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斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

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DOI：

10.3791/57330

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2018年4月25日

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

本文内容

摘要

在此，我们展示了构建细胞电位报告斑马鱼品系的过程，以可视化胚胎发育、运动及斑马鱼肿瘤细胞 体内.

摘要

生物电是指由细胞膜上的离子通道和离子泵介导的内源性电信号，在可兴奋的神经细胞和肌肉细胞的信号传导以及其他多种生物学过程中（如胚胎发育模式形成）发挥着重要作用。然而，目前仍缺乏在脊椎动物胚胎发育过程中进行体内电活动监测的有效手段。基因编码的荧光电压探针（GEVIs）的进展为此挑战提供了可能的解决方案。本文以已建立的电压探针 ASAP1（动作电位加速感应器1）为例，介绍如何构建转基因电压指示斑马鱼。本研究选用了 Tol2 工具包以及一个泛表达的斑马鱼启动子ubi。我们还详细说明了 Gateway 位点特异性克隆、基于 Tol2 转座子的斑马鱼转基因技术，以及利用常规落射荧光显微镜对早期胚胎和斑马鱼肿瘤进行成像的操作流程。通过该转基因鱼系，我们发现斑马鱼胚胎发育及幼鱼运动过程中存在细胞电位的变化。此外，在部分斑马鱼恶性外周神经鞘瘤中观察到，与周围正常组织相比，肿瘤细胞普遍呈现极化状态。

引言

生物电是指由细胞膜上的离子通道和离子泵介导的内源性电信号1细胞膜上的离子交换及其伴随的电位和电流变化，对可兴奋的神经细胞和肌肉细胞的信号传导过程至关重要。此外，生物电和离子梯度还具有多种其他重要生物学功能，包括能量储存、生物合成以及代谢物的转运。生物电信号还被发现可调控胚胎模式形成，如体轴建立、细胞周期以及细胞分化。1因此，理解此类信号通路的异常调控对认识许多人类先天性疾病至关重要。尽管膜片钳技术已被 广泛用于记录单个细胞，但在胚胎发育过程中同时监测多个细胞方面仍远未达到理想状态 体内此外，电压敏感的小分子也并非理想选择 体内 因其特异性、敏感性和毒性而具有应用价值。

多种基因编码的荧光电压指示剂（GEVIs）的开发为解决这一问题提供了新机制，并使得研究胚胎发育过程变得更加便捷，尽管这些指示剂最初是为监测神经细胞而设计的2,3。目前可用的GEVIs之一是动作电位加速传感器1（ASAP1）4。ASAP1由电压敏感磷酸酶的电压感应结构域的一个胞外环和一个环状重排的绿色荧光蛋白组成。因此，ASAP1能够可视化细胞电势的变化（极化状态：亮绿色；去极化状态：暗绿色）。ASAP1具有2 ms的响应和恢复动力学，可追踪亚阈值电位变化4。因此，这一遗传工具在活细胞实时生物电监测方面实现了更高水平的有效性。进一步理解生物电在胚胎发育以及多种人类疾病（如癌症）中的作用，将有助于揭示其潜在机制，这对于疾病的治疗与预防至关重要。

斑马鱼已被证实是研究发育生物学和人类疾病（包括癌症）的有力动物模型5,6它们与人类共享70%的直系同源基因，并具有相似的脊椎动物生物学特征7斑马鱼具有易于饲养、产卵量大、遗传操作简便、易于转基因以及胚胎体外发育透明等优势，使其成为一种优越的研究系统 体内 成像5,6拥有大量现有的突变鱼系和已完成全基因组测序的资源，斑马鱼将提供一个相对 无限的科学发现范围。

为了研究 体内 细胞的实时电活动，我们利用斑马鱼模型系统和ASAP1。本文描述了如何通过Tol2转座子转基因技术将荧光电压生物传感器ASAP1整合到斑马鱼基因组中，并在胚胎发育、幼鱼运动以及活体肿瘤中可视化细胞的电活动。

