斑马鱼早期胚胎和肿瘤细胞电活动的可视化研究

Summary

在这里, 我们展示了创建一个细胞电压报告斑马鱼线的过程, 以可视化胚胎发育, 运动和鱼类肿瘤细胞在体内。

Abstract

生物电, 由离子通道和细胞膜上的泵介导的内源电信号, 在兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程和其他许多生物学过程中起着重要作用, 如胚胎发展模式。但是, 在脊椎动物胚胎发生中需要进行体内电活动监测。基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 的发展, 使我们有可能为这一挑战提供解决方案。在这里, 我们描述如何创建一个转基因的电压指示器斑马鱼使用已建立的电压指示器, ASAP1 (动作电位加速传感器 1), 作为一个例子。本研究选择了 Tol2 套件和无处不在的斑马鱼启动子ubi 。我们还解释了网关站点特定克隆的过程, Tol2 座子斑马鱼转基因, 以及早期的鱼类胚胎和鱼类肿瘤的成像过程, 使用常规 epifluorescent 显微镜。利用这条鱼线, 我们发现在斑马鱼胚胎发生和鱼类幼虫运动过程中存在着细胞电压的变化。此外, 据观察, 在一些斑马鱼恶性周围神经鞘肿瘤, 肿瘤细胞一般极化相比, 周围正常组织。

Introduction

生物电是指由离子通道和位于细胞膜¹上的泵所介导的内源电子信号。细胞膜上的离子交换, 以及耦合电位和电流的变化, 对于兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程是必不可少的。此外, 生物电和离子梯度也有多种其他重要的生物学功能, 包括能量储存, 生物合成和代谢物运输。生物电信号也被发现作为胚胎模式形成的调节器, 如体轴, 细胞周期和细胞分化的¹。因此, 这是至关重要的了解许多人类先天性疾病的结果, 这类信号的错误监管。虽然膜片钳已被广泛用于记录单个细胞, 但它仍然远未理想的同时监测在胚胎发育过程中的多个细胞在体内。此外, 由于其特异性、敏感性和毒性, 电压敏感小分子对于体内应用也不理想。

创建各种基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 提供了一个新的机制来克服这一问题, 并允许易于应用研究胚胎发育, 即使他们最初是为了监测神经单元格^2,3。当前可用的 GEVIs 之一是动作电位 1 (ASAP1)⁴的加速传感器。它由电压敏感磷酸酶的电压传感域和循环排列绿色荧光蛋白组成。因此, ASAP1 允许可视化的细胞电位变化 (极化: 明亮的绿色; 退极化: 深绿色)。ASAP1 有2毫秒的动力学, 可以跟踪阈的潜在变化⁴。因此, 这一遗传工具允许在实时生物监测活细胞的新水平的有效性。进一步了解生物电在胚胎发育和许多人类疾病 (如癌症) 中的作用, 将为疾病治疗和预防的关键机制提供新的基础。

斑马鱼已被证明是一个强大的动物模型, 研究发育生物学和人类疾病, 包括癌症^5,6。他们分享70% 同源基因与人, 并且他们有相似的脊椎动物生物⁷。斑马鱼提供相对容易的护理, 大的离合器大小的鸡蛋, 易于处理的遗传学, 容易转基因, 和透明的外部胚胎发育, 这使他们成为一个优越的系统在体内成像^5,6。随着大量的突变鱼线来源已经存在和一个完全有序的基因组, 斑马鱼将提供一个相对无限的科学发现范围。

为了研究细胞的体内实时电活动, 我们利用斑马鱼模型系统和 ASAP1。本文介绍了如何利用 Tol2 座子转基因将荧光电压生物传感器 ASAP1 到斑马鱼基因组中, 并在胚胎发育、鱼类幼虫运动和活肿瘤中可视化细胞电活动.

