用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

摘要

本文介绍了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的实验方案，可缩短样品前处理时间，并实现对样品量有限的样本进行多组学质谱分析。

摘要

基于质谱（MS）的整合宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学（多组学）研究正在改变我们理解和表征环境与生物系统中微生物群落的能力。这些检测甚至能够对复杂的土壤微生物群落进行更深入的分析，而土壤微生物群落是迄今已知最复杂的微生物系统。然而，多组学分析在样品制备方面仍存在挑战，因为通常每种组学研究都需要独立的提取步骤，从而显著增加了制备时间和所需样品量。为解决这一局限性，研究人员通过改进一种基于溶剂的方法，开发出一种“三合一”技术——可从同一样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质（MPLEx）。该MPLEx方案已被证明对多种样品类型均简单且稳健，即使在处理少量复杂土壤样品时也表现良好。MPLEx方法还极大地促进了快速多组学检测的实现，有助于更深入地理解各微生物群落的组成成员，并评估其在生物和环境扰动下发生的变化。

引言

评估土壤微生物群落对于理解碳循环和气候变化具有重要意义。然而，近期研究强调了若干困难，例如多种土壤类型中微生物群落缺乏测序完成的基因组，以及所检测到的许多蛋白质功能尚不明确。这些挑战的根源在于土壤是迄今已知最复杂的微生物群落^1,2,3。近年来，多组学分析——整合宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学研究结果的方法——已被广泛应用于多项土壤研究中，以更深入地了解存在的微生物，并全面获取因环境扰动所引发的分子变化信息^1,4,5。多组学研究面临的一个挑战是，基于质谱（MS）的宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学检测通常需要针对每种组学分别进行特定的提取流程，以确保与质谱兼容^6,7,8,9。这些精确的步骤在样品量有限的情况下，往往难以甚至无法实施。这些困难促使我们探索一种可同时提取代谢物、蛋白质和脂质（....

方案

注意：非常潮湿的土壤可在提取前进行冻干处理，这不会影响提取效果。也可直接使用湿土，但在按特定比例添加试剂时应考虑其含水量。

注意：建议每次提取使用 20 g 干土重量，需将土壤分装至两个 50 mL 离心管中（每管最多加入 10 g 土壤）。可根据样品量的多少相应放大或缩小提取规模。

注意：干燥的土壤样品可通过3 mm筛网进行筛分，以实现均质化并去除细小的根系和石块。请勿筛分湿润的土壤样品，因为样品会堵塞筛网。

1. 土壤细胞裂解及代谢物、蛋白质和脂质的提取（耗时约1天）

1. 每20 g土壤样品，称取10 g分别加入两个可耐受甲醇/氯仿的50 mL离心管中。选择离心管时需格外谨慎，因为氯仿会溶出大多数塑料中的成分，导致样品污染。应尽可能使用玻璃管，或由聚丙烯（polypropylene）或聚四氟乙烯（PTFE）制成的塑料管。
   注意：在初始称重和均质化步骤期间，应将土壤保持在冰上并尽可能低温。
2. 向每个管中加入10 mL经氯仿洗涤的不锈钢珠和石榴石珠。在冰上，加入4 mL预冷的超纯水（见 材料表 向每管（一个样品分装至两管）加入纯化系统所需试剂，并将样品置于冰桶中，转移至通风橱内。
3. 使用 25 mL 玻璃刻度吸管，迅速加入 20 mL 冰冷的 2:1 氯仿:甲醇（....

结果

当使用 MPLEx 方案从美国堪萨斯州本土草原土壤（一种软土，Mollisol）中提取分子时，三次重复分析共鉴定出 3376 种肽段、105 种脂质和 102 种极性代谢物（均为唯一性鉴定结果）。尽管 MPLEx 方案已被广泛用于脂质和代谢物的通用提取^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}

讨论

需要注意，并非所有实验室都具备相同的设备，因此某些步骤（例如裂解步骤）可以进行适当调整。本文中我们采用涡旋振荡和超声处理，但使用大型50 mL珠磨机同样可行。如果无法获得冷凝器温度可达到-105 °C的冷冻干燥机，则可使用氮气流对样品进行干燥。此外，土壤类型差异很大，可能包括沙土、粉土、黏土、泥炭、壤土（etc.），并且在pH值、盐度和有机质含量方面也可能有所不同。这些差异中的每一种都可能对实验方案产生影响，因此在操作中保持灵活性并根据需要进行调整非常重要。然而，必须严格保持各试剂的比例和百分比不变。