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方案

斑马鱼饲养在经AAALAC认证的动物实验设施中，所有实验均按照普渡大学动物护理与使用委员会（PACUC）批准的方案进行。

1. Tol2 转座子质粒构建体制备

注意：Tol2 是一种在青鳉鱼中发现的转座子，已在斑马鱼研究领域得到广泛应用8,9。该系统已成功整合到基于 Gateway 位点特异性重组的克隆系统中，被称为 Tol2 工具包10。Tol2 工具包能够更便捷地构建定制表达载体，同时提高转基因效率。因此，采用该系统并利用已验证的泛素启动子驱动 ASAP1 表达，建立一种普遍表达 ASAP1 的斑马鱼品系，是一个顺理成章的选择11。

  1. 创建一个中间载体 ASAP1 构建体：pDONR221-ASAP1
    1. 获取基因编码的电压传感器 ASAP1 构建体， pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1（质粒编号#52519），来自Addgene。为扩增ASAP1编码区，使用在引物5'端带有attB序列的定制引物（attB1-ASAP1F和attB2-ASAP1R）进行PCR扩增图1). 选择Phusion DNA聚合酶因其具有高扩增效率，并根据先前发表的实验方案优化了PCR反应条件12.
    2. 将50 µL PCR产物使用带200 µL吸头的常规移液器加入1% TAE琼脂糖凝胶中，在水平电泳槽中以160 V电压电泳约30分钟。
    3. 在353 nm紫外透射仪下观察凝胶，参照先前发表的方法，在紫外透射仪下使用刀片或解剖刀切下目标条带13,14并将含有DNA的凝胶样品放入干净的1.5 mL微量离心管中。
    4. 对ASAP1的PCR产物进行凝胶纯化。使用商品化的DNA凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书回收切下的凝胶中的DNA，并用20 µL水洗脱DNA。取1 µL样品，使用分光光度计测定DNA浓度。以水作为空白对照，按照软件操作说明进行测定15.
    5. 取100 ng纯化的PCR产物与150 ng pDONR221质粒，在10 µL TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA pH 8.0）中混合16加入2 µL BP Clonase II，室温孵育过夜。
    6. 第二天，向反应体系中加入1 µL蛋白酶K，37 °C孵育30分钟。
    7. 进行转化。将反应物转移并与50 µL Top10感受态细胞混合 E. coli 细胞并在冰上孵育30分钟。然后将反应管转移至42 °C水浴中1分钟。立即取出试管，再于冰上孵育2分钟。接着将试管放入37 °C摇床中，孵育1小时。
    8. 取出离心管，将细胞接种于含卡那霉素的LB平板上。随后，在37 °C条件下倒置培养平板过夜（16–18 h）。
    9. 挑取单个且分离良好的菌落，接种于含3 mL LB培养基的14 mL细胞培养管中。在37 °C摇床中以250 rpm（每分钟转数）的转速振荡培养过夜。
    10. 使用商业质粒小提试剂盒，按照其说明书进行质粒小提17.
    11. 使用 M13F 和 M13R 测序引物对 3-4 个质粒进行 Sanger 测序，以鉴定含有 pDONR221-ASAP1 的阳性克隆。
  2. 构建用于显微注射的 Tol2 载体：pDestTol2-ubi-ASAP1
    1. 选择经测序验证的 pDONR221-ASAP1 克隆，并使用分光光度计测定其 DNA 浓度 使用水作为空白对照的软件操作说明15.
    2. 取100 µg pDONR221-ASAP1，与100 µg Tol2试剂盒5'端质粒（pENTR5'_ubi，Addgene #27320）、100 µg p3E-polyA（Tol2试剂盒#302）以及150 µg pDestTol2pA2（Tol2试剂盒#394）混合。在1.5 mL微量离心管中用TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）调节总体积至8 µL，并通过短暂涡旋2–5秒充分混匀。随后加入2 µL LR Clonase II Plus，于室温孵育过夜。
    3. 第二天，使用10 µL移液器向反应体系中加入1 µL蛋白酶K，37 °C孵育30分钟。
    4. 按照上述方法进行转化并鉴定阳性克隆（步骤1.1.7-11）。
    5. 测定经测序验证的 pDestTol2-ubi-ASAP1 克隆的 DNA 浓度（图1B使用分光光度计15通常浓度约为200 ng/µL。

