黑色素瘤细胞来源因子对骨髓脂肪细胞分化的双重作用

摘要

本文介绍了一种可靠且简便的二维（2D）共培养系统，用于研究肿瘤细胞与骨髓脂肪细胞之间的相互作用。该系统揭示了黑色素瘤细胞分泌因子对骨髓脂肪细胞分化具有双重作用，同时也为骨转移机制研究提供了一种经典方法。

摘要

骨髓脂肪细胞与肿瘤细胞之间的相互作用可能在骨转移过程中发挥关键作用。目前有多种方法可用于研究这种重要的相互作用，但二维Transwell共培养系统仍是研究该相互作用的经典、可靠且简便的方法。本文提供了一项详细的操作方案，展示骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞的共培养过程。这种共培养系统不仅有助于研究骨髓脂肪细胞诱导的癌细胞信号转导，还可为未来揭示骨转移的分子机制提供支持，从而发现骨转移新的治疗靶点。

引言

骨转移在晚期癌症患者中十分常见，但目前尚无治愈性治疗方法。除了以脂肪形式储存能量的专有功能外，脂肪细胞还能支持肿瘤在骨髓及其他器官中的生长和转移^1,2,3,4,5,6。此外，脂肪细胞在调控癌细胞生物学特性^7,8,9,10 和代谢过程^{4,11,12,13,14,15,}

方案

注意：本方案中使用的所有细胞在从冻存细胞复苏后，应至少培养三代以上。

1. 收集黑色素瘤细胞来源的因子

1. 准备工作
   1. 获取B16F10细胞及小鼠黑色素瘤细胞系。
      注：本实验所用小鼠黑色素瘤细胞系购自中国科学院干细胞库。
   2. 配制B16F10细胞培养用完全培养基（100 mL）。使用含10%胎牛血清（FBS）、50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
   3. 配制无血清培养基用于B16F10细胞的饥饿处理（50 mL）。使用不含FBS、含50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的DMEM培养基。
2. 制备黑色素瘤条件培养基（CM）
   1. 在100 mm培养皿中加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，接种2.0 × 10⁵个B16F10细胞，然后将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养24小时。
   2. 当细胞融合度达到约80%时，吸除培养液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（1×，pH 7.4）洗涤细胞两次，然后更换为10 mL无血清培养基进行饥饿处理。
   3. 将细胞放回培养箱继续培养18–24小时。
   4. 饥饿....

结果

在骨髓中，脂肪细胞可能在肿瘤微环境的早期阶段出现^{1,13,33,34,35}，通过分泌可溶性因子或激活破骨细胞生成来支持肿瘤进展^6,12,36，尤其是在肥胖^6,12和/或衰老³⁷的背景下。我们之前的研究¹指出，在黑色素瘤骨转移的早期阶段，骨髓脂肪细胞的数量会.......

讨论

使用插入式共培养装置已广泛用于研究细胞间相互作用。二维共培养系统是观察两种细胞之间相互交流的有效方法。 体外，我们在此展示了癌细胞对骨髓脂肪细胞的两种不同驱动效应。许多实验室已采用该方法研究脂肪细胞与癌细胞之间的相互作用。^6,12,27,39.

因此，通常情况下，二维共培养是研究细胞间相互作用最直接的方法。然而，在为后续研究准备未分化细胞系时，存在一些独特的挑战。在本方案中，骨髓基质细胞的健康状况和功能状态对脂肪细胞的分化至关重要。该方案可进行修改，将14F1.1细胞替换为原代骨髓间充质干细胞。此外，将14F1.1细胞在成脂诱导培养基中预孵育数天是另一个关键步骤。若缺少此预孵育步骤，骨髓基质细胞将无法分化为脂肪细胞，这一现象已在我们及其他研究者的实验中被观察到⁴⁰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
胎牛血清	Invitrogen Inc.	16000–044
磷酸盐缓冲液	Invitrogen Inc.	14190-144
胰岛素	Sigma-Aldrich	91077C
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
油红O	Sigma-Aldrich	O0625
24孔板	Corning	CLS3527
Transwell 小室	Millipore	MCHT24H48
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% 胰蛋白酶	Thermo Scientific	25200056
血细胞计数板	Bio-Rad	1450016
细胞培养孵育箱	Thermo Scientific
50 mL 离心管	Corning	CLS430828
超净工作台	Thermo Scientific	-
显微镜	Olympus	-
200 μL 移液器吸头	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL 移液器吸头	BeyoGold	FTIP628