brett E. Swierczewski 和 Bobby Cherayil 提供本研究所用的菌株。本研究由美国国家过敏与传染病研究所资助项目 K22AI104755（C.S.F.）支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨大豆肉汤Sigma-Aldrich22092-500G
结晶紫SigmaC6158-50
刀豆球蛋白A-FITCSigmaC7642-10mg
葡萄糖SigmaG7021-1KG
胆盐SigmaB8756-100G
LB琼脂SigmaL7533-1KG
14 mL培养管，17 x 100 mm，塑料，无菌Fisher14-959-11B
含DAPI的Vectashield抗荧光淬灭封片剂（硬封片）Vector LaboratoriesH-1500
甲醛Sigma-AldrichF1635-500
戊二醛Sigma-AldrichG6257
平底96孔板（透明）TPP92696
平底96孔板（黑色）Greiner Bio-One655076
平底24孔板（透明）TPP92424
圆形玻璃盖玻片，直径12 mmFisher08-774-383
96孔板读板仪Spectramax
荧光读板仪Biotek Synergy 2
共聚焦或荧光显微镜Nikon A1共聚焦显微镜
37°C 摇床培养箱New Brunswick Scientific Excella E25
37°C 培养箱Thermolyne Series 5000

参考文献

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胆盐诱导的肠道病原体生物膜形成：鉴定与定量技术
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