2. 准备 Tol2 转座酶 mRNA 和注射溶液

  1. 使用无菌接种环将含有 pCS2FA-转座酶质粒（Tol2 试剂盒 #396）的 E. coli 甘油菌株划线接种于 LB 琼脂平板（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）上。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。次日，挑取单个菌落，使用无菌的 10 µL 移液枪头将其接种至 3 mL LB 液体培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中，在 37 °C 摇床中以 250 rpm 振荡培养过夜。
  2. 使用商业质粒小提试剂盒，按照说明书对 E. coli 培养物进行质粒提取。以 14,000 rpm 离心 1 分钟，将质粒 DNA 洗脱至 30–50 µL TE 缓冲液中，并使用 分光光度计测定 DNA 浓度。
  3. 使用 Not I 限制性内切酶对 1–2 µg 质粒进行线性化处理，随后按照说明书使用 DNA 纯化试剂盒对经 Not I 消化后的 DNA 进行纯化。以 14,000 rpm 离心 1 分钟，将 DNA 洗脱至 5 µL 水中。预期浓度约为 200–300 ng/µL。
  4. 以经 Not I 线性化的 pCS2FA-转座酶质粒作为 DNA 模板，使用商业 SP6 体外转录试剂盒进行体外转录反应。
  5. 反应完成后，按照生产商说明书使用商业 RNA 纯化试剂盒纯化 Tol2 转座酶 mRNA。最后将 mRNA 洗脱至 20 µL 无 RNA 酶的水中，并使用分光光度计测定 RNA 浓度。预期浓度约为 1–3 µg/µL。如需长期保存，可将样品置于 -80 °C 超低温冰箱中。
  6. 在微量离心管中，通过移液将 20 ng/µL 的 pDestTol2-ubi-ASAP1 与 Tol2 转座酶 mRNA（100 ng/µL）混合，配制显微注射溶液。为避免因反复冻融导致核酸降解，可将溶液分装为每管 6 µL，储存于 -80 °C 超低温冰箱中以备后续使用。

