土壤样品多涨价可能分析的 MPLEx 协议

摘要

提出了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的协议, 允许缩短样品准备时间, 并对数量有限的样品进行多涨价可能质谱分析。

摘要

以质谱 (MS) 为基础的综合 metaproteomic、metabolomic 和 lipidomic (多涨价可能) 研究正在改变我们对环境和生物系统中微生物群落的理解和表征能力。这些测量甚至能够增强对复杂土壤微生物群落的分析, 这是迄今为止已知的最复杂的微生物系统。然而, 多涨价可能分析确实有样本准备挑战, 因为每个涨价可能研究通常需要分离提取, 从而大大放大所需的准备时间和样本量。为了解决这一局限性, 通过调整溶剂基方法, 建立了从同一土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质 (MPLEx) 的 3-1 方法。这种 MPLEx 协议已被证明是简单和健壮的许多样本类型, 即使是用于有限数量的复杂土壤样品。MPLEx 方法还大大启用了快速的多涨价可能测量, 以更好地了解每个微生物群落的成员, 同时评估发生在生物和环境扰动上的变化。

引言

评价土壤微生物群落对了解碳循环和气候变化具有重要意义。然而, 最近的研究突出了一些困难, 例如在不同土壤类型的微生物群中缺乏有序的基因组, 以及检测到的许多蛋白质的未知功能。这些挑战的结果是由于土壤是迄今为止已知的最复杂的微生物群落^1,2,3。多涨价可能分析结合了宏基因组、metatranscriptomic、metaproteomic、metabolomic 和 lipidomic 研究的结果, 最近在许多土壤研究中得到了实施, 以更好地了解目前的微生物, 而获取有关由于环境扰动而发生的分子变化的全面信息^1,4,5。多涨价可能研究的一个挑战是, 以质谱 (MS) 为基础的 metaproteomic、metabolomic 和 lipidomic 测量通常要求每个涨价可能的特定提取过程为 MS^兼容6, 7^,8,9

方案

注: 非常潮湿的土壤可以在萃取前冻干, 而不损害萃取效果。湿土壤也可以使用, 但应考虑当添加试剂在特定比率。

注: 建议使用20克的干土重量每萃取, 这必须在两个50毫升管 (最大10克土壤每50毫升管)。抽取可以根据可用样品向上或向下缩放。

注: 干燥土壤样品可以通过3毫米筛筛, 以融汇和去除小的根和岩石。不要筛过潮湿的土壤样品, 因为样品会被卡在屏幕上。

1. 土壤细胞裂解和提取代谢物、蛋白质和脂类 (定时 ~ 1 d)

1. 每20克土壤样品, 重10克入二个单独50毫升管子是甲醇或氯仿兼容。要非常小心的管选择, 因为氯仿将浸出大多数塑料, 污染的样品。尽可能使用玻璃或用聚丙烯或聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的塑料管。
   注意: 在初始称重和均匀化步骤中, 保持土壤在冰上, 尽可能的冷却。
2. 将10毫升氯仿冲洗过的不锈钢和石榴石珠加入每管。在冰上, 添加4毫升的冷超纯水 (见材料表用于净化系统) 到每个管 (一个样本分裂两个管) 和转移的样品在一个冰桶到通风罩。
3. 使用25毫升玻璃血清学吸管, 快速添加20毫升冰冷2:1 氯仿: 甲醇 (v/v)。
   注意: 氯仿: 甲醇有严重的潜在的健康影响: 皮肤刺激, 可能的化学烧伤和对呼吸系统的刺激。它可能会影响肾脏, 肝脏和心....

结果

当 MPLEx 协议被用来从堪萨斯当地草原土壤中提取分子 (软土土壤) 时, 三项分析提供了3376多肽、105脂和102极性代谢物 (所有独特的证明) 的结果。虽然 MPLEx 协议已建立为一般提取脂质和代谢物^{12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,<.......}

讨论

重要的是要注意的是, 并非所有的实验室都有相同的可用设备, 所以某些方法, 例如裂解步骤, 可以适应。在这里, 我们使用涡流和 sonicating, 但使用一个大型的50毫升珠搅拌器将工作。如果冻干机的集热器温度可为-105 摄氏度, 则可以在氮气流下干燥样品。土壤类型也有很大变化, 可以包括沙子、淤泥、粘土、泥炭和沃土 (等等), 它们也可以根据 pH 值、盐度和有机质的丰富程度而变化。这些差异都可能对协议产生影响, 因此在需要时灵活并进行调整很重要。然而, 重要的是, 比率和百分比保持不变。

