黑色素瘤细胞来源因子对骨髓脂肪细胞分化的双重作用

摘要

本文介绍了一种可靠且简便的二维（2D）共培养系统，用于研究肿瘤细胞与骨髓脂肪细胞之间的相互作用。该系统揭示了黑色素瘤细胞分泌因子对骨髓脂肪细胞分化具有双重作用，同时也为骨转移机制研究提供了一种经典方法。

摘要

骨髓脂肪细胞与肿瘤细胞之间的相互作用可能在骨转移过程中发挥关键作用。目前有多种方法可用于研究这种重要的相互作用，但二维Transwell共培养系统仍是研究该相互作用的经典、可靠且简便的方法。本文提供了一项详细的操作方案，展示骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞的共培养过程。这种共培养系统不仅有助于研究骨髓脂肪细胞诱导的癌细胞信号转导，还可为未来揭示骨转移的分子机制提供支持，从而发现骨转移新的治疗靶点。

引言

骨转移在晚期癌症患者中十分常见，但目前尚无治愈性治疗方法。除了以脂肪形式储存能量的专有功能外，脂肪细胞还能支持肿瘤在骨髓及其他器官中的生长和转移^1,2,3,4,5,6。此外，脂肪细胞在调控癌细胞生物学特性^7,8,9,10 和代谢过程^{4,11,12,13,14,15,16} 以及骨转移的发生发展方面也发挥着重要作用^1,4,12。在骨髓微环境中，脂肪细胞还可影响癌细胞的生物学行为^4,6,17。骨髓脂肪细胞与具有嗜骨特性的癌细胞之间的相互作用，对于理解骨转移机制具有重要意义，然而目前对此知之甚少。

根据目前的研究，多种方法已应用于脂肪细胞，包括二维或三维（2/3D）以及离体（ex vivo）培养体系^{17,18,19,20,21}。最近，Herroon et al. 设计了一种新的三维培养方法，用于研究骨髓脂肪细胞与癌细胞之间的相互作用²²。尽管三维共培养体系在模拟脂肪细胞与癌细胞在体内（in vivo）的生理相互作用方面具有优势，但其可重复性较差^22,23。与二维共培养系统相比，三维共培养系统可能产生不同的细胞表型，例如细胞形态^{21,22,24,25,26}。此外，分离的松质骨组织碎片的离体（ex vivo）培养可促使培养的骨髓细胞中脂肪细胞显著生长¹⁷。

然而，与上述这些先前的模型相比，二维细胞培养模型仍是一种经典、可靠且简便的技术，可用于快速筛选候选分子以及体外脂肪细胞或癌细胞中发生改变的表型in vitro^{1,4,6,12,15,27}。 为了更深入地理解骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞之间的相互作用，本文提供了一种骨髓脂肪细胞与黑色素瘤细胞二维共培养体系的详细实验方案。

方案

注意：本方案中使用的所有细胞在从冻存细胞复苏后，应至少培养三代以上。

1. 收集黑色素瘤细胞来源的因子

1. 准备工作
   1. 获取B16F10细胞及小鼠黑色素瘤细胞系。
      注：本实验所用小鼠黑色素瘤细胞系购自中国科学院干细胞库。
   2. 配制B16F10细胞培养用完全培养基（100 mL）。使用含10%胎牛血清（FBS）、50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
   3. 配制无血清培养基用于B16F10细胞的饥饿处理（50 mL）。使用不含FBS、含50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的DMEM培养基。
2. 制备黑色素瘤条件培养基（CM）
   1. 在100 mm培养皿中加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，接种2.0 × 10⁵个B16F10细胞，然后将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养24小时。
   2. 当细胞融合度达到约80%时，吸除培养液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（1×，pH 7.4）洗涤细胞两次，然后更换为10 mL无血清培养基进行饥饿处理。
   3. 将细胞放回培养箱继续培养18–24小时。
   4. 饥饿处理结束后，用移液器收集条件培养基（CM），转移至新的50 mL离心管中。
      注：条件培养基即B16F10细胞培养后的上清液。收集CM前需确保B16F10细胞状态良好。
   5. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心5分钟。
   6. 吸取上清液，转移至新的无菌管或无菌瓶中。
      注：避免吸取管底沉淀物。
   7. 为去除细胞碎片，使用连接注射器的0.45 µm滤器将CM过滤至无菌瓶或无菌管中。
      注：使用0.22 µm滤器过滤CM效果更佳。
   8. 将过滤后的上清液于-20 °C保存备用。
      注：上清液在-20 °C保存不宜超过一个月。如需长期保存用于脂肪细胞分化实验，建议存于-80 °C。