Protocol

斑马鱼被安置在一个 AAALAC 批准的动物设施中, 所有的实验都是根据普渡动物保育和使用委员会 (PACUC) 批准的协议进行的。

1. Tol2 座子质粒结构制备

注: Tol2 是在鳉鱼中发现的座子, 广泛应用于斑马鱼研究社区^8,9。它已成功地应用于网关站点特定的基于重组的克隆系统, 并被称为 Tol2 套件¹⁰。Tol2 套件允许创建自定义表达式构造的更方便的方法, 同时也提高了转基因的效率。因此, 这是一个简单的决定, 利用这个系统, 并创建一个无处不在的 ASAP1 表达斑马鱼线使用经过验证的泛素启动器来驱动 ASAP1¹¹。

1. 创建中间条目 ASAP1 构造: pDONR221-ASAP1
   1. 获得基因编码的电压传感器 ASAP1 构造, pcDNA3.1/普洛-ASAP1 (Plasmid#52519), 从 Addgene。要放大 ASAP1 编码区域, 请使用自定义的引物 (attB1-ASAP1F 和 attB2-ASAP1R) 在底漆的 5 ' 末端 (图 1) 两侧 attB 序列建立 PCR。Phusion DNA 聚合酶的高效性, PCR 条件根据先前发布的协议¹²进行了优化。
   2. 将50µL PCR 产品装入1% 泰式凝胶中, 使用有200µL 提示的常规吸管, 并在水平凝胶罐中160伏进行电泳, 约30分钟。
   3. 检查在 uv transilluminator (353 nm) 下的凝胶, 用刀片/手术刀在 uv transilluminator 下使用刮刀/刀, 如先前发布的^13,14, 并将含有凝胶样品的 DNA 放入干净的1.5 毫升离心管。
   4. 对 ASAP1 PCR 产品进行凝胶纯化。使用商业 DNA 凝胶纯化试剂盒, 在制造商的指导下, 恢复分离凝胶中的 dna, 并将 dna 洗脱到20µL 水中。以1µL 为样本, 用分光光度计测量 DNA 浓度。使用水作为空白控件¹⁵流软件指令。
   5. 取100的纯化 PCR 产物, 并将其与 150 pDONR221 质粒在10µL 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, 1 毫米 EDTA pH 8.0)¹⁶混合。添加2µL 的 BP Clonase II 反应, 并在室温下孵化反应在夜间。
   6. 第二天, 将蛋白酶 K 的1µL 加入反应中, 并在37摄氏度上孵化出30分钟的反应。
   7. 执行转换。转移反应, 并与50µL Top10 能力的大肠杆菌细胞混合, 并在冰上孵化细胞30分钟。然后, 将反应管转移到42°c 水浴中1分钟, 立即取出管并在冰上孵化2分钟。接下来, 把管子放入一个37摄氏度的振动筛中, 孵化1小时。
   8. 取出管子, 将细胞板到卡那霉素 LB 板上。接下来, 在37摄氏度的一夜之间孵化出盘子 (16-18 小时)。
   9. 选择单一和分离良好的殖民地, 并接种到14毫升细胞培养管与3毫升的 LB 培养基。文化他们隔夜在37°c 在一个振动筛以自转速度 250 rpm (自转每分钟)。
   10. 在其指令手册¹⁷之后, 使用商业 miniprep 工具包执行 miniprep。
   11. 序列3-4 质粒与 pDONR221-ASAP1 测序, 以识别阳性克隆使用 M13F 和 M13R 序引物。
2. 创建用于显微注射的 Tol2 构造: pDestTol2-ubi-ASAP1
   1. 选择已验证 pDONR221-ASAP1 克隆的测序, 并使用水作为空白控件¹⁵的软件指令后, 用分光光度计测量其 DNA 浓度。
   2. 采取100µg 的 pDONR221-ASAP1 和混合它与100µg Tol2 套件5端质粒 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), µg p3E-polyA (Tol2 套件 #302) 和150µg pDestTol2pA2 (Tol2 套件 #394)。使用 TE 缓冲器 (10 毫米三, 1 毫米 EDTA, pH 8.0) 在1.5 毫升离心管中调整总容积到8µL, 并由 2-5 s 短涡混合。然后, 添加2µL 的 LR Clonase II 加, 并孵化在室温下的反应过夜。
   3. 第二天, 用10µL 吸管将蛋白酶 K 的1µL 加入反应中, 并在37摄氏度上孵化出30分钟的反应。
   4. 执行转换并标识正克隆, 如上文所述 (步骤 1.1. 7-11)。
   5. 使用分光光度计¹⁵测量测序验证的 pDestTol2-ubi-ASAP1 克隆 (图 1B) 的 DNA 浓度。通常集中是大约 200 ng 或µL。

