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方法文章

用于筛选致糖尿病环境化学物的小鼠胰岛细胞筛选模型

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DOI：

10.3791/57327

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2018年6月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hunan Engineering Technology Research Center of Featured Aquatic Resources Utilization, Hunan Agriculture University, 2Texas A&M University, 3Texas A&M Institute for Genomic Medicine, 4Sun Yat-Sen Memorial Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离小鼠胰腺胰岛细胞的实验方案，用于筛选外源性化学物质诱导的活性氧（ROS）生成，以鉴定潜在的致糖尿病外源性化学物质。

摘要

暴露于某些环境化学物质可导致人和动物胰腺β细胞的细胞损伤，进而引发2型糖尿病（T2DM）。尽管化学物质诱导β细胞损伤的机制尚不明确且可能较为复杂，但一个反复出现的研究发现是，这些化学物质会诱导氧化应激，导致过量活性氧（ROS）的产生，从而对β细胞造成损伤。为识别潜在的致糖尿病环境化学物，我们从C57BL/6小鼠中分离胰岛细胞，并将胰岛细胞接种于96孔细胞培养板中；随后用不同化学物质处理胰岛细胞，并利用2',7'-二氯荧光素（DCFH-DA）荧光染料检测ROS的生成。通过该方法，我们发现双酚A（BPA）、苯并[a]芘（BaP）和多氯联苯（PCBs）均可诱导高水平的ROS生成，提示它们可能对胰岛细胞具有潜在损伤作用。该方法可用于筛选致糖尿病的外源性化学物质。此外，培养的胰岛细胞也可适用于 体外 胰腺细胞中化学物诱导毒性的分析

引言

近年来，2型糖尿病（T2DM）患病率的上升已成为全球性的健康危机，对公共卫生构成严重威胁1。许多因素已被发现与T2DM的发生有因果关系，其中反复出现的研究结果表明，这些因素的一个共同交汇点是诱导氧化应激，从而导致过量活性氧（ROS）的产生2,3。

已发现多种环境化学物质（包括多氯联苯、二噁英和苯并[a]芘）可诱导氧化应激，这可能损害胰腺β细胞功能，并导致胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2DM）4。尽管生理水平的活性氧（ROS）在细胞功能中发挥重要作用，但当ROS暴露超过抗氧化系统的清除能力时，就会导致细胞/组织损伤并引发疾病5。胰腺β细胞表达的抗氧化酶水平较低，因此对氧化应激介导的损伤尤为敏感6,7。长期暴露于高水平的ROS已被证实可引起应激诱导的胰腺细胞功能障碍5，以及肝脏和脂肪组织中的胰岛素抵抗8。

本项目的主要目标是开发一种基于细胞的检测方法，通过检测化学物质在胰腺细胞中诱导活性氧（ROS）的产生能力，筛选其潜在的致糖尿病风险。胰腺缺乏代谢解毒能力，因而易受外源性物质诱导的损伤6,7因此，通过直接测量胰腺细胞中产生的活性氧（ROS），该检测方法可对化学物质引起的胰腺损伤提供直接的评估。为建立该方法，我们分离了小鼠胰岛，将分离的胰岛在细胞培养条件下与化学物质共同孵育，并以化学物质诱导的ROS生成作为检测指标。该方法操作简便、效果显著，可用于鉴定在分离胰岛中诱导ROS产生的化学物质，并可进一步拓展用于研究针对胰腺特异性的毒性作用机制。 体外.

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方案

所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本实验方案在德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行。&M基因组医学研究所