2. 由黑色素瘤细胞衍生因子诱导骨髓脂肪细胞

1. 准备工作
   1. 配制100 mL脂肪诱导培养基²⁸使用完全DMEM培养基，添加5 µg/mL胰岛素、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1 µM地塞米松。4 °C保存，最多可存放两周。
   2. 配制100 mL脂肪诱导维持培养基。使用完全DMEM或与50%黑色素瘤条件培养基混合，并添加5 µg/mL胰岛素。
   3. 配制油红O储备液。将30 mg油红O粉末溶解于10 mL异丙醇（≥ 99.5%）中，充分涡旋混匀。
      注意：在 4 °C 下保存，最长可保存 1 年。
   4. 配制 Oil Red O 工作液。在通风橱中，将 Oil Red O 储存液（来自步骤 2.1.3）与去离子水按 3:2 的比例稀释。室温孵育混合液 15 分钟，使用前经 0.22 µm 滤膜过滤。
      注意：新鲜配制的工作液须在2小时内使用完毕。
2. 脂肪细胞分化
   1. 培养小鼠骨髓基质细胞系14F1.1²⁹ 在37 °C、5% CO₂培养箱中，于60 mm培养皿内用完全DMEM培养基培养至80%汇合度₂.
      注意：也可用原代骨髓来源的间充质细胞替代14F1.1³⁰.
   2. 在培养箱中用1.5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞1–2分钟。
   3. 加入5 mL含10% FBS的培养基至细胞中，使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后将细胞密度调整至约1–2 × 10⁵/mL
   4. 接种 5 × 10⁴ 每孔加入0.5 mL成脂诱导培养基，接种14F1.1细胞至24孔板中。培养两天后，细胞融合度达到约90%。
      注意：此步骤非常关键。骨髓基质细胞必须在成脂诱导培养基中才能被诱导分化为脂肪细胞。
   5. 移除诱导培养基，每次用1 mL PBS洗涤细胞，共洗涤两次。
   6. 更换为1 mL成脂维持培养基，继续培养细胞直至脂肪细胞成熟。
      注意：在显微镜下，脂肪细胞看起来像小或大的肥皂泡，非常容易辨认。通常，成熟的脂肪细胞在第6天出现^th 或 8^th 天
   7. 用油红O染色成熟脂肪细胞，或收集脂肪细胞进行定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。
3. 脂肪细胞染色
   1. 用 PBS 清洗已分化的 14F1.1 细胞 2 次，然后用 3.7% 多聚甲醛固定 1 小时。
   2. 用60%异丙醇冲洗细胞，并使其完全干燥。
   3. 向孔中加入0.2 mL Oil Red O工作液，在室温下孵育0.5至2小时。
   4. 用清水洗涤细胞，以去除未结合的染料。
   5. 在光学显微镜下拍摄染色的脂肪细胞照片。

