Method Article

斑马鱼早期胚胎和肿瘤细胞电活动的可视化研究

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

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在这里, 我们展示了创建一个细胞电压报告斑马鱼线的过程, 以可视化胚胎发育, 运动和鱼类肿瘤细胞在体内。

Abstract

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生物电, 由离子通道和细胞膜上的泵介导的内源电信号, 在兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程和其他许多生物学过程中起着重要作用, 如胚胎发展模式。但是, 在脊椎动物胚胎发生中需要进行体内电活动监测。基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 的发展, 使我们有可能为这一挑战提供解决方案。在这里, 我们描述如何创建一个转基因的电压指示器斑马鱼使用已建立的电压指示器, ASAP1 (动作电位加速传感器 1), 作为一个例子。本研究选择了 Tol2 套件和无处不在的斑马鱼启动子ubi 。我们还解释了网关站点特定克隆的过程, Tol2 座子斑马鱼转基因, 以及早期的鱼类胚胎和鱼类肿瘤的成像过程, 使用常规 epifluorescent 显微镜。利用这条鱼线, 我们发现在斑马鱼胚胎发生和鱼类幼虫运动过程中存在着细胞电压的变化。此外, 据观察, 在一些斑马鱼恶性周围神经鞘肿瘤, 肿瘤细胞一般极化相比, 周围正常组织。

Introduction

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生物电是指由离子通道和位于细胞膜1上的泵所介导的内源电子信号。细胞膜上的离子交换, 以及耦合电位和电流的变化, 对于兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程是必不可少的。此外, 生物电和离子梯度也有多种其他重要的生物学功能, 包括能量储存, 生物合成和代谢物运输。生物电信号也被发现作为胚胎模式形成的调节器, 如体轴, 细胞周期和细胞分化的1。因此, 这是至关重要的了解许多人类先天性疾病的结果, 这类信号的错误监管。虽然膜片钳已被广泛用于记录单个细胞, 但它仍然远未理想的同时监测在胚胎发育过程中的多个细胞在体内。此外, 由于其特异性、敏感性和毒性, 电压敏感小分子对于体内应用也不理想。

创建各种基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 提供了一个新的机制来克服这一问题, 并允许易于应用研究胚胎发育, 即使他们最初是为了监测神经单元格2,3。当前可用的 GEVIs 之一是动作电位 1 (ASAP1)4的加速传感器。它由电压敏感磷酸酶的电压传感域和循环排列绿色荧光蛋白组成。因此, ASAP1 允许可视化的细胞电位变化 (极化: 明亮的绿色; 退极化: 深绿色)。ASAP1 有2毫秒的动力学, 可....

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Protocol

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斑马鱼被安置在一个 AAALAC 批准的动物设施中, 所有的实验都是根据普渡动物保育和使用委员会 (PACUC) 批准的协议进行的。

1. Tol2 座子质粒结构制备

注: Tol2 是在鳉鱼中发现的座子, 广泛应用于斑马鱼研究社区8,9。它已成功地应用于网关站点特定的基于重组的克隆系统, 并被称为 Tol2 套件10。Tol2 套件允许创建自定义表达式构造的更方便的方法, 同时也提高了转基因的效率。因此, 这是一个简单的决定, 利用这个系统, 并创建一个无处不在的 ASAP1 表达斑马鱼线使用经过验证的泛素启动器来驱动 ASAP111。

  1. 创建中间条目 ASAP1 构造: pDONR221-ASAP1
    1. 获得基因编码的电压传感器 ASAP1 构造, pcDNA3.1/普洛-ASAP1 (Plasmid#52519), 从 Addgene。要放大 ASAP1 编码区域, 请使用自定义的引物 (attB1-ASAP1F 和 attB2-ASAP1R) 在底漆的 5 ' 末端 (图 1) 两侧 attB 序....

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Results

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在一个成功的注射, 超过50% 注入鱼类胚胎将显示一定程度的绿色荧光在体细胞, 其中大部分将是积极的 Tol2 座子的消费检测 (图 2)。经过2-4 代与 wildtype 鱼的杂交 (直到荧光鱼达到 50%, 预期的孟德尔比), 转基因鱼被用于成像实验, 以跟踪细胞膜电位在胚胎发育过程中。首先, 在斑马鱼早期胚胎发育阶段, 在整个细胞周期内检查膜电位的变化。据观察, 细胞超极化搏在沟沟形成之前(图 3A-3C和辅助视频 1)。另外, 不同组织在1-3 天的老鱼胚中表现出多种膜电位。(图 3D-3G)。例如, 胚胎背部和脊索通常超极化搏, 与相邻的组织/器官相比。一旦斑马鱼胚胎能够移动, 我们也能够检测神经肌肉电活动 (图 4,