MPLEx 方案在多种生物和环境系统中展现出广阔的应用前景，能够实现对土壤微生物群落的多组学分析。此前将 MPLEx 与其他适用于不同系统的提取方案进行比较的研究表明，其在肽段覆盖度方面具有很高的重叠性¹⁰。然而，一个已观察到的局限性是，MPLEx 不适用于需要去除的血液血浆蛋白。在这些情况下，沉淀的蛋白质无法被免疫耗竭柱中的抗体有效识别，而此类抗体是实现血浆蛋白质组广泛覆盖所必需的。因此，在此类情况下应采用更为标准的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	Sigma-Aldrich	650498	储存于 -20°C！警告：氯仿具有急性健康危害，可引起皮肤刺激及可能的化学灼伤，对呼吸系统有刺激作用，可能影响肾脏、肝脏和心脏。佩戴合适的防护眼镜、防护服和手套，并在通风橱中操作。
甲醇	Sigma-Aldrich	34860	储存于 -20°C！警告：甲醇可能引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激，可能损害神经、肾脏和肝脏。佩戴合适的防护眼镜、防护服和手套，并在通风橱中操作。
Millipore纯水	Milli-Q		水纯化系统。
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L6026	！警告：SDS具有急性毒性且易燃。对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激性。佩戴手套和安全眼镜。
土壤蛋白提取试剂盒	MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen	30000-20
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T2694
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T0699	！警告：TCA具有腐蚀性、毒性，可能引起皮肤灼伤。佩戴手套和安全眼镜。
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	储存于 -20°C！警告：丙酮可能引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激。易燃液体和蒸气。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。
尿素	Sigma-Aldrich	208884	！警告：尿素对眼睛和皮肤有刺激性，使用时应佩戴手套和安全眼镜
碳酸氢铵	Fluka	09830
胰蛋白酶	Promega	V528A	20µg 小瓶
双辛酸蛋白测定试剂盒	Pierce	23227
甲酸铵	Sigma-Aldrich	09735
乙腈	Sigma-Aldrich	34998	！警告：乙腈对皮肤和眼睛有刺激性。高度易燃。佩戴手套和安全眼镜。在通风橱中操作。
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508	！警告：TFA在皮肤接触、眼睛接触、摄入或吸入时具有极高危险性。可能造成组织损伤，尤其对眼睛、口腔和呼吸道黏膜。皮肤接触可能导致灼伤。佩戴手套、实验服、安全眼镜，并在通风橱中操作。
盐酸甲氧胺	Sigma-Aldrich	226904	！警告：盐酸甲氧胺可引起严重灼伤和严重眼部损伤，皮肤接触可能引起致敏反应。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。
吡啶	Sigma-Aldrich	270970	！警告：吡啶可引起皮肤和眼睛刺激，导致中枢神经系统抑制。蒸气可能引发闪燃。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。
N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅烷	Sigma-Aldrich	69478	！警告：MSTFA + 1% TMCS可引起皮肤腐蚀、严重眼部损伤和特定靶器官毒性。易燃液体和蒸气。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q 水纯化系统	Millipore		型号 MPGP04001
涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
探头式超声破碎仪	FisherBrand		型号 FB505
冷冻离心机	Eppendorf		型号 5810R
50 mL 摆桶转子	Eppendorf	A-4-44
50 mL 固定角转子	Eppendorf	FA-45-6-30
天平	OHAUS		型号 V22PWE150IT
移液管控制器（血清学移液管）	Eppendorf	12-654-100
10 mL、25 mL 玻璃血清学移液管	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
带 Thermotop 的恒温混匀仪	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm 不锈钢混合珠	NextAdvance	SSB14B
0.15 mm 石榴石珠	MoBio	13122-500
磁力搅拌器	FisherBrand	11-100-16SH
磁力搅拌子	FisherBrand	14512130
pH 试纸条，pH 范围 0–14	FisherBrand	M95903
15 mL、50 mL 锥形聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-103 21-108	耐氯仿
50 mL 涡旋附件	MoBio	13000-V1-50
冰桶	FisherBrand	02-591-44
27.25x70 mm 玻璃小瓶	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Easier 板膜	Midwest Scientific	BERM-2000
酒精擦拭巾	Diversified Biotech	BPWP-1000
加热振荡培养箱	Benchmark, Incu-Shaker Mini
模拟旋转管式混匀仪	SoCal BioMed, LLC	82422001
滤膜辅助样品制备试剂盒	FASP; Expedeon	44250
酶标仪	Biotek, EPOCH
-20 摄氏度冰箱	Fisher	13986149
-80 摄氏度冰箱	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive 离子阱质谱仪	Thermo Scientific
Agilent 7890A 气相色谱仪，配备单四极杆 5975C 质谱仪	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM 超高效液相色谱系统	Millford, MA
250 mL 培养瓶	FisherBrand	1395-250
Waters 小瓶	Waters	186002805
玻璃质谱样品瓶及内插管	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
玻璃高效液相色谱瓶及压盖	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
高效液相色谱 96 孔板	Agilent	5042-6454
大玻璃瓶 27.25x70 mm	FisherBrand	03-339-22K
冷冻干燥机	Labconco	7934021
抛光不锈钢平头刮勺	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Kim 擦拭纸	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM，配 4.6x20 mm 保护柱	Waters	186003117, 186003064
Agilent 1100 系列高效液相色谱系统	Agilent Technologies	G1380-90000
1.7 mL 离心管	Sorenson	11700
Hamilton 玻璃注射器，5 mL、50µL 和 250µL	Hamilton	81517, 80975, 81175
巴斯德移液管	FisherBrand	13-678-20A
巴斯德移液管橡胶吸头	Sigma-Aldrich	Z111597
水浴超声仪	Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
真空离心浓缩仪	Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
微型离心柱，C18 硅胶	The Nest Group	SEM SS18V