3. 显微注射

  1. 在注射前一个下午设置4-6个繁殖缸，每缸至少放入2条雄鱼和2条雌鱼。这些鱼在下午不要喂食。此步骤可减少鱼类排泄物，节省第二天早晨清理时间，同时有助于诱导产卵反应。
  2. 次日早晨，从-80 °C冰箱中取出预先准备好的注射溶液（pDestTol2-ubi-ASAP1质粒和Tol2 mRNA），并置于冰上。
  3. 移除繁殖缸中的隔离板，让鱼进行交配。通常情况下，移除隔离板后20-30分钟内鱼会产卵。若未产卵，可再等待1-2小时。部分鱼可能完全不产卵，在此情况下需重复实验以收集鱼胚胎。
  4. 等待期间，确保已准备好针头，使用镊子以一定角度折断针尖，形成斜面边缘，或在精细擦拭纸上折断。
    1. 使用显微拉针仪从毛细玻璃管拉制针头，参数设置如下：加热545；拉力60；速度80；时间250；压力500。在解剖显微镜下（使用目镜标尺估算直径），用镊子以约45°角夹住针头并折断。所需针头直径可根据显微注射仪设置而变化，但较小直径更佳，有助于降低胚胎死亡率。
  5. 鱼产卵后，将卵收集至直径10 cm的培养皿中，并转移至解剖显微镜下。去除所有异常胚胎和鱼排泄物。
  6. 用移液器将受精胚胎转移至预先准备的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分，以帮助固定胚胎位置。
  7. 当所有行均被有活力的胚胎填满后，调整其排列方向，使所有单细胞朝向同一方向面对针头，水平方向约呈45°角。这将使后续注射操作更加容易。
  8. 戴手套后，使用20 µL上样移液枪头，从冰上的管中吸取5 µL预先准备的构建物溶液。
  9. 小心将枪头插入折断的毛细管后端，直至其开始变细处，以使试剂尽可能靠近针尖。若仍有气泡，轻轻晃动针头，注意不要折断针尖。
  10. 将针头垂直插入显微注射针头夹持器中，小心拧紧直至针头固定不动。调整针头角度至约45°。
  11. 针头准备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。商用CO2气罐通常适用于此目的。注射体积通过维持压力和喷射压力调节：维持压力约0.5 psi，喷射压力约30 psi。务必检查踩下脚踏开关时是否有溶液排出。
  12. 使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，调节溶液流出的体积和流速，使其直径约为150 µm（约2 nL）。确保背压能使少量液体从针尖缓慢滴出。若背压不足，毛细作用会导致液体进入针内，破坏mRNA。
  13. 针头校准完成后，开始将构建物注射入受精胚胎的单细胞中。
    注意：由于细胞膜较难刺穿，此步骤需要大量练习、耐心和精细操作。为获得转基因斑马鱼，必须将溶液注入细胞内而非卵黄中，这与吗啉代寡核苷酸注射不同。只要构建物进入细胞，针头从哪一侧进入细胞并不重要。若将溶液注入卵黄而非细胞，转基因成功率将极低。必须在单细胞阶段进行注射，否则会产生体细胞嵌合体鱼，从而降低转基因进入生殖细胞的可能性。
  14. 利用凝胶凹槽边缘作为支撑，固定胚胎位置，使针头施加压力时胚胎不会移动。当针尖进入单细胞后，踩下脚踏开关释放所需量的溶液。对所有胚胎重复此过程。
  15. 注射完成后，用鱼用系统水和一次性3.4 mL移液管冲洗出琼脂糖凹槽中的胚胎，转移至标记好的培养皿中。将胚胎置于28.5 °C培养箱中培养发育。全天定期检查，移除死亡胚胎，并用含0.1%亚甲蓝的鱼用水更换培养液。
  16. 注射后约6-8小时，取10个单独的注射胚胎，采用Hotshot法提取基因组DNA18。
  17. 次日早晨，使用配备荧光光源的解剖显微镜筛选出非卵黄组织中显示GFP荧光的胚胎。这些胚胎应含有已注射的构建物。
  18. 进行Tol2切除实验以检测转座子活性，方法如前所述19。若能检测到切除的质粒，则保留注射后的胚胎并继续培育。若无法检测到切除的质粒，则需重复Tol2 mRNA合成及显微注射过程，直至Tol2切除实验获得阳性结果。

4. 建立转基因 ASAP1 鱼株 Tg(ubi:ASAP1)

  1. 按照斑马鱼手册中先前所述的方法，将显微注射后的鱼（F0 代）培育至成年20。该过程通常需要约 4 个月。
  2. 选取一条成年 F0 鱼，与一条性别相反的野生型鱼进行交配。在当天晚些时候收集受精卵。将收集到的鱼胚胎置于含 0.1% 亚甲蓝的鱼水中，在 28.5 °C 的培养箱中培养。
  3. 在第三天，使用配备 GFP 滤光片的荧光体视显微镜观察鱼胚胎。若存在绿色荧光的鱼胚胎，则将其挑选出来，并作为 F1  代转基因鱼 Tg(ubi:ASAP1) 培育至成年。
    注意：由于大多数亲代 F0 鱼为生殖系遗传嵌合体，因此不会符合孟德尔分离比。
  4. 将单条 F1 代成年鱼与野生型鱼交配并收集鱼胚胎。挑选出绿色荧光的鱼胚胎，并将其培育至成年，获得 F2 代鱼。
    注意：若仅含有单个转基因，则绿色与非绿色鱼胚胎的比例应接近 1:1。
  5. 为观察类似恶性外周神经鞘瘤（MPNST）等肿瘤中的电势变化，可将 F2 代 Tg(ubi:ASAP1) 鱼与 rpl35hi258/wt 鱼进行杂交。已知在 6 至 8 月龄的成年鱼中开始出现可见肿瘤21,22。