1. 溶液配制

  1. 将10倍浓度的Hank's平衡盐溶液用双蒸水稀释至1倍浓度2O，并在4 °C下保存。
  2. 通过加入 HEPES（10 mM）、MgCl₂（5 mM）和牛血清白蛋白（0.1%）配制分离溶液2 （1 mM）和葡萄糖（5 mM）。将pH值调节至7.4，并置于冰上保存。
  3. 使用胶原酶IV型配制胶原酶溶液。
    注意： 具体而言，IV型胶原酶每毫克干重含有160单位。将1 g IV型胶原酶溶于5 mL双蒸水中2O，浓度为200 mg/mL。将2 mL稀释后的胶原酶加入30 mL冰浴分离液中，每只小鼠分装6 mL胶原酶溶液至50 mL离心管中。
  4. 通过加入 1 mM CaCl₂ 制备洗涤液2 加入分离溶液中。
  5. 使用冷的聚蔗糖/泛影酸钠溶液（1.1119 g/mL，5 mL）配制纯化溶液。
  6. 在 RPMI 培养基中加入 L-谷氨酰胺（20 mM）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）和胎牛血清（FBS）（10%），配制 500 mL 胰岛培养基。
  7. 将DCFH-DA粉末溶于蒸馏水中，配制成200 µM的储备液，于-20 °C保存。
    注意： ROS染色液需新鲜配制，将DCFH-DA储备液用RPMI稀释至终浓度为5 µM。该试剂需避光保存。

2. 手术准备

  1. 对小鼠进行腹腔注射（I.P.）戊巴比妥钠（2.5% avertin，0.4 mL/20 g）。待小鼠完全麻醉且对后肢足部夹捏无反应后，实施安乐死，并将小鼠转移至生物安全柜中。
  2. 将已安乐死的小鼠仰卧放置，用70%乙醇喷洒皮肤以进行消毒。
  3. 在上腹部做一约1 cm的U形切口，打开腹腔，并将皮肤向头侧胸部方向牵拉，以充分暴露腹腔。

3. 胰腺灌注与摘除

  1. 如图1所示，找到壶腹部的位置。使用一对弯镊在靠近奥迪括约肌的位置夹闭十二指肠。用另一对弯镊夹闭十二指肠壁，以阻断胆汁在十二指肠内的通路。
    注意：此步骤中尚未插入导管。该步骤旨在阻断十二指肠内的胆汁通路。
  2. 调整小鼠体位，使其头部朝向研究人员近端，足部朝向远端。
  3. 找到胆总管，使用30 G针头和5 mL注射器缓慢注入3 mL胶原酶溶液。确保注射后胆总管和胰腺充分膨胀。
  4. 使用弯镊和精细剪刀将膨胀的胰腺从降结肠、肠道、胃和脾脏中分离并取出。将胰腺置于含有3 mL胶原酶溶液的50 mL离心管中，并置于冰上保存。

4. 胰腺消化

  1. 将每个50 mL离心管放入37 °C水浴中，孵育15 - 20分钟（时间因小鼠品系和年龄而异）。
  2. 使用涡旋振荡器振荡离心管。
  3. 将4 - 5个消化后的胰腺组织合并置于一个大型无菌水槽滤网中，用刮勺充分捣碎胰腺组织。使用含有洗涤液的23 G针头和10 mL注射器，用力将消化后的细胞从滤网上冲洗下来。将洗涤液收集至50 mL离心管中。
  4. 在4 °C下以97 × g离心1分钟，弃去上清液。
  5. 向离心管中加入25 mL洗涤液，轻轻涡旋重悬组织。在4 °C下以97 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此步骤3次。注意不要使沉淀的组织脱落。

5. 胰岛的纯化

  1. 向洗涤后的组织沉淀中加入10 mL纯化液，并轻轻重悬内容物。
  2. 将5 mL分离液轻轻覆盖在纯化液上方。注意保持两层溶液之间形成清晰的液-液界面。
  3. 将离心管在4 °C条件下以560 × g离心15分钟，采用慢加速且不启用刹车。将移液器插入界面处，收集胰岛层至新的50 mL离心管中。
  4. 按照步骤3.5所述方法洗涤胰岛。

6. 胰岛细胞的铺板与处理

  1. 将胰岛用10 mL胰岛培养液重悬，轻轻混匀，使用多通道移液器将100 µL/孔加入96孔板中。每孔约放置5个胰岛。
  2. 将板置于组织培养箱中孵育12小时。
  3. 将96孔板以112 × g离心，弃去培养基。
  4. 用胰岛培养基稀释环境化学物质。将每种化学物质的稀释液各100 µL分别加入板中不同孔内。重悬各孔中的胰岛，并在37 °C孵育12小时（不同环境化学物质的浓度有所不同）。