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Discussion

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虽然早在胚胎发育和人类疾病中发现了细胞和组织水平的电活动, 但体内动态电变化及其生物学作用仍然很大程度上是未知的。其中一个主要的挑战是可视化和量化的电气变化。膜片钳技术是跟踪单细胞的一种突破, 但是它在脊椎动物胚胎中的应用是有限的, 因为它们是由许多细胞组成的。由于敏感度、特异度和毒性, 目前的化学电压染料也不理想。最近在 GEVIs 发明方面的努力为我们提供了一个新的途径, 可以将细胞电活动在体内和实时地可视化。在这里, 我们展示了创建斑马鱼电子记者线的过程, Tg (ubi:ASAP1)。

利用这条鱼线, 我们展示了可以在斑马鱼胚胎中监测的细胞电活动。在早期胚胎发育过程中, 电压变化与细胞周期呈高度相关。我们观察到, 极化发生在分裂沟/细胞分裂的形成之前 (图 3)。这与当前的知识相反, 在细胞分裂26之前, 极化现象会发生。因此, 更多细节的细胞膜电压变化期间, 其他动物和人类细胞周期, 这是否与组织上下文有关, 需.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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本出版物所报道的研究工作得到国家卫生研究院全国普通医学研究所的支持, R35GM124913、普渡大学 PI4D 奖励计划和 PVM 内部竞争基础研究基金项目。内容完全是作者的责任, 不一定代表供资代理人的官方意见。我们感谢高一川上刚为 Tol2 构造, 林为 ASAP1 构造, 和伦纳德 Zon为ubi 启动子构造通过 Addgene。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14mL 细胞培养管VWR60818-725大肠杆菌培养
琼脂糖电泳槽Thermo ScientificOwl B2DNA 电泳
琼脂糖 RAAmrescoN605-500G用于制备注射凝胶
Attb1-ASAP1-F 引物IDT DNAGGGGACAAGTTTGTACAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
Attb2-ASAP1-R 引物IDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA		用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
明场解剖范围尼康SMZ 745去绒毛膜、显微注射、安装
彩色相机蔡司AxioCam MRc鱼胚胎图像记录
凹面载玻片VWR48336-001用于在成像过程中保持鱼胚胎
一次性移液管 3.4 mlThermo Scientific13-711-9AM鱼胚胎和水转移
核酸内切酶，非 INEBR0189L用于线性化质粒 DNA
表扬化合物范围ZeissAxio Imager.A2Fish胚胎成像
Epifuorescent 立体解剖镜ZeissStereo Discovery.V12鱼胚胎成像
荧光光源流明动力学X-cite 系列 120荧光显微镜光源
镊子 #5WPI500342去绒毛膜和断针
Gateway BP Clonase II 酶混合物Thermo Scientific11789020Gateway BP 重组克隆
Gateway LR Clonase II Plus 酶Thermo Scientific12538120Gateway LR 重组克隆
凝胶 DNA 回收试剂盒Zymo ResearchD4002DNA 凝胶纯化
上样头Eppendorf930001007用于将注射液上样到头状针中
甲基纤维素 （1600cPs）Alfa Aesar43146鱼胚胎镶嵌
亚甲蓝Sigma-AldrichM9140抑制培养皿中的真菌爆发
显微注射模具适应性科学工具TU-1准备用于在注射过程中容纳鱼胚胎的 agaorse 模具托盘
显微注射器WPI气动皮秒泵 PV820显微注射注射器
显微作器WPI显微注射器 MM3301R显微注射作
微量移液器拉拔器萨特仪器P-1000用于制备毛细管针
矿物油AmrescoJ217-500ml用于校准注射量
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒Thermo ScientificAM1340mRNA 体外转录
单色相机蔡司AxioCam MRm鱼胚胎图像记录
质粒小量制备试剂盒Zymo ResearchD4020制备少量质粒 DNA
塑料培养皿VWR25384-088用于在成像过程中保持鱼或鱼胚胎
RNA 清洁 &Concentrator-5Zymo ResearchR1015体外转录后 mRNA 清洁
分光光度计Thermo ScientificNanoDrop 2000用于测量 DNA 和 RNA 浓度
载物台 千分尺 Am ScopeMR100显微注射体积校准
热循环仪Bio-RadT100用于基因克隆的 DNA 扩增
薄壁玻璃毛细管WPITW100F-4用于制作帽针的玻璃原料
Tol2-exL1 引物IDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 消费测定
Tol2-exR 引物IDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAGTol2 消费测定
TOP10 化学感受态大肠杆菌Thermo ScientificC404006用于基因克隆
过程中的转化甲磺酸三卡因Sigma-AldrichA5040用于麻醉鱼或鱼胚胎
紫外透射照明器 302nmUVPM-20VDNA 可视化
水浴Thermo Scientific2853用于基因克隆的转化过程

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al.

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