5. 成像

  1. 为了成像斑马鱼胚胎，选取多个F2代创始人鱼，分别与野生型鱼进行配对交配。根据斑马鱼发育阶段指南23，收集处于不同目标发育阶段的鱼胚胎。
  2. 对于早期阶段的鱼胚胎，在直径为10 cm的培养皿中，使用解剖显微镜和镊子小心剥离并去除胚胎的绒毛膜。
  3. 使用3.4 mL一次性移液管，将少量鱼胚胎转移至含有3%甲基纤维素的凹面载玻片上。在荧光解剖显微镜下，用针调节胚胎至所需位置，以观察细胞内的GFP活性。
  4. 对于运动阶段的鱼胚胎（大于12体节期），在转移至载玻片前，使用0.05%甲磺酸三卡因对胚胎进行麻醉。简言之，将鱼胚胎浸入含0.05%甲磺酸三卡因的鱼水中，直至其停止游动并丧失身体平衡。同时，在载玻片上的甲基纤维素中加入一滴0.05%甲磺酸三卡因。
  5. 对于小于12体节期的鱼胚胎，使用配备兼容相机和软件的落射荧光复合显微镜进行成像；对于大于12体节期的鱼胚胎，则使用荧光解剖显微镜。
  6. 为了成像肿瘤细胞电压，首先识别患有MPNST肿瘤的鱼，然后用0.05%甲磺酸三卡因麻醉该鱼。对于整体成像，将鱼放入直径为10 cm的培养皿中。如需观察肿瘤细胞的电活动，可在整体成像后将肿瘤组织解剖取出。

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结果

在成功的显微注射中，超过50%的注射鱼胚胎将在体细胞中表现出一定程度的绿色荧光 ，且大多数胚胎在Tol2转座子切除实验中呈阳性（图2）。经过与野生型鱼杂交2-4代（直至荧光鱼比例达到预期的孟德尔分离比50%），将转基因鱼用于成像实验，以追踪胚胎发育过程中的细胞膜电位变化。首先，检测了斑马鱼早期胚胎发育阶段整个细胞周期中的膜电位变化。观察到，在卵裂沟形成之前，细胞发生超极化现象（图3A-3C，以及补充视频1）。此外，在1-3日龄的鱼胚胎中，不同组织表现出多样化的膜电位（图3D-3G）。例如，与邻近组织或器官相比，体节和脊索通常处于超极化状态。当斑马鱼胚胎具备运动能力后，我们还能检测到神经肌肉的电活动（图4，补充视...

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讨论

尽管胚胎发育和人类疾病过程中的细胞与组织水平电活动早在很久以前就被发现， 体内 动态电学变化及其生物学作用在很大程度上仍不清楚。其中一个主要挑战在于如何可视化并量化这些电学变化。膜片钳技术在追踪单个细胞方面具有突破性意义，但其在脊椎动物胚胎中的应用受到限制，因为胚胎由大量细胞组成。目前使用的化学电压染料也存在不足，主要表现为灵敏度、特异性和毒性方面的问题。近年来在基因编码电压指示剂（GEVIs）研发方面的努力，为我们提供了可视化细胞电活动的新途径。 体内 并实时观察。在此，我们展示了创建斑马鱼电活动报告基因品系 Tg(ubi:ASAP1