2. 制备 Tol2 Transposase mRNA 和注射液

1. 将大肠杆菌甘油 pCS2FA-transposase 质粒 (Tol2 试剂盒 #396) 的股票用灭菌的接种循环放到 LB 板上 (用100µg/毫升氨苄西林)。一夜之间孵化37摄氏度的盘子。第二天, 选择一个单一的殖民地, 并接种它成3毫升磅 (100 µg/毫升氨苄西林) 使用消毒10µL 吸管提示。文化它隔夜在37°c 在一个振动筛以 250 rpm 的自转速度。
2. 在大肠杆菌区域性上使用商业 miniprep 工具包在其指导手册之后执行 miniprep。用1分钟离心机在 1.4万 rpm 洗脱质粒 dna 30-50 µL, 用分光光度计测定其 dna 浓度。
3. 进行线性化1-2 µg 质粒与不我限制性和纯化 dna 与 dna 清洁套件后, 它的指导手册后, 我不消化。洗脱将 DNA 转化为5µL 水, 离心1.4万转1分钟。预期浓度约为200-300 µL。
4. 执行体外转录没有我线性化 pCS2FA-transposase 作为 DNA 模板使用商业 SP6 转录试剂盒。
5. 一旦反应完成, 纯化 Tol2 transposase mRNA 使用商业 RNA 清洁套件后, 制造商的指示。最后, 将洗脱 mRNA 转化为20µL RNAase 水, 并测定分光光度计中的 RNA 浓度。预期浓度约为1-3 µg/µL. 如果需要, 样品可以储存在-80 摄氏度的冰箱里。
6. 用 Tol2 在 transposase 管中混合20µL pDestTol2-ubi-ASAP1 和µL 离心 mRNA (100 ng/吹打), 制备微注射溶液。为了防止重复解冻和冷冻引起的核酸降解, 整除6µL 每管, 并将其存储在-80 °c 冷藏库中供将来使用。