3. 黑色素瘤细胞与骨髓脂肪细胞的共培养

1. 准备工作
   1. 制备成熟的骨髓脂肪细胞：将14F1.1细胞在24孔板中使用脂肪诱导培养基诱导分化为成熟的骨髓脂肪细胞，持续2天，随后在脂肪维持培养基中继续培养6–8天。
   2. 制备B16F10细胞：在60 mm培养皿中加入5 mL DMEM培养基培养B16F10细胞。
   3. 润湿膜插件（例如 transwell）：向孔径为0.4 µm的膜插件中加入150 µL不含FBS的DMEM培养基，并将其浸入已装有500 µL不含FBS的DMEM培养基的24孔板孔中。
2. 共培养设置
   1. 缓慢吸去每个插件中的培养基。
      注意：去除培养基时切勿破坏膜结构。
   2. 将B16F10细胞（0/10³/10⁵/10⁶）接种至步骤3.2.1中的0.4 µm孔径膜插件中。
   3. 将步骤3.1.1中含成熟骨髓脂肪细胞的孔内脂肪维持培养基更换为600 µL完全DMEM培养基。
   4. 将含有B16F10细胞的插件（来自步骤3.2.2）转移至含有成熟骨髓脂肪细胞的孔（来自步骤3.2.3）上，进行共培养实验。
   5. 将共培养体系置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2天。
   6. 孵育48小时后，移除共培养插件，然后用500 µL 1x PBS洗涤脂肪细胞两次。
      注意：如有需要，可选择性收集插件中的B16F10细胞用于后续分析。
   7. 使用油红O工作液对脂肪细胞进行染色，或收集脂肪细胞用于qPCR分析。
      注意：染色步骤详见步骤2.3。
   8. 在光学显微镜下拍摄染色后的脂肪细胞图像。

4. 脂肪细胞特异性基因特征的qPCR分析

1. 在24孔板中每个待检测成熟脂肪细胞的孔中加入0.5 mL即用型RNA提取试剂。
2. 按照标准流程进行RNA提取和cDNA合成³¹。
3. 以18S和GAPDH的引物作为对照，CEBPα/β、PPARγ、FABP4、leptin、Pref-1或adiponectin的引物用于检测脂肪细胞特异性基因表达特征（表1）。
4. 在PCR仪中运行以下反应程序：95 °C预变性20 s，随后进行40个循环（95 °C变性1 s，60 °C退火延伸20 s）。
5. 采用2^-ΔΔCt法计算基因表达的倍数变化³²。

结果

在骨髓中，脂肪细胞可能在肿瘤微环境的早期阶段出现^{1,13,33,34,35}，通过分泌可溶性因子或激活破骨细胞生成来支持肿瘤进展^6,12,36，尤其是在肥胖^6,12和/或衰老³⁷的背景下。我们之前的研究¹指出，在黑色素瘤骨转移的早期阶段，骨髓脂肪细胞的数量会...

讨论

使用插入式共培养装置已广泛用于研究细胞间相互作用。二维共培养系统是观察两种细胞之间相互交流的有效方法。 体外，我们在此展示了癌细胞对骨髓脂肪细胞的两种不同驱动效应。许多实验室已采用该方法研究脂肪细胞与癌细胞之间的相互作用。^6,12,27,39.

因此，通常情况下，二维共培养是研究细胞间相互作用最直接的方法。然而，在为后续研究准备未分化细胞系时，存在一些独特的挑战。在本方案中，骨髓基质细胞的健康状况和功能状态对脂肪细胞的分化至关重要。该方案可进行修改，将14F1.1细胞替换为原代骨髓间充质干细胞。此外，将14F1.1细胞在成脂诱导培养基中预孵育数天是另一个关键步骤。若缺少此预孵育步骤，骨髓基质细胞将无法分化为脂肪细胞，这一现象已在我们及其他研究者的实验中被观察到⁴⁰...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
胎牛血清	Invitrogen Inc.	16000–044
磷酸盐缓冲液	Invitrogen Inc.	14190-144
胰岛素	Sigma-Aldrich	91077C
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
油红O	Sigma-Aldrich	O0625
24孔板	Corning	CLS3527
Transwell 小室	Millipore	MCHT24H48
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% 胰蛋白酶	Thermo Scientific	25200056
血细胞计数板	Bio-Rad	1450016
细胞培养孵育箱	Thermo Scientific
50 mL 离心管	Corning	CLS430828
超净工作台	Thermo Scientific	-
显微镜	Olympus	-
200 μL 移液器吸头	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL 移液器吸头	BeyoGold	FTIP628