利用这种报告基因鱼系，我们展示了可以在斑马鱼胚胎中监测到的细胞电活动。细胞膜电位的变化与早期胚胎发育过程中的细胞周期密切相关。我们观察到，在卵裂沟形成/细胞分裂之前会发生超极化现象（图3），这与目前普遍认为在细胞分裂前发生去极化的观点相反26。因此，其他动物和人类 细胞在细胞周期...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本出版物中报告的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 R35GM124913，同时得到普渡大学 PI4D 激励计划以及普渡大学兽医学院内部竞争性基础研究基金项目的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。我们感谢 Koichi Kawakami 提供 Tol2 载体，Michael Lin 提供 ASAP1 载体，以及 Leonard Zon 通过 Addgene 提供的 ubi 启动子载体。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14 mL 细胞培养管VWR60818-725大肠杆菌培养
琼脂糖电泳槽Thermo ScientificOwl B2DNA 电泳
Agarose RAAmrescoN605-500G用于制备显微注射凝胶
Attb1-ASAP1-F 引物IDT DNAGGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
Attb2-ASAP1-R 引物IDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA		用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
明场解剖显微镜NikonSMZ 745去壳、显微注射、样品固定
彩色相机ZeissAxioCam MRc鱼胚胎图像记录
凹面载玻片VWR48336-001在成像过程中固定鱼胚胎
一次性移液管（3.4 mL）Thermo Scientific13-711-9AM转移鱼胚胎和水
内切核酸酶 Not INEBR0189L用于线性化质粒 DNA
落射荧光复合显微镜ZeissAxio Imager.A2鱼胚胎成像
落射荧光体视解剖显微镜ZeissStereo Discovery.V12鱼胚胎成像
荧光光源Lumen dynamicsX-cite seris 120荧光显微镜的光源
#5 镊子WPI500342去壳和折断注射针
Gateway BP Clonase II 酶混合物Thermo Scientific11789020Gateway BP 重组克隆
Gateway LR Clonase II Plus 酶Thermo Scientific12538120Gateway LR 重组克隆
凝胶 DNA 回收试剂盒Zymo ResearchD4002DNA 凝胶纯化
上样尖端Eppendorf930001007用于将注射溶液装入毛细玻璃针
甲基纤维素（1600 cPs）Alfa Aesar43146鱼胚胎固定
亚甲蓝Sigma-AldrichM9140抑制培养皿中的真菌爆发
显微注射模具Adaptive Science ToolsTU-1制备用于注射过程中固定鱼胚胎的琼脂糖模具托盘
显微注射仪WPIPneumatic Picopump PV820显微注射装置
显微操作器WPIMicroinjector MM3301R显微注射操作
微量移液器拉制仪Sutter instrumentP-1000用于制备毛细玻璃针
矿物油AmrescoJ217-500ml用于校准注射体积
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒Thermo ScientificAM1340mRNA 体外转录
单色相机ZeissAxioCam MRm鱼胚胎图像记录
质粒小提试剂盒Zymo ResearchD4020制备少量质粒 DNA
塑料培养皿VWR25384-088在成像过程中固定鱼或鱼胚胎
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015体外转录后 mRNA 的纯化
分光光度计Thermo ScientificNanoDrop 2000用于测定 DNA 和 RNA 浓度
阶段测微尺Am ScopeMR100显微注射体积校准
PCR 仪Bio-RadT100基因克隆中的 DNA 扩增
薄壁玻璃毛细管WPITW100F-4制作毛细玻璃针的原材料
Tol2-exL1 引物IDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 切除检测
Tol2-exR 引物IDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGTol2 切除检测
TOP10 化学感受态大肠杆菌Thermo ScientificC404006基因克隆中用于转化
三卡因甲磺酸盐Sigma-AldrichA5040用于麻醉鱼或鱼胚胎
302 nm 紫外透射仪UVPM-20VDNA 可视化
水浴锅Thermo Scientific2853用于基因克隆中的转化过程

参考文献

  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

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