3. 显微注射

1. 在注射前的下午, 设置4-6 个繁殖槽, 至少有2名男性和2名女性。这些鱼不能在下午喂饱。这一步骤将减少鱼的数量和节省时间, 以清洁他们第二天早上, 同时也有助于诱导育种的反应。
2. 第二天早上, 从-80 °c 冰箱中取出准备好的注射液 (pDestTol2ubi-ASAP1 构造和 Tol2 mRNA), 并将其放在冰上。
3. 拉在鱼饲养池的分隔, 让鱼交配。一般来说, 鱼在拉出分隔线后20-30 分钟内产卵。如果没有, 再等1-2 小时。有些鱼可能根本不下蛋。在这种情况下, 重复这个实验的鱼胚收集。
4. 在等待, 确保有针准备与尖端打破了一个角度创建一个斜面边缘与镊子, 或打破一个微妙的任务雨刷。
   1. 使用以下参数在微拉拔上从毛细管玻璃上拔出针头: 热 545;拉 60;速度 80;时间 250;压力500。用镊子在解剖范围 (用眼睛片断标尺为直径估计) 打破针在一个角度近似45°。根据 microinjector 的设置, 所需的针径可以是可变的, 但更小的直径是降低胚胎死亡率的首选。
5. 一旦鱼产卵, 收集他们在一个10厘米直径培养皿, 并把他们带到解剖范围。清除所有异常的胚胎和鱼废料。
6. 将受精的胚胎吸管成3% 琼脂糖注射模。去除多余的水分, 以帮助保持胚胎的到位。
7. 一旦所有的行都充满了可行的胚胎, 安排它们, 使单个细胞都朝同一个方向向针, 这是关于45°角度水平。这将使注入更容易后。
8. 戴上手套时, 用20µL 装吸管尖, 从冰管上取出5µL。
9. 小心地将尖端插入到断毛管的后端, 直到它开始圆锥, 以使试剂接近尖端。如果还有气泡, 摇动针头, 确保不折断笔尖。
10. 将针头直接插入微注射针夹中, 仔细拧紧, 直到针固定到位。将角度调整为关于45°。
11. 一旦针准备好并附上, 打开显微镜和气体压力罐。商业 CO₂坦克通常是好的为此目的。注射容积由保持和弹射压力调整: 大约 0.5 psi 为持有和 30 psi 为弹射。请务必检查解决方案时, 按下踏板。
12. 使用一滴矿物油的舞台千分尺, 调整溶液的体积和流量, 以150µm 直径 (约 2 nL)。确保背部压力会让少量滴出针。如果没有足够的背部压力, 毛细管作用将导致液体进入针头和破坏 mRNA。
13. 一旦针被校准, 开始注射的结构进入受精胚胎的单细胞。
    注意: 这需要大量的练习, 耐心和技巧, 因为细胞膜很难刺穿。重要的是, 把溶液注入细胞, 而不是蛋黄, 以生成转基因斑马鱼。这与吗啉代注射液不同。只要结构进入细胞, 针进入细胞的哪一侧就无关紧要了。如果注入蛋黄而不是细胞, 转基因的成功率会很低。单细胞阶段注射也很重要, 或体细胞嵌合体鱼将被创造。这将减少转基因进入生殖细胞的几率。
14. 使用凝胶缺口的边缘提供一个支持, 保持胚胎到位, 并允许针施加压力, 而不移动胚胎。一旦针的尖端是在单一的细胞, 按下踏板释放所需的解决方案量。对所有的胚胎重复这个过程。
15. 完成后, 将注入的胚胎通过用鱼系统水和一次性的3.4 毫升转移吸管从琼脂糖槽中冲洗出来, 将注射的胚转移到标记皿中。将胚胎储存在28.5 摄氏度的孵化器中, 让它们发育。在一天内检查清除死鱼胚胎, 并在鱼水中用0.1% 亚甲基蓝代替水。
16. 注射后大约6-8 小时, 取10个单独注射的鱼胚, 并使用最厉害的方法¹⁸制备基因组 DNA。
17. 第二天早上, 用一个荧光光源解剖显微镜来整理在非蛋黄组织中显示 GFP 的胚胎。这些鱼类胚胎应包含注入结构。
18. 执行 Tol2 检验以检查座子活动, 如前所述¹⁹。如果能检测到切除的质粒, 则保留注入的鱼类胚胎并将其饲养。如果不能检测到切除的质粒, 重复 Tol2 mRNA 的合成和显微注射过程, 直到达到 Tol2 的阳性结果。

4. 建立转基因 ASAP1 鱼, Tg (ubi: ASAP1)