MPLEx 协议在许多生物和环境系统中的应用, 以及对土壤微生物群落进行多涨价可能分析的能力都有很大的希望。以前对不同系统的 MPLEx 与其他提取协议的比较表明, 高度的肽重叠¹⁰。然而, 一项观察到的限制是, MPLEx 不适用于需要耗尽的血浆蛋白。在这些情况下, 沉淀蛋白没有得到很好的认可, 在 immunodepletion 列的抗体广泛覆盖的血浆蛋白质组。因此, 在这种情况下应使用更多的标准提取方法。MPLex .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	Sigma-Aldrich	650498	储存在 -20°C;C !注意氯仿对健康有急性的潜在影响，皮肤刺激和可能的化学灼伤，刺激呼吸系统，可能影响肾脏、肝脏、心脏。戴上合适的防护眼镜，穿上衣服和手套，在通风橱内工作。
甲醇	Sigma-Aldrich	34860	在 -20°C 下储存;C !注意 甲醇可能引起呼吸道、皮肤和眼睛的刺激，可能损害神经、肾脏和肝脏。戴上合适的防护眼镜，穿上衣服和手套，在通风橱内工作。
来自 Millipore	Milli-Q		净水系统的
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L6026	！注意 SDS 引起急性毒性，易燃。对皮肤、眼睛和气道有刺激性。戴手套和安全眼镜。
土壤蛋白质提取试剂盒	MoBio，NoviPure 土壤蛋白质提取试剂盒，Qiagen	30000-20
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T0699	！注意 TCA 具有腐蚀性、毒性，可能导致皮肤灼伤。戴手套和安全眼镜。
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	储存在 -20°C;C !注意 丙酮可能会刺激呼吸道和皮肤和眼睛。易燃液体和蒸气。戴上安全眼镜、手套和实验服，在通风橱中工作。
尿素	Sigma-Aldrich	208884	！注意 尿素对眼睛和皮肤有刺激性，请使用手套和安全眼镜
碳酸氢铵	Fluka	09830
胰蛋白酶	Promega	V528A	20µg 小瓶
二辛可宁酸蛋白检测试剂盒	Pierce	23227
甲酸铵	Sigma-Aldrich	09735
乙腈	Sigma-Aldrich	34998	！注意 乙腈对皮肤和眼睛有刺激性。高度易燃。戴手套和安全眼镜。在通风橱中工作。
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508	！注意 TFA 在皮肤接触、眼睛接触、摄入和吸入的情况下极为危险。可能产生组织损伤，尤其是眼睛、口腔和呼吸道的粘膜。皮肤接触可能会导致灼伤。戴手套、穿实验服、戴安全眼镜，并在通风橱中工作。
盐酸甲氧基胺	Sigma-Aldrich	226904	！注意 盐酸甲氧基胺类可引起严重灼伤和严重伤害眼睛，皮肤接触可引起过敏。戴上安全眼镜、手套和实验室外套，在通风橱中工作。
吡啶	Sigma-Aldrich	270970	！注意 吡啶可引起皮肤和眼睛刺激，中枢神经系统抑制。蒸气可能会引起闪火。戴上安全眼镜、手套和实验室外套，在通风橱中工作。
含 1% 三甲基氯硅烷的 N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺	Sigma-Aldrich	69478	！注意 MSTFA + 1% TMCS 可引起皮肤腐蚀、严重眼损伤和特定靶器官毒性。易燃液体和蒸气。戴上安全眼镜、手套和实验室外套，在通风橱中工作。
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q 净水系统	Millipore		型号 MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	涡旋精灵 2
探头超声仪	FisherBrand		型号 FB505
冷冻离心机	Eppendorf		型号 5810R
50mL 管水平转头	Eppendorf	A-4-44
50mL 固定角转头	Eppendorf	FA-45-6-30
天平	奥豪斯		V22PWE150IT 型
血清移液器控制器	Eppendorf	12-654-100
10mL， 25mL 玻璃血清移液器	FisherBrand	13-678-27F， 13-678-36D
热混合器带 Thermotop	Eppendorf	5382000015,5308000003
0.9 – 2.0 mm 混合不锈钢珠	NextAdvance	SSB14B
0.15 mm 石榴石珠	MoBio	13122-500
磁力搅拌板	FisherBrand	11-100-16SH
磁力搅拌棒	FisherBrand	14512130
pH 纸条，pH范围 0–14	个 FisherBrand	M95903
15mL、50mL 锥形聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-103 21-108	兼容氯仿
50mL 涡旋附件	MoBio	13000-V1-50
冰桶	FisherBrand	02-591-44
27.25x70mm 玻璃瓶	FisherBrand	03-339-22K
呼吸更简单的板膜	Midwest Scientific	BERM-2000
酒精湿巾	多元化	BPWP-1000
加热器摇床培养箱	Benchmark，Incu-Shaker 迷你
模拟烤肉店管旋转器	SoCal BioMed， LLC	82422001
过滤器辅助样品制备套件	FASP;Expedeon	44250
微孔板检测仪	Biotek，EPOCH-20
摄氏度冰箱	Fisher	13986149-80
摄氏度冰箱	斯特灵超低温	SU78OUE
Q-Exactive 离子阱质谱仪	Thermo Scientific
Agilent 7890A 气相色谱仪与单四极杆联用5975C 质谱仪	Agilent Technologies， Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC 系统	马萨诸塞州
250 mL 培养基瓶	FisherBrand	1395-250
Waters 样品瓶	Waters	186002805
玻璃 MS 样品瓶和插件	MicroSolv	9502S-WCV，9502S-02ND
玻璃HPLC 样品瓶和卡口盖	MicroSolv	9512C-0DCV、9502C-10C-B
HPLC 96 孔板	Agilent	5042-6454
大玻璃样品瓶 27.25x70 mm	FisherBrand	03-339-22K
冻干器	Labconco	7934021
抛光不锈钢平头刮刀	勺子;FisherBrand	14-375-10
Kim 湿巾	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18,250x4.6 毫米，5 &μ;M 配备 4.6x20 mm 保护柱	Waters	186003117,186003064
Agilent 1100 系列 HPLC 系统	Agilent Technologies	G1380-90000
1.7mL 离心管	Sorenson	11700
汉密尔顿玻璃注射器，5mL，50 微米;L 和 250µL	Hamilton	81517， 80975， 81175
巴斯德移液器	FisherBrand	13-678-20A
巴斯德移液器灯泡	Sigma-Aldrich	Z111597
Bath Sonicator	Branson 1800 超声波清洗机
真空离心机	Labconco Centrivap 耐酸浓缩系统
MicroSpin 色谱柱，C18 二氧化硅	The Nest Group	SEM SS18V