7. 活性氧染色与检测

  1.  胰岛处理后，用1× PBS洗涤（每孔96孔板使用200 µL）。
    注意： 化学物质的浓度如下：AFB1：3 µM，莠去津（Atrazine）：100 µM，苯并[a]芘（BaP）：10 µM，双酚A（BPA）：100 µM，β-雌激素，PCB126：10 µM，壬基酚（Nonylphenol）和双酚A（BPA）：100 µM。
  2. 使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为抗氧化剂以淬灭活性氧（ROS）。向诱导ROS的化学物质稀释液中加入5 mM NAC，并在37 °C孵育12小时。
  3. 将96孔板以112 × g离心，然后在37 °C下与5 µM荧光探针溶液（H2-DCFH-DA溶于RPMI培养基中）孵育60分钟。
  4. 用PBS洗涤处理后的胰岛细胞3次，并在488 nm激发波长下使用酶标仪检测530 nm处的荧光强度。
    注意： 当样品在488 nm激发时，细胞内DCF的积累可通过530 nm处荧光强度的增加进行测定。
  5. 对经ROS诱导型异源物质处理和未处理的胰岛进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验9，以评估异源物质对胰岛生理功能的影响。

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结果

健康分离胰岛的显微图像如图所示 图2，其中胰岛呈圆形或椭圆形，大小相对均匀（尽管不同品系间大小均匀性可能存在差异）。接下来，我们研究了胰腺胰岛在一种 体外 通过分离胰岛并在培养的胰岛中刺激胰岛素分泌来进行检测。 图3 展示了我们对C57BL/6小鼠分离胰岛进行葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验的典型分析结果，分别由3.3 mM和16.7 mM葡萄糖诱导9.

采用平板筛选法，我们已鉴定出多种可导致胰岛细胞内活性氧（ROS）显著诱导的异源物质（图4）。我们将分离的胰岛用不同化学物质处理12小时，发现莠去津（Atrazine）、双酚A（BPA）、苯并[a]芘（BaP）、多氯联苯126（PCB126

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讨论

越来越多的证据表明，接触环境化学物质在2型糖尿病（T2DM）的发生发展中起着重要作用。外源性化学物质诱导产生的活性氧（ROS）已被认为是导致T2DM发生的潜在病因因素之一。人类暴露于多种多样的外源性化学物质之中，因此迫切需要开发新的研究技术，以有效识别对胰腺具有毒性的物质，并深入探究其对胰腺细胞特异性的毒性作用机制。

在本研究中，依据已发表的实验方案14我们已开发出一种从小鼠中分离胰岛并使用外源性化学物质筛选胰腺细胞氧化应激损伤的实验方案。我们还利用该方法研究外源性化合物诱导的胰腺特异性毒性反应。为获取小鼠胰腺，我们优先选用阿佛丁（avertin）作为麻醉剂，因其不会改变血糖水平，也不会影响胰腺的血管系统。15,16,17我们发现，密度梯度离心步骤对于高纯度胰岛的分离至关重要。应小心操作以获得多蔗糖/钠溶液与分离缓冲液相之间的清晰界面，从而获得不含碎...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了由美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）资助的CREH中心试点项目基金以及国家自然科学基金（编号：31572626）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10×Hank’s 平衡盐溶液 GIBCO14185-052
IV型胶原酶Worthington Biochemical CorporationCLS-4
聚蔗糖/泛影酸钠溶液 Sigma10771
2’,7’-二氯荧光素（DCFH-DA）SigmaD6883-50MG
荧光酶标仪 Biotek
L-谷氨酰胺SigmaG8540-25G
链霉素GIBCO15140148
FBSGIBCO26140079
RPMI 1640GIBCO11875-085
戊四醇SigmaT48402-25G
大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒MilliporeEZRMI-13K
离心机SorvalSorval RT7用于96孔板离心
酶标仪BiotekEpoch 2用于荧光检测

参考文献

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