1. 将注入的鱼 (F₀代) 提高到成年, 如斑马鱼书²⁰中所述。这通常需要4月左右。
2. 采取一个单一的成人 F₀鱼和交叉它与单一的性别 wildtype 鱼。在后天繁殖后收集鱼类胚胎。将收集到的鱼类胚胎保存在28.5 摄氏度的鱼水孵化箱中, 0.1% 亚甲基蓝。
3. 第三天, 用 GFP 过滤器检查荧光解剖显微镜下的鱼胚。分类出绿色鱼类胚胎, 如果有的话, 并提高他们成年为 F₁代转基因鱼, Tg (ubi: ASAP1)。
   注: 由于大多数父母 F₀鱼都是胚芽线遗传合体, 因此不需要孟德尔比。
4. 交叉单 F₁成年鱼与 wildtype 鱼和收集鱼类胚胎。将绿色鱼类的胚胎分类, 并将它们提高到成年时为 F₂代鱼。
   注: 如果有单一的转基因, 绿色和非绿色鱼类胚胎应接近1:1。
5. 要查看肿瘤像恶性周围神经鞘瘤 (MPNST) 的电位变化, 交叉 F₂代 Tg (ubi: ASAP1) 鱼与rpl35^hi258/wt 鱼。众所周知, 可见肿瘤开始在6-8 月大的成人^21,22中找到。

5. 成像

1. 为了图像斑马鱼胚胎, 采取多 F₂世代创建者鱼并且横渡他们与 wildtype 鱼在各自的对。根据斑马鱼的分期指南²³, 在不同的理想发育阶段收集鱼类胚胎。
2. 在鱼胚的早期阶段, 在10厘米直径的培养皿中, 用鱼系统水, 在解剖范围内仔细地剥除胚胎的 chorions。
3. 用3.4 毫升一次性转移吸管将一些鱼类胚胎转移到凹玻璃滑块上, 使用3% 纤维素。将胚胎调整到所需位置, 使用荧光解剖范围下的针来查看蜂窝 GFP 活动。
4. 对于鱼类胚胎的移动阶段 (较早于 12 somite 阶段), 使用 0.05% tricaine 甲磺酸麻醉鱼胚, 然后将其转移到滑梯上。简单地, 鱼胚在鱼水中被发现成 0.05% tricaine 甲磺酸, 直到它们停止游泳和失去身体平衡。此外, 添加一滴 0.05% tricaine 甲磺酸与纤维素在幻灯片上。
5. 对于不到 12 somite 阶段的鱼类胚胎, 使用一种免疫荧光复合显微镜与兼容的相机和软件进行成像。对于12岁以上的 somite 阶段鱼类胚胎, 使用荧光解剖显微镜。
6. 为了图像肿瘤细胞的电压, 首先发现鱼与 MPNST 肿瘤。然后, 麻醉鱼与 0.05% tricaine 甲磺酸。对于整个安装成像, 把鱼变成一个10厘米直径培养皿。为了查看肿瘤细胞的电活动, 在全装成像后可能会解剖出鱼肿瘤。

Results

在一个成功的注射, 超过50% 注入鱼类胚胎将显示一定程度的绿色荧光在体细胞, 其中大部分将是积极的 Tol2 座子的消费检测 (图 2)。经过2-4 代与 wildtype 鱼的杂交 (直到荧光鱼达到 50%, 预期的孟德尔比), 转基因鱼被用于成像实验, 以跟踪细胞膜电位在胚胎发育过程中。首先, 在斑马鱼早期胚胎发育阶段, 在整个细胞周期内检查膜电位的变化。据观察, 细胞超极化搏在沟沟形成之前(图 3A-3C和辅助视频 1)。另外, 不同组织在1-3 天的老鱼胚中表现出多种膜电位。(图 3D-3G)。例如, 胚胎背部和脊索通常超极化搏, 与相邻的组织/器官相比。一旦斑马鱼胚胎能够移动, 我们也能够检测神经肌肉电活动 (图 4,

Discussion

虽然早在胚胎发育和人类疾病中发现了细胞和组织水平的电活动, 但体内动态电变化及其生物学作用仍然很大程度上是未知的。其中一个主要的挑战是可视化和量化的电气变化。膜片钳技术是跟踪单细胞的一种突破, 但是它在脊椎动物胚胎中的应用是有限的, 因为它们是由许多细胞组成的。由于敏感度、特异度和毒性, 目前的化学电压染料也不理想。最近在 GEVIs 发明方面的努力为我们提供了一个新的途径, 可以将细胞电活动在体内和实时地可视化。在这里, 我们展示了创建斑马鱼电子记者线的过程, Tg (ubi:ASAP1)。

利用这条鱼线, 我们展示了可以在斑马鱼胚胎中监测的细胞电活动。在早期胚胎发育过程中, 电压变化与细胞周期呈高度相关。我们观察到, 极化发生在分裂沟/细胞分裂的形成之前 (图 3)。这与当前的知识相反, 在细胞分裂²⁶之前, 极化现象会发生。因此, 更多细节的细胞膜电压变化期间, 其他动物和人类细胞周期, 这是否与组织上下文有关, 需...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14mL 细胞培养管	VWR	60818-725	大肠杆菌培养
琼脂糖电泳槽	Thermo Scientific	Owl B2	DNA 电泳
琼脂糖 RA	Amresco	N605-500G	用于制备注射凝胶
Attb1-ASAP1-F 引物	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
Attb2-ASAP1-R 引物	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增
明场解剖范围	尼康	SMZ 745	去绒毛膜、显微注射、安装
彩色相机	蔡司	AxioCam MRc	鱼胚胎图像记录
凹面载玻片	VWR	48336-001	用于在成像过程中保持鱼胚胎
一次性移液管 3.4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	鱼胚胎和水转移
核酸内切酶，非 I	NEB	R0189L	用于线性化质粒 DNA
表扬化合物范围	Zeiss	Axio Imager.A2	Fish胚胎成像
Epifuorescent 立体解剖镜	Zeiss	Stereo Discovery.V12	鱼胚胎成像
荧光光源	流明动力学	X-cite 系列 120	荧光显微镜光源
镊子 #5	WPI	500342	去绒毛膜和断针
Gateway BP Clonase II 酶混合物	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP 重组克隆
Gateway LR Clonase II Plus 酶	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR 重组克隆
凝胶 DNA 回收试剂盒	Zymo Research	D4002	DNA 凝胶纯化
上样头	Eppendorf	930001007	用于将注射液上样到头状针中
甲基纤维素 （1600cPs）	Alfa Aesar	43146	鱼胚胎镶嵌
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140	抑制培养皿中的真菌爆发
显微注射模具	适应性科学工具	TU-1	准备用于在注射过程中容纳鱼胚胎的 agaorse 模具托盘
显微注射器	WPI	气动皮秒泵 PV820	显微注射注射器
显微作器	WPI	显微注射器 MM3301R	显微注射作
微量移液器拉拔器	萨特仪器	P-1000	用于制备毛细管针
矿物油	Amresco	J217-500ml	用于校准注射量
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒	Thermo Scientific	AM1340	mRNA 体外转录
单色相机	蔡司	AxioCam MRm	鱼胚胎图像记录
质粒小量制备试剂盒	Zymo Research	D4020	制备少量质粒 DNA
塑料培养皿	VWR	25384-088	用于在成像过程中保持鱼或鱼胚胎
RNA 清洁 &Concentrator-5	Zymo Research	R1015	体外转录后 mRNA 清洁
分光光度计	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	用于测量 DNA 和 RNA 浓度
载物台 千	分尺 Am Scope	MR100	显微注射体积校准
热循环仪	Bio-Rad	T100	用于基因克隆的 DNA 扩增
薄壁玻璃毛细管	WPI	TW100F-4	用于制作帽针的玻璃原料
Tol2-exL1 引物	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 消费测定
Tol2-exR 引物	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAG	Tol2 消费测定
TOP10 化学感受态大肠杆菌	Thermo Scientific	C404006	用于基因克隆
过程中的转化甲磺酸三卡因	Sigma-Aldrich	A5040	用于麻醉鱼或鱼胚胎
紫外透射照明器 302nm	UVP	M-20V	DNA 可视化
水浴	Thermo Scientific	2853	用于基因克隆的转化过程